20個小粒種咖啡種質氮吸收效率差異分析

董云萍 閆林 黃麗芳 林興軍 孫燕 王曉陽 龍宇宙

摘? 要：為明確不同基因型小粒種咖啡的氮素吸收特性，進一步為遺傳改良咖啡氮營養性狀提供參考，本研究對同一氮素供應水平下20個小粒種咖啡氮素吸收效率的生理、形態機制進行研究。結果表明：大部分小粒種咖啡種質間葉綠素含量、硝酸還原酶活性（NRA）、根氮、莖氮、葉氮含量差異不顯著，且葉綠素含量及NRA與葉氮、總氮累積量和氮吸收效率間相關性不顯著;根長、根體積、根表面積均與根氮累積量、總氮累積量、氮吸收效率呈顯著正相關;氮素在植株各器官的分配比例依次為：根氮>葉氮>莖氮;聚類分析表明，‘M13氮吸收效率最高，為84.43%，最低為‘CATUAI，僅為32.12%，其余種質為58.36%～43.08%。

關鍵詞：小粒種咖啡;氮素;吸收效率中圖分類號：S571.2? ? ? 文獻標識碼：A

Analysis of Nitrogen Uptake of 20 Coffea arabica L. Accesions

DONG Yunping1，2， YAN Lin1，2，3， HUANG Lifang1，2，3， LIN Xingjun1，2， SUN Yan1，2， WANG Xiaoyang1，2，3， LONG Yuzhou1，2*

1. Spice and Beverage Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Wanning， Hainan 571533， China; 2. Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulation for Tropical Spice and Beverage Crops， Wanning， Hainan 571533， China; 3. Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Wanning， Hainan 571533， China

Abstract： A pot experiment with the same nitrogen level was carried out to analyze the root morphological and physiological properties which affecting the nitrogen uptake efficiency of 20 arabica coffee genotypes to understand the characteristic of nitrogen uptake and to provide a material basis for the selective breeding. There were no significant difference in chlorophyll content， nitrate reductase activity （NRA）， nitrogen content in root （NCR）， nitrogen content in stem （NCS）， nitrogen content in leaf （NCL） among most genotypes. There existed rather weak correlation among chlorophyll content， NRA， N accumulation in leaf （NAL）， N accumulation in total （NAT） and N uptake rate （NUR）. Root length， root volume and root surface area were positively correlated with root nitrogen accumulation， NAT and NUR. The nitrogen distribution order was NCR>NCL>NCS. Cluster analysis demonstrated that the highest NUR was ‘M13 （84.43%）， the lowest was ‘CATUAI （32.12%）， and the rest was 58.36%-43.08%.

Keywords： Coffea arabica L.; nitrogen; uptake rate

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.03.001

氮是作物不可缺少的營養元素之一，作物各個器官的形成和發育均需要大量的氮素。咖啡結果量大，對氮、磷、鉀的需要量較大。蔡志全等[1]研究表明，氮缺乏對小粒種咖啡生長、光合特性和產量的影響最大，其次為鉀，而磷的影響相對較小。據國外資料顯示，年產1 kg咖啡干豆需純氮0.1 kg。印度中央咖啡研究所從大量的肥料試驗推斷，每年咖啡氮素的需要量是90～160 kg/hm2。Sala manca-Jimenez等[2]開展施肥對營養期咖啡氮利用效率的影響研究，雖然施氮在4個月后提供了約20%～29%的植株氮，但來自于肥料氮的利用率僅5%。氮肥的施用對咖啡產量和品質的提高均起到了巨大的作用，有力地推動了產業的發展，但同時N肥的過量施用使得其利用率明顯下降，造成了化肥資源和經濟的損失，也導致水體和大氣的污染以及產品品質的下降。

作物無論在不同種屬之間還是同一種作物的不同品種之間均存在氮效率的差異。其差異主要表現在吸收硝態氮和銨態氮的能力、硝酸還原酶水平、體內無機氮儲存庫大小、氮素在體內的再利用等方面[3]。根據作物基因型的差異選育氮高效品種，減少氮肥用量，提高氮肥的利用效率已在玉米[4]、小麥[5]、水稻[6]、油菜[7]等作物上進行了深入的研究。

國外學者利用15N標記的方法對咖啡植株各部分對氮的吸收利用進行研究，從而評估氮肥農學利用效率，但由于其方法取樣手段、檢測水平的限制，研究結果存在較大誤差[8]。而對咖啡種質資源進行氮效率篩選研究未見報道。本研究通過盆栽試驗對咖啡種質做了篩選，以期發現咖啡氮利用高效和低效種質，探究不同種質氮效率差異的農學機制和生理學機制，為發掘優良的咖啡種質資源，進一步為遺傳改良咖啡氮營養性狀提供依據。

1? 材料與方法

1.1? 材料

2013年1月從農業農村部瑞麗咖啡種質資源圃和中國熱帶農業科學院香料飲料研究所咖啡種質圃采集20個小粒種咖啡種質成熟鮮果，種質名稱及來源見表1。

1.2? 方法

1.2.1? 試驗設計? 各種質咖啡鮮果經脫皮、脫膠、涼干后沙床催芽，待子葉平展時移植到直徑10 cm、高12 cm營養袋培育，5對真葉時轉入直徑25 cm、高30 cm塑料花盆培育，培育基質為中細河沙，每個種質20盆。按改良霍格蘭方法配制營養液，濃度為：Ca（NO3）2·4H2O 4.0 mmol/L、KNO3 5.0 mmol/L、NH4NO3 1.0 mmol/L、KH2PO4 1.0 mmol/L、MgCl2·6H2O 2.5 mmol/L、FeSO4·7H2O 20.0 μmol/L。6月齡前每次每株施1/3濃度配制營養液300 mL，共施3次;6～15月齡每次每株施配制營養液500 mL，1.5個月施1次，共施6次。

1.2.2? 測定方法? （1）葉綠素含量測定苗齡。15個月時，選擇每個種質生長一致的苗木5株掛牌，每1植株選取從頂芽往下數第3對成熟葉片，采摘其中1片帶回實驗室用純水沖洗葉片，吸水紙擦干葉片水分后，用剪刀剪取不帶主脈的葉片0.2000 g（精確到0.0001 g），新鮮葉片切碎后放入25 mL容量瓶中，在容量瓶中加入純丙酮∶無水乙醇∶蒸餾水（4.5∶4.5∶1.0）的混合液15 mL，并仔細將黏附在瓶壁上的葉片洗到混合提取液中，定容到刻度后，在25～30 ℃恒溫箱中浸提過夜，期間搖動1～2次，次日取出，觀察葉片組織如果完全變白，則表示葉綠素已經浸提干凈，然后在波長為645 nm和663 nm下用分光光度計分別比色測定其光密度值。

（2）硝酸還原酶活性測定。用活體法，選擇掛牌的每個種質植株選取從頂芽往下數第3對成熟葉片，帶回實驗室用純水沖洗葉片，吸水紙擦干葉片水分后，稱0.3 g葉樣，將葉片剪成0.2～0.3 cm小方塊，放入裝有混合液（4 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖液+5 mL 0.2 mol/L硝酸鉀溶液）的注射器中，對照先加1 mL 30%三氯乙酸，再加混合液，在黑暗條件下反復抽氣直到放氣后葉片變軟并沉入液體，30 ℃暗條件下保溫30 min，取出后立即加入1 mL 30%三氯乙酸終止酶反應。吸取上清液1 mL于另一試管中，加入2 mL 1%對氨基苯磺酸和2 mL 0.2% α-萘胺，室溫顯色30 min后測定520 nm波長下的光密度值。

（3）根系形態及生物量的測定。苗齡15個月時從每個種質中選生長一致的苗木3株，脫盆后，將根部的泥沙用自來水沖洗干凈，帶回實驗室，每株分成葉片、莖干、根共3部分，用吸水紙吸干根部水分后，分別稱量各部分鮮重。將根系分成側根和主根2部分，放置于有水的根盒中，讓側根舒展不重疊，用根系掃描儀掃描，Win RHIZO 2013分析主根長、側根長、主根直徑、側根直徑、根體積、根表面積，測定完成后將全株各部分放置于烘箱，105 ℃殺青30 min，75 ℃烘干至恒重，分別稱其干重。

（4）氮素含量的測定。取烘干的每個種質葉片、莖干、根各3 g，用植物樣品粉碎機磨碎，杜馬斯定氮儀NDA701測定。

1.2.3? 計算方法? 葉綠素a含量（mg/g）=[（12.7? OD663?2.59?OD645）?V]/（FW×1000）

葉綠素b含量（mg/g）=[（22.9?OD645?4.67? OD663）?V]/（FW?1000）

總葉綠素含量=葉綠素a含量+葉綠素b含量

式中：OD663表示樣液在波長663 nm下的光密度值，OD645表示樣液在波長645 nm下的光密度值，V為定容體積，FW為稱取的葉樣鮮重。

氮素累積量 = 植株各部分干重 × 各部分氮素含量

氮素吸收效率 = 植株總氮累積量/生長期供氮量?100%

1.3? 數據處理

采用 Excel 2010軟件整理數據，采用SPSS 19.0軟件中的ANOVA進行方法分析，采用LSD法進行多重比較，采用系統聚類法進行聚類分析，采用Pearson相關法進行相關性分析。

2? 結果與分析

2.1? 不同小粒種咖啡種質葉綠素含量、硝酸還原酶活性及氮含量差異分析

由表2可見，‘CATURRA和‘CA ZHONG I葉綠素含量顯著高于‘M14、‘RUME SUDAN、‘CAT IMOR P1等12個種質;‘M2、‘鐵畢卡、‘DTARI 028等7個種質葉綠素含量較低，為3.56～3.09 mg/g，顯著低于綠素含量為4.70～ 4.21 mg/g的‘CATURRA和‘CA ZHONG I、‘CATUAI等8個種質，其余種質間葉綠素含量差異不顯著，葉綠素含量最低的‘德熱296葉片為紫色。

‘T8867、‘M10葉片硝酸還原酶活性顯著高于‘CATURRA、‘鐵比卡、‘波幫等14個種質，‘熱引2、‘CA ZHONG Ⅲ、‘DTARI 028等5個種質葉片硝酸還原酶活性較低，為14.61～9.34 mg/（g·h），顯著低于硝酸還原酶活性為32.81～21.36 mg/（g·h）的‘T8867、‘M10、‘CIFC 7963等10個種質，其余種質間差異不顯著。

通過分析可知，咖啡種質葉綠素含量高，其葉片硝酸還原酶活性也高，但‘RUME SUDAN、‘CA ZHONG III、‘M10、‘巴矮、‘波幫、‘德熱296、‘熱引2和‘鐵畢卡例外。

‘CA ZHONG II根氮含量顯著高于其余種質，‘M14根氮含量最低，與‘巴矮差異不顯著，與其余種質差異顯著。‘CA ZHONG IIII莖氮含量顯著高與其余種質，但其余種質間差異不顯著。‘CA ZHONG II葉氮含量顯著高于‘M13，且這2個種質葉氮含量顯著高于其余種質，其余種質間葉氮含量差異不顯著。可見，測定的大部分小粒種咖啡種質間根氮、莖氮、葉氮含量差異不大。從氮在植株各器官的分配來看，根氮含量較高，其次為葉氮，最低為莖氮。

2.2? 不同小粒種咖啡種質根系生長參數分析

由表3可見，‘M13側根長顯著高于‘CATI M- OR P1、‘CATURRA、‘CATUAI等8個種質，與‘T8867、‘S288、‘熱引2等11個種質間差異不顯著。‘M13根體積除顯著于‘CATUAI外，與其余種質間差異不顯著。

‘M13根表面積顯著大于‘波邦、‘RUME SUDAN、‘CATUAI等4個種質，與其余種質間差異不顯著。多重比較結果表明，大部分小粒種咖啡種質間側根長、根體積、根表面積差異不顯著。

2.3? 不同小粒種咖啡種質氮累積量和氮吸收效率差異分析

由表4可見，‘M13根氮累積量最高，‘M13與‘CATIMOR P1、‘CIFC 7963、‘CA ZHONG I等8個種質差異不顯著，而且‘CATIMOR P1、‘CIFC 7963、‘巴矮等14個種質間差異不顯著;莖氮累積量最高為‘M13，‘M13與‘M14、‘RUME SUDAN、‘M2等5個種質差異不顯著，‘RUME SUDAN與‘鐵畢卡、‘CA ZHONG I、‘M10等11個種質間差異不顯著;‘M13葉氮累積量顯著高于‘CA ZHONG II，且這2個種質葉氮累積量顯著高于其余種質，剩余大部分種質間差異不顯著。綜合表2、表3、表4可知，在大部分小粒種咖啡種質間根氮、莖氮、葉氮含量差異不大的情況下，各種質氮累積量大小主要取決于植株各部分干物質累積量，雖然‘CA ZHONG II根氮、莖氮含量較高，但由于其根和莖干物質累積量小，因而其相應部位氮累積量小。‘M13總氮累積量、氮吸收效率顯著高于其余種質，其余大部分種質間差異不顯著。

對20個小粒種咖啡種質氮吸收效率進行聚類分析，分為3類（圖1）。氮吸收效率最高的種質為‘M13，氮吸收效率達84.43%，最低為‘CA T UAI，僅為32.12%，其余種質氮吸收效率為58.36%～ 43.08%。

2.4? 不同小粒種咖啡種質各參數間的相關性分析

不同小粒種咖啡種質各參數間相關性分析結果見表5，葉片硝酸還原酶活性與葉氮累積量、總氮累積量、氮吸收效率間相關性不顯著;同樣，葉綠素含量與葉氮累積量、總氮累積量、氮吸收效率相關性不顯著;根長、根體積、根表面積均與根氮累積量、總氮累積量、氮吸收效率呈顯著正相關。

3? 討論

植物吸收的主要無機氮形式是銨（NH4+）和硝酸鹽（NO3-），硝酸還原酶是植物氮代謝的關鍵酶。研究表明，作物品種的氮素同化能力與各生育期硝酸還原酶活性表現為不同程度的正相關[9]。朱德群等[10]、鄭元明[11]研究表明，小麥苗期氮積累總量和硝酸還原酶活性呈顯著正相關。在施氮條件下，油菜氮高效品種功能葉的葉綠素含量和硝酸還原酶活性較強[12]。張旭等[13]研究表明，小麥氮高效型品種開花期其葉的葉綠素和氮含量、凈光合速率、硝酸還原酶和谷氨酰胺合成酶活性較高。然而Eicheloerger等[14]報道，以NRA為指標對玉米進行選擇到8代時，高NRA品系的NRA己達到低NRA的4倍，然而兩者的產量都比原親本低，故NRA在實際育種中的價值難以確定。本研究在施氮量相同的情況下，對20個小粒種咖啡種質葉片硝酸還原酶活性分析表明，大部分咖啡種質間NRA差異不顯著，且NRA與葉氮累積量、總氮累積量和氮吸收效率間相關性不顯著。NRA是否可作為篩選咖啡氮高效品種的指標有待進一步的研究。莫良玉等[15]研究表明，由谷氨酰胺合成酶（Gs）和谷氨酸合成酶（GOGAT）催化的氨（NH4+）同化為有機含氮化合物的同化途徑，即Gs-GOGAT途徑才是植物氨同化更為普遍和重要的方式。GS被認為與作物的氮效率[16]和耐低氮性[17]有關。Tiago等[18]研究表明，在缺氮的條件下，NH4+是小粒種咖啡根首選的無機氮源。因此，有必要進一步開展不同咖啡種質Gs活性及其與咖啡氮素效率的相關性研究。

氮素是葉綠素的主要成分，施氮一般能促進植物葉片葉綠素的合成，增強光合作用。葉片含氮量與葉綠素含量有著較強的指數函數關系，在一定條件下，可根據作物葉綠素含量確定葉片含氮量[19]。劉代平等[20]研究認為，在施氮條件下油菜功能葉葉綠素含量與氮效率密切相關，但在不施氮條件下，油菜功能葉葉綠素含量對氮效率影響較小。本研究結果，葉綠素含量與葉片氮含量間沒有對應關系，葉綠素含量較高的種質如‘CA T U RRA、‘CA ZHONG I、‘CATUAI、‘T8867，其葉片氮含量并不高，葉綠素含量與葉氮累積量、總氮累積量、氮吸收效率相關性不顯著。這可能與大部分小粒種咖啡品種間葉綠素含量差異不大有關，另一方面，小粒種咖啡品種葉綠素含量受光照強度、水分等因素的影響更大。

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