基于近紅外光譜技術快速檢測青金桔果粉中微生物菌數

曾斯杰，馬金爽，王 玥，劉彥弟，尹 星，韓長日，楊定國，劉 紅*

（1.海南師范大學 化學與化工學院，?？谑袩釒厣幨惩粗参镅芯颗c開發重點實驗室，海南 ?？?571158；2.海南科技職業大學，藥食同源植物資源海南省重點實驗室，海南 ?？?571126；3.廣西大學 輕工與食品工程學院，廣西 南寧 530004）

青金桔，又名青桔、山桔、綠桔，屬蕓香科水果，果汁氣味芳香、獨特。青金桔富含維生素C、維生素A、維生素P和芳香油、類胡蘿卜素等多種營養物質，對眼疾、咳嗽、哮喘、高血壓、防止動脈硬化等疾病有一定保健作用[1-3]。青金桔果實經過清洗、榨汁、噴霧干燥、包裝等工序制得青金桔果粉。果粉在儲存過程中，人為改變高溫高濕環境會促進微生物增殖。果粉中細菌或霉菌總數的快速檢測，成為近幾年研究的熱點。

傳統微生物總數的檢測方法主要是微菌落技術法、全平器計數法、阻抗法、紙片法、平板計數法等[4-6]，其中平板計數法相對于其他方法，在精確度、敏感性、檢測速度等方面都有了較大的提高，但仍存在操作過程繁瑣，成本昂貴，易受溫度、濕度、酸堿度等影響，而且檢測周期太長，難以進行大批量檢測。微生物檢測只能通過抽檢來進行，很難保證食品的安全性[7]。因此，尋找一種先進的快速檢測技術來實現微生物總數檢測勢在必行。

近紅外光譜技術是近年來快速發展起來的一種新的分析手段[8]，在食品的營養成分和微生物檢測、摻假鑒定等方面應用前景廣闊。近紅外光譜技術具有快速、無損、無需預處理的特點，可用于乳酸菌、癌細胞、致病菌的檢測，大大優于傳統的微生物檢測[9-12]。GHANI利用近紅外光譜技術對HeLa和DU145細胞進行特征鑒別和含量測定[13]，FERNáNDEZ 報道了近紅外光譜檢測生物膜表面金黃色葡萄球菌[14]，Treguier 利用近紅外光譜從牛奶的微生物鑒別大腸桿菌和乳酸菌[15]?？梢娊t外漫反射光譜可用于食品中微生物的定量分析。

青金桔果粉在一定的濕度下，一定培養溫度和時間適合微生物的生長。在27 ℃下適合酵母菌和霉菌、35 ℃有利于培養大腸桿菌等微生物的生長，如實驗培養1～7 d，細菌總數明顯增加。通過掃描不同溫度下保存1～7 d的青金桔果粉的近紅外光譜，獲得果粉中大腸桿菌、酵母菌和霉菌等微生物含氫基團的特征信息，結合與樣品微生物總數的測定值，利用偏最小二乘法建立預測模型以實現對青金桔粉菌落總數的快速檢測[16-19]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青金桔原粉，海南南派實業有限公司;酵母浸膏，國藥集團化學試劑有限公司；細菌瓊脂粉，北京陸橋技術有限責任公司；胰蛋白胨，北京陸橋技術有限責任公司；氯化鈉，國藥集團化學試劑有限公司；葡萄糖，國藥集團化學試劑有限公司。

SUP-NIR-1520近紅外光譜分析儀，江蘇潤安光電箱公司；DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥器，上海申賢恒溫設備廠；MLS-3751L高溫滅菌器，日本Panasonic。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

準確稱取36 g青金桔原粉于滅菌燒杯中，加入4 mL超純水，混勻后均勻的鋪在直徑為9 cm的無菌培養皿中。本實驗共設置三組不同溫度（0、27、35 ℃），培養1～7 d，每組8個樣品（20 ℃樣品做參考對照），每天取1個樣品，共25個青金桔粉測試樣品。

1.2.2 樣品近紅外信息的采集

為保證實驗數據不受外界空氣和其他條件影響，每天固定時間于三種溫度下分別取一個樣品進行近紅外光譜掃描。波長范圍為900～1700 nm，掃描次數為5次，儀器分辨率為8 cm-1，采樣間隔為3.856 cm-1。運用近紅外光譜分析儀分別對樣品進行掃描，保存光譜數據。

1.2.3 樣品菌落總數的測定

對采集近紅外光譜圖像信息后的樣品進行菌落總數的測定。取出樣品0.25 g，用超純水溶解稀釋至10 mL。參考GB 4789.2-2010中的10倍稀釋法對樣品依次進行稀釋。將稀釋后的樣品置于培養皿中，并分別倒入霉菌、酵母菌、大腸桿菌的培養液，30 ℃搖床中培養6～8 d，通過平板劃線法測出它們的總數。

1.2.4 模型的建立與驗證

為保證實驗結果的準確性，將每個樣品掃描3次的光譜數據取平均值，分別與不同微生物的菌落總數相對應，并分成校正集（2/3）和預測集（1/3）。采用The Unscrambler 軟件應用偏最小二乘法將測定值和光譜數據進行建?；貧w，建立青金桔粉的霉菌、酵母菌、大腸桿菌總數的預測模型。采用校正決定系數R2c 校正驗證誤差（RMSEC）以及交互驗證決定系數（R2cv）、交互驗證誤差（RMSEC）作為評價指標判定定標模型的可行性，然后再用預測集進行驗證，評價指標為預測標準偏差（RMSEP）、預測決定系數（R2p）。一般情況下RMSEC、RMSECV越小，R2c、R2cv、R2p越接近1，定標模型的預測能力越好，反之越差[20]。

2 結果與討論

2.1 青金桔粉的近紅外光譜分析

青金桔粉按照1.2.1 保存7 d，每天取樣，掃描樣品的近紅外光譜，1～7 d 樣品透射率在全波長（900～1700 nm）范圍的變化關系如圖1A所示。樣品的透射率受溫度影響較明顯，其中原始溫度（20 ℃）的反射率最小，0 ℃次之，35 ℃最大。近紅外光譜顯示葡萄糖在1681 nm處有吸收峰，而青金桔粉H2O含氫官能團吸收波長為1460 nm，波長越來越小，即這些分子含氫官能團振動所需要的能量依次增大[21]。

2.2 青金桔粉近紅外光譜的主成份分析

將上述近紅外光譜進行主成分分析，結果如圖1B所示。貯藏溫度對光譜數據的影響較大，0 ℃處理的青金桔粉在圖中左側，PC2 在67.9%～98.7%范圍；27 ℃處理的青金桔粉在圖的中部，PC2 在48.5%～57.9%范圍，主要含有大量的霉菌和酵母菌；35 ℃處理的青金桔粉位于圖中右側，PC2在29.0%～48.5%范圍，含有一定量的大腸桿菌。常溫存放的青金桔粉（4號樣品）PC2大于1，說明溫度的變化引起青金桔光譜的反射率增大。

圖1青金桔粉的近紅外光譜和主成份分析Figure 1 Near-infrared spectra of green kumquat powder and principal component analysis

2.3 不同波長選擇對青金桔粉各菌種建模和預測的影響

通過PLS法對青金桔粉各菌屬在900～1700 nm和1300～1700 nm兩個波段內的光譜數據和微生物總數進行建模分析，得出的青金桔粉微生物總數的預測模型，如表1所示。在波長900～1700 nm范圍內，霉菌和酵母菌模型的校正、交叉驗證和預測決定系數R2c、R2cv 和R2p 分別為0.9861、0.9839、0.9823 和0.8794、0.6506、0.8264，這說明霉菌和酵母菌在近紅外光譜圖的特征峰相對均勻的分布在900～1700 nm范圍。而大腸桿菌模型的校正、交叉驗證和預測決定系數在1300～1700 nm范圍內，R2c、R2cv和R2p為0.9610、0.9570和0.9787，由此可以分析得到，運用近紅外光譜檢測大腸桿菌時，選擇波長1300～1700 nm 能在減小工作量的同時，提高數據的穩定性。

表1 不同波長對各菌建模和預測的影響Table 1 Effects of different wavelengths on the modeling and prediction of various bacteria

2.4 不同光譜預處理方法對青金桔粉各菌種建模和預測的影響

對900～1700 nm范圍內的霉菌和酵母菌，1300～1700 nm范圍內的大腸桿菌的光譜數據分別使用平滑（S-G）、歸一化和標準正態變化三種不同的預處理方式進行處理，通過PLS法建模并預測，得到的結果如表2所示。原始光譜的建模和預測效果整體更為穩定，而其他預處理方式能夠得到更加穩定的建模數據，預測模型效果則不理想。這可能跟樣品儲藏時間過長，微生物生長的穩定態被破壞，在通過對光譜數據進行預處理后使預測模型波動太大導致。

表2 不同光譜預測方式對各菌建模和預測的影響Table 2 Effects of different spectral prediction methods on the modeling and prediction of various bacteria

2.5 微生物總數建模分析

采集不同溫度、時間的霉菌、酵母菌和大腸桿菌中的菌落總數，每種菌種共25個測定值。從25組數據中隨機選擇16組作為校正集，用于模型建立；其余9組作為驗證集，用于模型預測。利用The Unscrambler軟件中的PLS將霉菌、酵母菌、大腸桿菌的光譜數據和微生物總數相關聯，建立預測青金桔粉中霉菌、酵母菌、大腸桿菌總數的近紅外模型（圖2）。

圖2 基于近紅外光譜數據的霉菌總數、酵母菌總數和大腸桿菌總數PLS建模和預測結果Figure 2 PLS calibration and prediction results for the total mold counts (A1，A2)，the total yeast counts（B1，B2)and the total E.coli counts(C1，C2)based on near-infrared spectra

從圖2可知，霉菌總數的近紅外光譜數據模型的校正、交叉驗證和預測的相關系數、和均大于0.98，均方根誤差RMSEC、RMSECV和RMSEP均小于2.70（lg CFU/g），說明霉菌總數預測模型的擬合程度良好，真實值與預測結果具有一定相關性。酵母菌總數的近紅外光譜數據模型的校正、交叉驗證、預測的相關系數、、均大于0.65，均方根誤差RMSEC、RMSECV和RMSEP均小于6.20（lg CFU/g），說明模型的擬合程度中等。大腸桿菌總數的近紅外光譜數據模型的校正、交叉驗證和預測的相關系數、、均大于0.93，均方根誤差RMSEC、RMSECV和RMSEP均小于1.70（lg CFU/g），說明模型的擬合程度較好，數據預測較為準確。上述結果表明，近紅外光譜可用大腸桿菌和霉菌總數測定，預測效果較好，而預測酵母菌總數模型可行，可能與酵母菌難以計數有關。

3 結論

在運用傳統的平板計數法測定了在不同溫度、時間下處理的青金桔粉中霉菌、酵母菌、大腸桿菌的菌落總數基礎上，結合青金桔粉樣品的近紅外光譜數據，運用偏最小二乘法建立菌落總數的預測模型，青金桔粉中霉菌、大腸桿菌近紅外光譜預測模型的相關系數均大于0.9，酵母菌的校正和預測模型的相關系數、均大于0.8，且它們的均方根誤差RMSE都較小，從實驗結果來看，所建立的模型可有效預測青金桔粉中的霉菌、大腸桿菌總數。