血小板內活性氧在血小板活化中作用機制及其靶向治療的應用進展

陳錦遠 李春霖 王秋根 鄧國英

血小板是血液中的重要成分, 在止血、炎性反應及血栓形成以及器官移植排斥等生理與病理反應中具有重要作用。血管出現損傷時,生理性血小板活化能迅速形成血栓封閉傷口實現止血。病理性血小板異?；罨瘎t會誘導閉塞性血栓的形成,增加人們罹患缺血性疾病的風險。

生理性止血過程中血小板需要經歷黏附、活化、聚集的過程。血管受損時，膠原蛋白和von illebrand因子(von willebrand factor, VWF)暴露，血小板通過其表面的GPⅠb-IX-V受體和GPVI受體分別與VWF和膠原蛋白結合，迅速活化并牢固粘附于內皮下基質[1-2]?；罨盘枌е卵“寮毎羌芨淖儾⒃谀z原表面鋪展開，血小板改變形態同時釋放α顆粒、致密顆粒以及溶酶體的內容物[3]。血小板活化涉及許多血小板激動劑與其配體的結合，如腺苷二磷酸(adenosine diphosphate, ADP)和血栓素A2(thromboxane A2, TXA2)，分別與P2Y受體和血栓素受體(thromboxane receptor, TP)結合，以加強αIIbβ3依賴性血小板聚集[4]。同時受損血管內皮中與TXA2拮抗的PGI2生成減少，也有利于血小板的聚集。血小板活化時，整合素αIIbβ3從低親和狀態活化至高親和狀態，其配體包括纖維蛋白原，VWF及纖連蛋白等。血小板之間通過整合素αIIbβ3共同結合纖維蛋白原等配體從而聚集成團，并與白細胞相互作用共同形成血栓堵塞傷口以保持血管壁完整性。

雖然這些相互作用對于血小板活化極為重要，但是同時也與動脈粥樣硬化、動脈高血壓和血栓形成相關[5-6]。研究發現,GPVI和GPIb-IX-V在異常病理剪切應力和血流改變(例如在狹窄動脈內)中血小板血栓形成的起始階段起關鍵作用，并且在腦血管性中風實驗模型中起始血栓形成中起重要作用[7]。在生物進化過程中，血小板的出現是為了控制出血延續生命，然而目前血栓性或心血管疾病卻是導致全球范圍人類疾病死亡的主要原因，且現有治療方案存在局限性。血小板活化信號在止血和血栓形成中的作用中起關鍵作用，一直以來都是學界深入研究的主題，希望能從中找到治療血栓性或心血管疾病的突破口。

活性氧(reactive oxygen species, ROS)是機體有氧呼吸的正常代謝產物，包括超氧陰離子(O2-)，過氧化氫(H2O2)和羥基自由基(HO)等。ROS不僅可以直接損傷DNA、RNA、蛋白質和脂質等體內重要物質，還可以通過影響正常狀態下活性氧的第二信使功能造成間接損傷，與動脈粥樣硬化，糖尿病，神經退行性改變以及衰老等密切相關[8-10]。與此同時，ROS也可以通過與靶蛋白的特定原子的化學反應傳遞信號、修飾共價蛋白質，在細胞信號傳導中扮演相當重要的角色[11]。近年來的研究發現ROS可以調控活化信號影響血小板功能，是預防和治療血栓性或心血管疾病的潛在位點[12-13]。目前ROS活化血小板可能的機制有GPVI依賴性血小板活化途徑和NO/ sGC /cGMP通路，本篇綜述將討論ROS在血小板活化中的作用及其靶向治療的可能。

1.活性氧參與血小板活化進程的機制研究進展

健康人血小板細胞內含有一定水平的ROS，實驗證明ROS參與血小板的活化和聚集[14-15]。過氧化氫酶誘導的細胞中H2O2的減少會抑制血小板聚集，而過氧化氫酶缺乏將促進血小板活化。NADPH氧化酶(NADPH oxidase, NOX)是生理ROS的主要來源，用NOX抑制劑處理的或來自X-連鎖慢性肉芽腫病患者的血小板，其催化作用的NOX亞基gp91 phox中存在遺傳缺陷，表現出細胞內Ca2+動員和血小板活化功能的降低[16]。此外，使用ROS清除劑或O2?-生產抑制劑[夾竹桃麻素(Apocynin)和過氧化氫酶]會抑制血小板活化，而產生ROS的物質如2,3-二甲氧基-1,4-萘醌(2,3-dimethoxy-1,4-naphthoquinone, DNMQ)增強血小板活化[16]。近年來，對于ROS在血小板中的作用機制已有初步探索，本文將介紹ROS在GPⅥ依賴性血小板活化途徑和NO/ sGC /cGMP途徑中的作用。

2.活性氧與GPⅥ依賴性血小板活化途徑

糖蛋白VI (glycoprotein VI, GPVI)是一種僅在血小板和巨核細胞上表達的糖蛋白受體，其主要配體為膠原蛋白，在膠原介導的血小板活化中起到重要作用。GPVI由兩個細胞外Ig結構域，短粘蛋白樣結構域，跨膜結構域和細胞質尾構成[17]。GPVI細胞質結構域包括一段與鈣調蛋白(calmodulin, CaM)結合的膜近端帶正電序列，另一段與Src家族激酶的Fyn、Lyn結合的富含脯氨酸的序列，二者參與GPVI依賴的信號轉導[18]。GPVI與Fc受體γ鏈(Fc receptor γ-chain, FcRγ)通過非共價鍵連接形成復合體，這對于膠原結合GPVI介導的信號轉導至關重要。GPVI /FcRγ的交聯通過Src家族激酶Lyn使得FcRγ細胞質尾部內基于免疫受體酪氨酸的活化基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)的磷酸化，導致脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase, Syk)的募集和組裝，以及隨后的各種銜接蛋白的激活，最終導致磷脂酶Cγ2(phosholipase Cγ2, PLCγ2)的激活[19]。PLCγ2引起細胞溶質Ca2+升高并導致整合素αIIbβ3的活化，導致血小板聚集[2]。

NOX家族是在生物膜上轉移電子的蛋白質，由膜亞基(p22 phox和gp91 phox)和胞質組分(p47 phox，p67 phox，p40 phox和Rac)構成，是人體血小板生理狀態下ROS的主要來源，涉及宿主防御，蛋白質加工，細胞信號傳導，基因表達的調節和細胞分化等功能[20-21]。在哺乳動物細胞中鑒定出7個NOX家族成員(NOX1-5和DUOX1-2)，且已經在人和小鼠血小板中證實了NOX1和NOX2的表達[22]。對于腫瘤壞死因子受體相關因子(TRAF4)的研究證明了GPVI與ROS存在關聯。TRAF4是GPVI的新型配體，可以選擇性結合GPVI的細胞質尾部，并與NOX2的亞基p47 phox相互作用進而產生ROS[23]。此外，TRAF4還與其他信號蛋白如Pyk2和Hic-5相互作用，這些信號蛋白的結構與Lyn相關。Lyn是GPVI依賴性信號傳導途徑的關鍵組分，其與p47 phox磷酸化和隨后易位至膜表面所必需的蛋白激酶C(PKC)δ相關[24]。在GPVI信號傳導中，TRAF4可以通過Hic-5和Pyk2連接Lyn，通過Lyn連接PKC-δ，通過p47phox連接NOX。這將觸發p47 phox磷酸化和隨后NOX1 / 2的激活，從而激活下游Syk依賴性或Syk非依賴性通路，導致血小板聚集。血小板中ROS可以通過激活蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)對HIC-5/Lyn進行負反饋調節，因此GPVI刺激產生的ROS使得SHP-2氧化失活，促進信號分子上酪氨酸殘基的磷酸化，最終導致PLCγ2活化和血小板聚集[25-26](圖1)。谷胱甘肽過氧化物酶1(GPx1)/過氧化氫酶是清除H2O2的酶，缺乏這兩種酶的小鼠體內SHP-2氧化水平上升，血小板粘附/聚集增強，表明H2O2是血小板中SHP-2氧化失活的原因[27]。

圖1 ROS與GPⅥ依賴性血小板活化途徑

3.活性氧與NO/sGC/cGMP途徑

內皮細胞衍生的前列腺素和一氧化氮(NO)是兩大內源性血小板抑制劑，分別通過增加血小板循環核苷酸cAMP 和 cGMP 的水平抑制血小板活化。NO/cGMP是血小板活化的主要負性調控途徑，能抑制血小板聚集和粘附到血管壁。內源性或藥物衍生的NO能活化可溶性鳥苷酸環化酶(soluble guanylate cyclase, sGC)，顯著提高血小板中的cGMP水平以強烈抑制血小板活化，并且通常與前列環素導致的 cAMP升高協同作用[28]。cGMP升高可以抑制血小板激動劑介導的整合素活化，顆粒釋放，TXA2合成與釋放，以及細胞骨架重排[29]。這些步驟對于血小板形態改變，黏附和聚集十分關鍵。早期的研究表明，急性抑制內源性NO生成可以誘導血小板的快速活化。ROS可以通過將NO轉化為ONOO-， ONOO -可以進一步與酪氨酰殘基反應形成3-NO2-Tyr和與硫醇以產生S-亞硝基硫醇(RS-NO)，這些轉變可以抑制內源性NO生成從而降低NO對血小板活化的抑制作用[30-32]。另外，ONOO -可以充當COX過氧化物酶底物，導致前列腺素內過氧化物合酶激活和前列腺素形成增加，這些反應對血小板中TXA2的合成十分重要[33]。此外，ONOO -可能增強二磷酸腺苷的生物利用度，從而增加額外的血小板聚集。

最近的研究提出了NO/sGC /cGMP/PKG信號通路的新概念，該信號通路在調節血小板活化中存在雙相作用：在血小板活化期間內源性合成的低濃度NO和cGMP能促進血小板活化并增加血小板對激動劑的敏感性；高濃度的NO和cGMP類似物通過cGMP依賴性的cAMP升高和cAMP依賴性蛋白激酶的活化對血小板活化起抑制作用[34](圖2)。然而這一雙相作用觀點存在著較大爭議，其他研究提示NO/ sGC /cGMP通路作用于許多其他信號通路而不只是PKG，ROS與NO/sGC/cGMP信號通路之間的關系值得進一步探究[35-36]。

圖2 ROS與NO/sGC/cGMP途徑

4.應用進展

急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndrome, ACS)是目前人類健康的重大威脅，其標準治療即雙重血小板治療存在復發或者增加出血傾向等局限性，因此有效地防止血栓生長同時對生理止血具有最小影響的抗血小板藥物的開發極具價值[37]。針對GPⅥ依賴性血小板活化途徑，目前已從GPVI類似物、GPVI抗體、下游Syk抑制劑等各方面展開研究并取得一定成果[38]。前文我們已經介紹NOX1/2產生的ROS能促進血小板粘附、聚集和血栓形成，因此NOX1/2可能是潛在的靶向治療位點，靶向NOX1/2亞基以減少ROS產生實現抑制血小板活化的思路對于抗血栓治療具有極大價值。針對ROS和NO/sGC/cGMP途徑之間的關系，部分研究發現多種天然提取物可以增加血小板內源性抑制機制，這也是抗血栓治療的潛在應用方向。

(1) NOX抑制劑：NOX1和NOX2都是動脈剪切時膠原介導的血栓形成所必需的[39]。對于NOX1、NOX2和ROS之間關系仍存在疑問，有研究發現是NOX1和NOX2在血小板活化期間發揮不同的作用，NOX1在小鼠中GPCR介導的血小板活化中起重要作用，但在由CRP誘導的GPVI依賴性血小板活化不是必需的，而NOX2在凝血酶和GPVI依賴性ITAM信號傳導途徑中至關重要[26]；使用特異于NOX1的ML171(2-乙酰基吩噻嗪)以及NOX2缺陷小鼠的藥理學抑制劑的研究表明，是NOX1而非NOX2負責GPVI依賴性ROS產生和TXA2產生[39]；新的研究稱NOX2并非是導致血小板活化和血栓形成的ROS的主要來源，同時另外一組實驗用Rac1-/-或特異性Rac抑制劑NSC23766處理的人血小板中CRP誘導的ROS顯著減少，但發現其出血時間并沒有縮短[40]。此外，NOX2-/-血小板顯示出GPVI依賴性血小板活化期間ROS產生和Ca2+動員在減少。雖然還需要更加深入的研究NOX1/2在不同病理生理條件下GPVI依賴性ROS產生中的相對作用，但靶向NOX1/2減少ROS產生實現抑制血小板活化的思路具有十足潛力。

根據特異性，NOX抑制劑分為非特異性，NOX1特異性和NOX2特異性抑制劑。非特異性抑制劑包括二聯苯碘(diphenyliodonium, DPI)，夾竹桃麻素(Apocynin)等。DPI通過抑制黃素蛋白來阻斷ROS的產生。Apocynin被廣泛用于中風的實驗模型中，其抑制機制是通過阻斷NOX亞基p47phox遷移到膜表面形成具有功能的NOX復合體的過程。Apocynin的抑制作用有時需要髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)的參與，apocynin在MPO含量較少的細胞中只能清除ROS而不能抑制NOX減少ROS的產生[41]。雖然通常認為apocynin是NOX的非特異性抑制劑，但也有實驗提示其對NOX2存在一定特異性[42]。

NOX1特異性抑制劑有2-乙?；脏玎?2-acetylphenothiazine, 2-APT)和NoxA1ds等。2-APT 是NOX1特異性抑制劑，通過削弱GPVI特異性激動劑CRP對整合素αIIβ3和PKC的激活作用，最終影響膠原對Syk的激活作用[43]。NoxA1ds是一種多肽，可以模擬一個與p67phox激活域同源的Nox1激活子亞基NoxA1的假定的激活域。P67phox激活域能使NOX1產生的ROS減少95%，研究證實NoxA1也能發揮相同作用[44]。

NOX2特異性抑制劑包括Nox2ds-tat和PR-39等。Nox2ds-tat又名gp91ds-tat，是最具特異性同時也是最廣為使用的NOX2抑制劑。Nox2ds-tat可以特異性結合p47phox并防止NOX2的組裝[41]。PR-39的抑制機制可能是通過與p47phox中的SH3結構域結合并干擾其與p22phox的C末端內的脯氨酸域(PRDs)的結合，從而干擾NOX組裝[44]。

(2) 增強內源性抑制機制的天然產物：除了靶向NOX1/2，抑制血小板活化也可以通過增強內源性機制的途徑，包括提高細胞內cAMP與cGMP以及使用抗氧化劑等[45]。cAMP和cGMP分別通過激活cAMP和cGMP依賴性蛋白激酶，誘導血管擴張劑激動的磷蛋白(VASP)磷酸化，并減弱細胞骨架重組和整合素的激活[46]。多種天然產品或提取的生物活性成分可以下調氧化應激和干擾多條信號通路中的受體或配體達到抑制血小板活化的目的[47]。最近的研究已證明人參的活性成分(人參皂苷RP3)能通過SFK /PLCγ2/Ca2+，cAMP/P-VASP和MAPK最終阻止整合素αIIbβ3a的活化，抑制ADP誘導的血小板聚集，從而減少體內血栓形成的風險[48]。對血小板活化聚集的信號傳導途徑的進一步研究可能揭示新的潛在靶標并為抗血栓藥物的研發帶來新思路。

5.結論

血小板活化信號在止血和血栓形成中的作用中起關鍵作用，ROS可以調控活化信號影響血小板功能。ROS通過在GPⅥ依賴性血小板活化途徑中氧化SHP-2和通過NO/sGC/cGMP途徑中將NO轉化為ONOO-、增加TXA2的合成來促進血小板活化。NOX是機體中ROS的最主要來源，靶向NOX1/2或增強內源性抑制機制可以減少ROS產生，實現對血小板活化的抑制。血栓性或心血管疾病是導致全球死亡的主要原因，ROS影響血小板的具體機制可以指導相關治療，因此對機制進一步的探索極具價值。