基于親水相互作用液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法研究白茶萎凋過程中代謝物的變化

陳翔，田月月，張麗霞

基于親水相互作用液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法研究白茶萎凋過程中代謝物的變化

陳翔，田月月，張麗霞*

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，泰安市茶葉工程技術(shù)研究中心，山東 泰安 271018

采用親水相互作用液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法，對白茶鮮葉（F）和室內(nèi)萎凋處理29?h（W）、53?h（P）的2個萎凋樣進行了代謝物靶向檢測，Quality control（QC）樣本中共檢測到111個代謝物，主要包括47種氨基酸及其衍生物、29種核酸類代謝物、12種維生素和輔酶、17種糖代謝物和6種甘油磷脂代謝物。與鮮葉F相比，萎凋葉W和P中顯著增加的代謝物分別有39種和41種，其中共有代謝物35種；顯著降低的代謝物分別有9種和11種，其中共有代謝物8種。顯著變化代謝物分析結(jié)果表明，萎凋葉的細胞膜受損、DNA和RNA降解、氨基酸衍生物顯著增加、糖代謝異常。根據(jù)代謝物含量的變化幅度和組成特異性，篩選了表征萎凋葉細胞膜生理狀態(tài)和核酸、糖代謝的標(biāo)志代謝物。此外，針對代謝物中氨基酸和核苷酸的組成特點，提出了研究氨基酸衍生物滋味特性的必要性和應(yīng)用代謝譜分析建立萎凋工藝適度標(biāo)準(zhǔn)的可能性。

白茶；萎凋；靶向代謝譜

白茶是我國六大茶類之一，成茶具有“外形自然，滿披白毫，毫香凸顯，香氣清鮮，滋味鮮醇，湯色杏黃”的品質(zhì)特征[1]。傳統(tǒng)白茶加工由萎凋、干燥工序組成，而萎凋是白茶品質(zhì)形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

萎凋是指在一定環(huán)境條件下，鮮葉散失部分水分同時發(fā)生一系列以水解為主體的化學(xué)反應(yīng)過程。萎凋是白茶、紅茶和烏龍茶加工工序之一，其中以白茶的萎凋時間最長、萎凋失水減重最大。已有研究表明，白茶經(jīng)萎凋，干物質(zhì)含量下降4.2%~4.5%，多酚類物質(zhì)下降36%，兒茶素總量下降49%，總糖下降50%以上[2]，游離氨基酸含量顯著增加[3]。由于受分析技術(shù)的制約，人們尚未對上述物質(zhì)變化的相關(guān)代謝途徑（糖、氨基酸、核酸等）及細胞膜結(jié)構(gòu)特性變化進行研究，而目前興起的代謝組學(xué)為開展這方面的研究提供了有效的手段和方法。

代謝組學(xué)（Metabolomics或Metabonomics）指應(yīng)用核磁共振技術(shù)或色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等分析技術(shù)，研究生物體或組織甚至單個細胞中核苷酸、氨基酸、糖類、脂類等全部小分子代謝物（分子量小于1?000）的成分及其動態(tài)變化的學(xué)科[4]。代謝組學(xué)根據(jù)所檢測的代謝物范圍分為靶向代謝組學(xué)（Targeted metabolomics）和非靶向代謝組學(xué)（Untargeted metabolomics）兩類，對復(fù)雜生物樣本廣泛應(yīng)用的是基于色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的靶向代謝組學(xué)分析。目前，代謝組學(xué)在茶樹生長發(fā)育[5]、茶葉品種分類與鑒別[6-9]、茶葉加工工藝優(yōu)化[10-12]、茶葉品質(zhì)控制[13-14]、茶葉原產(chǎn)地和年份鑒別[15]等領(lǐng)域加以應(yīng)用[16]。Dai等[17]基于UHPLC-Q-TOF MS的非靶向代謝組學(xué)方法分析白茶萎凋過程中代謝物動態(tài)變化表明，氨基酸類物質(zhì)酪氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、脯氨酸和異亮氨酸以及TF 3-沒食子酸酯、TF沒食子酸酯、TF二聚兒茶素、茶雙沒食子兒茶素A和茶雙沒食子兒茶素B的含量至少增加了5倍，而兒茶素、沒食子兒茶素和沒食子兒茶素沒食子酸酯的含量降低了50%以上。

本文采用親水相互作用液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法，對白茶鮮葉（F）和萎凋處理29?h（W）、53?h（P）的2個萎凋葉進行氨基酸、核苷酸、維生素和輔酶、糖類和甘油磷脂類小分子代謝物進行靶向代謝譜分析，旨在了解白茶萎凋過程中代謝物的變化規(guī)律及其對白茶品質(zhì)的影響，并為白茶萎凋工藝技術(shù)參數(shù)的確定提供分子水平的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

材料：2018年6月中旬在泰安桃花峪茶園采摘福鼎大白茶樹一芽二葉的新梢，茶樹樹齡為3年。進行室內(nèi)厚攤萎凋處理，其室內(nèi)環(huán)境條件為：溫度23~33℃、平均溫度28.3℃；空氣濕度35%~64%、平均空氣濕度48.6%。分別選取鮮葉和2個萎凋葉（處理29?h和53?h）各25?g于微波爐中，高火4?min，80℃烘至水分約為5%，粉碎機粉碎。準(zhǔn)確稱取0.1?g茶粉于離心管中，加入10?mL 100℃沸水浸提5?min，每隔1?min對離心管進行上下?lián)u晃，然后置于高速離心機離心10?min，轉(zhuǎn)速為8?000?r·min-1，4℃下取2?mL上清液經(jīng)0.22?μm濾膜過濾，分別標(biāo)記為F、W和P，–80℃保存，每個樣品重復(fù)提取3次，均進行代謝組學(xué)分析。

儀器與試劑：格蘭仕微波爐、FW100高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；DHG-9140A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；AB5500 QqQ質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX公司）；Waters I-class超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；5430R低溫高速離心機（德國艾本德股份公司）；Fluka氨水（美國Sigma-aldrich公司）；色譜柱（ACQUITY UPLC BEH Amide l.7?μm，2.1?mm×100?mm，美國Waters公司）；乙腈（德國Merck公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備方法

取試驗樣品在4℃緩慢解凍后，每份取等量100?μL，加入400?μL預(yù)冷甲醇-乙腈（甲醇∶乙腈=1∶1），渦旋混合，–20℃孵育1?h沉淀蛋白質(zhì)，14?000，4℃條件下離心20?min，取上清液，真空干燥。質(zhì)譜檢測時加入100?μL乙腈-水溶液（乙腈∶水=1∶1）復(fù)溶，14?000，4℃離心15?min，取上清液進樣分析。

1.2.2 色譜條件

樣品采用Waters I-class超高效液相色譜儀進行分離。流動相：A為水溶液+25?mmol·L-1乙酸銨+25?mmol·L-1氨水（pH=9.75），B為乙腈。樣品置于4℃自動進樣器中，柱溫40℃，流速為0.3?mL·min-1，進樣量1?μL。液相梯度如下：0~1?min，B維持在95%；1~14?min，B從95%線性變化到65%；14~16?min，B從65%線性變化到40%；16~18?min，B維持在40%；18~18.1?min，B從40%線性變化到95%；18.1~23?min，B維持在95%。隊列中每隔6個試驗樣本設(shè)置1個QC樣本，共3個QC樣本。

1.2.3 MRM質(zhì)譜條件

采用AB5500 QqQ質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析。ESI源條件如下：鞘氣溫度，350℃；干氣溫度，350℃；鞘氣流量11?L·min-1；干氣流量10?L·min-1；毛細管電壓，正負模式中分別為4?000?V或–3?500?V；噴嘴電壓，500?V；噴霧器壓力，30?psi。采用MRM模式監(jiān)測，每個MRM離子對的停留時間為3?ms，總的循環(huán)時間為1.263?s。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用MRM analyzer（R）對200個代謝物的MRM原始數(shù)據(jù)進行提取，得到各代謝物的峰面積，數(shù)據(jù)采集以及數(shù)據(jù)分析過程參照Cai等[18]研究結(jié)果。單變量分析方法包括變異倍數(shù)分析（Fold change analysis）、檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗質(zhì)量控制

采用QC樣本對試驗過程中系統(tǒng)的穩(wěn)定性和重復(fù)性進行評價，試驗結(jié)果見表1。結(jié)果表明，QC樣本中檢測到111個代謝物的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＜30%，說明這些物質(zhì)在整個試驗過程中穩(wěn)定性和重復(fù)性較好。

2.2 靶向代謝物種類

將所檢測到的111個代謝物依據(jù)代謝途徑和分子結(jié)構(gòu)特點，分為氨基酸及其衍生物、核酸代謝物、維生素和輔酶、糖代謝物和甘油磷脂代謝物5類。

2.2.1 氨基酸及其衍生物

共計47種，按分子結(jié)構(gòu)特點及來源可分為蛋白質(zhì)氨基酸、蛋白質(zhì)氨基酸衍生物、非蛋白質(zhì)氨基酸和寡肽4組（相對含量顯著增加的共有代謝物用“*”標(biāo)注，相對含量顯著減少的共有代謝用“#”標(biāo)注）。

（1）蛋白質(zhì)氨基酸（14種）：-酪氨酸Tyr*、-天冬酰胺Asn*、-亮氨酸Leu*、-纈氨酸Val*、L-絲氨酸Ser、-色氨酸Trp、-谷氨酰胺Gln、-精氨酸Arg、-脯氨酸Pro、-賴氨酸Lys、-苯丙氨酸Phe、-天冬氨酸Asp、-谷氨酸Glu#、-蛋氨酸Met#。

（2）蛋白質(zhì)氨基酸衍生物（25種）：①乙酰化（6種）：-乙酰基--酪氨酸*、乙酰基--亮氨酸*、-乙酰基--苯丙氨酸*、-乙酰基-谷氨酰胺、6-乙酰基--賴氨酸、-乙酰基--丙氨酸；②甲基化（2種）：二甲基甘氨酸*、肌氨酸（-甲基甘氨酸）*；③氨基酰化（1種）：-氨基酰--天冬氨酸；④羥基化（1種）：-4-羥基--脯氨酸；⑤脫氨衍生物（5種）：-GABA*、苯乳酸*、對羥基苯甲酸*、咪唑丙烯酸、4-胍基丁酸#、⑥脫羧衍生物（3種）：-乙酰尸胺*、色胺、-乙酰腐胺；⑦其他途徑衍生物（7種）：-2-氨基己二酸*、甲基胍*、-蛋氨酸亞砜；5-氨基戊酸、-瓜氨酸、-犬尿氨酸、5-氨基酮戊酸。

（3）非蛋白質(zhì)氨基酸（4種）：-腺苷高半胱氨酸*、-高絲氨酸、-高半胱氨酸、-哌啶酸（又稱-高脯氨酸）。

（4）寡肽（4種）：--谷氨酰--苯基丙氨酸、肌肽（--丙氨酰--組氨酸）、甘氨酰--亮氨酸、氧化谷胱甘肽。

表1 檢測出的代謝產(chǎn)物及其變化倍數(shù)

注：“倍數(shù)”是指鮮葉和萎凋葉中代謝物的含量比值。當(dāng)倍數(shù)＞1時，表明代謝物在萎凋葉中的含量降低，且值越大，下降幅度越大；當(dāng)倍數(shù)＜1時，表明代謝物在萎凋葉中含量升高，且值越小，則上升幅度越大

Note: ‘Fold’ refers to the ratio of metabolites in fresh leaves and withered leaves. When fold>1, it indicates that the content of metabolites in the withered leaves is decreased, and the larger the value, the greater the decrease. When fold<1, the content of metabolites in the withered leaves is increased, and the smaller the value, the greater the increase

續(xù)表1

續(xù)表1

2.2.2 核酸代謝物

共計29種，按分子結(jié)構(gòu)特點分為嘌呤、嘧啶兩組。

（1）嘌呤代謝物（20種）：①腺嘌呤類（8種）：腺嘌呤*，2'--甲基腺苷*（存在于rRNA中）、5'-脫氧腺苷*、腺苷、N6-甲基腺苷，脫氧腺苷酸（dAMP）*、環(huán)磷酸腺苷酸（cAMP）*、腺苷酸（AMP），②鳥嘌呤類（5種）：鳥苷*、脫氧鳥苷、7-甲基鳥苷、2,2-二甲基鳥苷、二磷酸鳥苷（GDP），③次黃嘌呤類（3種）：次黃嘌呤*、肌苷*（次黃嘌呤核苷）、肌苷酸（IMP），④黃嘌呤類（2種）：7-甲基黃嘌呤、黃嘌呤，⑤降解產(chǎn)物（2種）：尿酸、尿囊酸。

（2）嘧啶代謝物（9種）：①胞嘧啶類（5種）：胞嘧啶、4-乙酰胞嘧啶、胞苷*、脫氧胞苷、胞苷酸（CMP），②胸腺嘧啶類（1種）：胸腺嘧啶，③尿嘧啶類（2種）：尿苷*、尿苷酸#（UMP），④其他（1種）：假尿嘧啶核苷。

2.2.3 維生素和輔酶

共計12種，分別為：煙酰胺核苷酸*、煙酰胺腺嘌呤二磷酸核苷酸（NADP）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、煙酸*（VB3）、煙酸腺嘌呤二核苷酸（NAAD），核黃素（VB2）、黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）、黃素單核苷酸（FMN）、泛酸*（VB5）、吡哆醛、4-吡哆酸、吡哆醇。

2.2.4 糖代謝物

共計17種，主要涉及糖酵解、三羧酸循環(huán)、糖醛酸代謝途徑的化合物和糖及其衍生物，據(jù)此分為4組。

（1）糖酵解途徑代謝物（5種）：-葡萄糖-6-磷酸、磷酸二羥丙酮、甘油-3-磷酸、磷酸烯醇丙酮酸（PEP）*、-乳酸。

（2）三羧酸循環(huán)代謝物（5種）：檸檬酸、-烏頭酸、琥珀酸#、延胡索酸、蘋果酸。

（3）糖醛酸途徑（3種）：2-酮基--葡糖酸、二磷酸尿苷葡萄糖#（UDP-Glu）、二磷酸尿苷葡萄糖醛酸#（UDP-GluUA）。

（4）糖及其衍生物（4種）：蔗糖#、肌醇*（半乳糖代謝產(chǎn)物）、-乙酰基-D-葡糖胺*、柚苷。

2.2.5 甘油磷脂代謝物

共計6種，包括甘油酸*、膽堿*、甜菜堿、-肉毒堿、胞苷二磷酸膽堿*（CDP-膽堿，細胞膜結(jié)構(gòu)性磷脂生物合成過程中的一種必不可少的中間產(chǎn)物）和甘油磷酸膽堿。

上述所檢測的生化成分主要涉及蛋白質(zhì)、DNA、RNA相關(guān)的氨基酸、核苷酸類化合物及其衍生物，同時還包括與基礎(chǔ)代謝相關(guān)的維生素和輔酶、糖代謝（糖酵解、TCA、葡糖醛酸）以及細胞膜成分相關(guān)的生化成分。

2.3 顯著差異的代謝物篩選

顯著差異代謝物的篩選標(biāo)準(zhǔn)為-value＜0.05且Fold change＞1.5或＜0.67。一般來說，當(dāng)篩選的候選代謝物合理且準(zhǔn)確時，同組樣能夠通過聚類出現(xiàn)在同一簇（Cluster）中。同時，聚在同一簇內(nèi)的代謝物具有相同的表達模式，可能在代謝過程中處于較為接近的反應(yīng)步驟中。依據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)篩選出F和W顯著差異物48種（圖1）、F和P顯著性差異物52種（圖2）、W和P顯著性差異物5種（圖3）。

由圖1可知，與鮮葉F相比，萎凋29?h的W樣品中相對含量顯著增加的代謝物有39種，增幅由大至小依次為：-乙酰基--酪氨酸、甘油酸、乙酰基-D-葡糖胺、腺嘌呤、乙酰--亮氨酸、CDP-膽堿、5'-脫氧腺苷、-2-氨基己二酸、dAMP、鳥苷、煙酰胺核苷酸、尿苷、2'--甲基腺苷、煙酸、胞苷、肌醇、cAMP、次黃嘌呤、磷酸二羥丙酮、-乙酰基--苯丙氨酸、苯乳酸、-乙酰尸胺、Tyr、Asn、GABA、膽堿、-腺苷高半胱氨酸、對羥基苯甲酸、二甲基甘氨酸、肌氨酸、肌苷、甲基胍、N6-甲基腺苷、核黃素、Leu、泛酸、PEP、Val、7-甲基黃嘌呤。其中，氨基酸代謝物16種（蛋白質(zhì)氨基酸4種、氨基酸衍生物11種、非蛋白氨基酸1種）、核酸代謝物12種、維生素和輔酶4種、糖代謝4種、甘油磷脂代謝物3種。W中相對含量顯著減少的代謝物有9種，降幅度由大至小依次為：UDP-GluUA、UDP-Glu、Met、UMP、蔗糖、尿酸、Glu、4-胍基丁酸、琥珀酸。其中，氨基酸類代謝物3種，核酸代謝物2種，糖代謝物4種。

圖1 F和W代謝物層次聚類結(jié)果

圖2 F和P代謝物層次聚類結(jié)果

圖3 P和W代謝物層次聚類結(jié)果

由圖2可知，與鮮葉F相比，萎凋53?h的P中相對含量顯著增加了41種代謝物，增幅由大至小依次為：甘油酸、-乙酰基--酪氨酸、乙酰基--葡糖胺、腺嘌呤、CDP-膽堿、乙酰--亮氨酸、5'-脫氧腺苷、-2-氨基己二酸、煙酰胺核苷酸、2'--甲基腺苷、--谷氨酰--苯丙氨、尿苷、肌醇、煙酸、dAMP、苯乳酸、Tyr、-腺苷高半胱氨酸、鳥苷、-乙酰基--苯丙氨酸、胞苷、膽堿、N-乙酰尸胺、次黃嘌呤、GABA、對羥基苯甲酸、cAMP、二甲基甘氨酸、Asn、肌氨酸、肌苷、PEP、泛酸、Leu、脫氧鳥苷、-肉毒堿、Ser、甲基胍、-乙酰基--丙氨酸、VB6、Val。其中，氨基酸類代謝物20種（蛋白質(zhì)氨基酸5種、氨基酸衍生物13種、非蛋白氨基酸1種、寡肽1種）、核酸代謝物11種、維生素和輔酶4種、糖代謝物3種、甘油磷脂代謝物3種。萎凋葉P相對含量顯著減少的代謝物有11種，降幅由大至小依次為：UDP-GluUA、UDP-Glu、Met、UMP、蔗糖、-氨基酰--天冬氨酸、琥珀酸、4-胍基丁酸、Glu、-乙酰腐胺、-哌啶酸，其中，氨基酸類代謝物6種，核苷酸1種，糖代物4種。

萎凋葉W、P與鮮葉F相比，相對含量顯著增加的共有代謝物有35種，差異代謝物10種，其中，W中相對含量顯著增加的差異代謝物有磷酸二羥丙酮、6-甲基腺苷、核黃素和7-甲基黃嘌呤4種；P中相對含量顯著增加的6種差異代謝物分別為--谷氨酰--苯丙氨酸、脫氧鳥苷、-肉毒堿、Ser、-乙酰基--丙氨酸和VB6。相對含量顯著減少的共有代謝物8個，差異代謝物4個，W中相對含量顯著減少的差異代謝物為尿酸；P中相對含量顯著減少的3種差異代謝物分別是-氨基酰--天冬氨酸、-乙酰腐胺和-哌啶酸。

由圖3可知，與W相比，萎凋葉P中相對含量顯著增加的代謝物僅有尿酸（0.36）1種，相對含量顯著減少的代謝物有4種，主要為氨基酸及其衍生物，減少幅度由大到小依次為：瓜氨酸（1.88）、-哌啶酸（1.66）、-氨基酰--天冬氨酸（1.57）和-乙酰腐胺（1.51）。

3 討論

3.1 白茶萎凋代謝特點及標(biāo)志物篩選

本試驗基于已有的HILIC-QqQ MS MRM技術(shù)為分析平臺，該方法可以快速對32個KEGG通路中近200個代謝物靶向定量分析，但是未能對茶葉中主成分多酚類、生物堿類、茶氨酸進行測定，下一步需要補充數(shù)據(jù)庫相關(guān)的樣本量。

本研究結(jié)果表明，經(jīng)過29?h和53?h萎凋處理的萎凋葉（W和P）與鮮葉相比，在所檢測的111種代謝物中，含量顯著增加的分別有39種和41種，顯著降低的僅9種和11種。這些代謝物分別涉及氨基酸、核酸、維生素和輔酶、糖和甘油磷脂相關(guān)代謝途徑，可以從多個維度反映白茶萎凋過程中細胞生理狀態(tài)和代謝特點，主要有以下表現(xiàn)：

第一，細胞膜受損，甘油磷脂合成代謝受阻。甘油磷脂是生物體細胞膜結(jié)構(gòu)的重要組成成分，同時也參與細胞膜對蛋白質(zhì)的識別和信號傳導(dǎo)。植物體內(nèi)的甘油磷脂在磷脂酶D催化下發(fā)生磷酸與取代基團（如膽堿、肌醇、絲氨酸、甘油等）之間酯鍵的水解，從而釋放出取代基團。在本研究所檢測的代謝物中，與甘油磷脂相關(guān)的取代基化合物有膽堿、肌醇以及取代基絲氨酸、甘油的降解或氧化產(chǎn)物甘油酸，這3種代謝物在萎凋葉W和P中均顯著增加，且上升幅度為：甘油酸＞肌醇＞膽堿。由此表明，細胞膜主要結(jié)構(gòu)成分的甘油磷脂分子發(fā)生降解，從而導(dǎo)致細胞膜結(jié)構(gòu)的損傷。甘油酸、肌醇和膽堿的含量變化可作為細胞膜生理狀態(tài)的代謝標(biāo)志物。此外，CDP-膽堿含量顯著增加，甘油磷酸膽堿含量無顯著變化，由此表明，甘油磷酸膽堿合成代謝受阻，從而導(dǎo)致中間代謝物累積。

第二，RNA、DNA降解。與鮮葉相比，萎凋葉P、W中嘌呤類共有代謝物8種，分別為腺嘌呤、5'-脫氧腺苷、2'--甲基腺苷、dAMP、cAMP、鳥苷、次黃嘌呤、肌苷；嘧啶類共有代謝物2種，分別為胞苷和尿苷，且這些共有代謝物均顯著增加，其中以腺嘌呤類代謝物含量增加的種類較多，幅度較大；萎凋葉中含量顯著下降的代謝物僅有UMP 1種。這可能與UMP存在于RNA之中，其降解速度較DNA快有關(guān)。此外，依據(jù)DNA、RNA分子組成特點和含量變化情況，可篩選出5'-脫氧腺苷、dAMP作為DNA降解的標(biāo)志物，尿苷作為總RNA的降解標(biāo)志物，2'--甲基腺苷作為rRNA降解的標(biāo)志物，肌苷作為tRNA降解的標(biāo)志物。

第三，氨基酸及其衍生物組成特點。（1）氨基酸衍生物種類多（25種），占氨基酸代謝物種類的53.19%，主要衍生化途徑包括乙酰化、甲基化、氨基酰化、羥基化以及脫氨、脫羧等。其中，6種蛋白質(zhì)氨基酸存在乙酰化形式，而甘氨酸則以二甲基甘氨酸、肌氨酸2種甲基化形式存在，且在萎凋葉中顯著增加。（2）芳香族、堿性氨基酸及其衍生物增幅較大。如酪氨酸及其衍生物：-乙酰基--酪氨酸、對羥基苯甲酸；-苯丙氨酸的衍生物：-乙酰基--苯丙氨酸、苯乳酸；-賴氨酸的衍生物：-2-氨基己二酸、-乙酰尸胺；-精氨酸的衍生物：甲基胍；（3）含量顯著降低的氨基酸僅谷氨酸和蛋氨酸2種。

第四，糖代謝異常。糖酵解途徑中的PEP顯著增加，表明中間代謝物累積；TCA途徑中的琥珀酸顯著減少，表明TCA途徑受阻；糖醛酸途徑UDPG-Glu、UDPG-GluUA顯著減少，多糖合成受阻。此外，作為光合產(chǎn)物的蔗糖顯著減少，不能為糖代謝提供必要的底物。

3.2 代謝譜分析可為白茶萎凋工藝參數(shù)確定提供依據(jù)

目前白茶加工萎凋工序的適度標(biāo)準(zhǔn)主要以失重率、感官指標(biāo)并結(jié)合萎凋時間進行判斷，雖然簡單易行，但缺少從分子水平上進行判定的依據(jù)。

本研究應(yīng)用代謝譜分析，不僅可以通過甘油磷脂及其降解物的含量變化了解細胞膜結(jié)構(gòu)的生理狀態(tài)，而且可以了解萎凋葉中與滋味相關(guān)的主要代謝途徑以及代謝物的變化情況，從而可在分子水平上為白茶萎凋適度提供科學(xué)依據(jù)。本研究雖然選取了萎凋處理時間差異大的2個萎凋樣W、P，但兩者的代謝譜差異很小，在111個所檢測的代謝物中僅有5個存在顯著差異，說明29?h至53?h之間的萎凋處理對茶葉品質(zhì)形成影響較小。究其原因，可能與泰安空氣濕度低（25%~46%，平均36.6%），萎凋葉失水過快，處理29?h和53?h的2個萎凋樣的含水量低且兩者之間差異小密切相關(guān)。經(jīng)測定，W的含水量為11.7%，P的含水量為8.1%，顯著低于生物體進行正常生理代謝反應(yīng)的水分范圍。以上結(jié)果表明，通過對不同萎凋時間處理的茶樣進行代謝譜差異顯著性分析，可以了解萎凋葉代謝物的變化進程，從而有利于從分子水平判定萎凋工藝技術(shù)參數(shù)的合理性。

3.3 白茶萎凋代謝物對滋味的影響

在茶葉品質(zhì)化學(xué)及形成機理研究中，目前普遍關(guān)注的是茶多酚及其氧化產(chǎn)物，其次為游離氨基酸，并提出了評判茶葉滋味物質(zhì)協(xié)調(diào)性的“酚/氨比值”，明確了游離氨基酸是茶湯鮮度的貢獻者[1]。在本項研究中，除檢測到14種蛋白質(zhì)氨基酸外，還檢測到25種氨基酸衍生物，包括乙酰化、甲基化、氨基酰化以及脫氨、脫羧等多種途徑產(chǎn)生的代謝物，其中有11種代謝物在萎凋葉中顯著增加。這些代謝物對白茶滋味有何影響？目前尚未見報道，有待進一步研究。

在食品工業(yè)領(lǐng)域，呈味核苷酸被稱為“超級味精”，雖然它們自身的鮮味微弱，且增加濃度對其鮮味提升作用不明顯，但它們對鮮味及甜味、肉味和醇厚感有增效作用，對酸味、苦味、腥味和焦味等不良風(fēng)味有消除或抑制作用[19]。呈味核苷酸的主要種類有肌苷酸、鳥苷酸、胞苷酸、尿苷酸和黃苷酸[20]。在白茶萎凋葉中雖然檢測到29種核酸類代謝物，但與鮮葉相比顯著增加的主要為核苷代謝物，如肌苷、鳥苷、胞苷和尿苷，而呈味的尿苷酸顯著減少，其他呈味核苷酸類無顯著變化。由此表明，現(xiàn)有白茶萎凋工藝還有待進一步優(yōu)化。核酸經(jīng)磷酸二酯酶水解為核苷酸，再由磷酸單酯酶水解為核苷和磷酸。為了使白茶中的鮮味核苷酸含量增加，尚需開展白茶萎凋過程中呈味核苷酸變化規(guī)律的研究。同時，該項研究還將為白茶萎凋時長判定和適度標(biāo)準(zhǔn)制訂提供生化依據(jù)，因而具有一定的理論價值和實際指導(dǎo)作用。

[1] 施兆鵬, 黃建安. 茶葉審評與檢驗[M]. 4版. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2010. Shi Z P, Huang J A. Tea evaluation and inspection [M]. 4th ed, Beijing: China Agricultural Press, 2010.

[2] 顧謙, 陸錦時, 葉寶存. 茶葉化學(xué)[M]. 北京: 中國科學(xué)技術(shù)出版社, 2002. Gu Q, Lu J S, Ye B C. Tea chemistry [M]. Beijing: Science and Technology of China Press, 2002.

[3] 楊偉麗, 肖文軍, 鄧克尼. 加工工藝對不同茶類主要生化成分的影響[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2001, 27(5): 384-386. Yang W L, Xiao W J, Deng N K. Effects of processing technology of different teas on the main biochemistry components [J]. Journal of Hunan Agricultural University, 2001, 27(5): 384-386.

[4] Fiehn O, Kopka J, Trethewey R N, et al. Identification of uncommon plant metabolites based on calculation of elemental compositions using gas chromatography and quadrupole mass spectrometry [J]. Analytical Chemistry, 2000, 72(15): 3573-3580.

[5] 王凱. 基于穩(wěn)定性同位素15N示蹤和代謝譜分析技術(shù)的茶葉氮代謝研究[D]. 合肥: 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012. Wang K.15N stable isotope tracer-based spectral analysis techniques and metabolism of nitrogen metabolism of tea plant [D]. Hefei: Anhui Agricultural University, 2012.

[6] 張磊, 曾仲大, 葉國注, 等. 基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的非靶向代謝組學(xué)用于3類茶葉中化學(xué)成分分析[J]. 色譜, 2014, 32(8): 804-816. Zhang L，Zeng Z D, Ye G Z, et al. Non-targeted metabolomics study for the analysis of chemical compositions in three types of tea by using gas chromatography-mass spectrometry and liquid chromatography-mass spectrometry [J]. Chinese Journal of Chromatography, 2014, 32(8): 804-816.

[7] Zhang L, Ning L, Yan Y C, et al. Development of the fingerprints of crude Pu-erh tea and ripened Pu-erh tea by high performance liquid chromatography [J]. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences, 2011(20): 352-359.

[8] 李萬春. 氣質(zhì)聯(lián)用在不同茶葉品質(zhì)鑒定中的應(yīng)用[D]. 南京: 南京理工大學(xué), 2012. Li W C. Application of GC-MS in different tea quality identification [D]. Nanjing: Nanjing University of Science and Technology, 2012.

[9] Van d H J J J, Akermi M, ünlü F Y, et al. Structural annotation and elucidation of conjugated phenolic compounds in black, green, and white tea extracts [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60(36): 8841-8850.

[10] 王秀梅. 祁門紅茶加工過程中代謝譜分析及其品質(zhì)形成機理研究[D]. 合肥: 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012. Wang X M. Analysis of metabolism profile and its quality formation mechanism in the process of keemun black tea [D]. Hefei: Anhui Agricultural University, 2012.

[11] Lee J E, Lee B J, Chung J O, et al.1H NMR-based metabolomic characterization during green tea () fermentation [J]. Food Research International, 2011(44): 597-604.

[12] Tan J, Dai W, Lu M, et al. Study of the dynamic changes in the non-volatile chemical constituents of black tea during fermentation processing by a non-targeted metabolomics approach [J]. Food Research International, 2016, 79: 106-113.

[13] Dai W, Qi D, Yang T, et al. Non-targeted analysis using ultra-performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry uncovers the effects of harvest season on the metabolites and taste quality in tea (L.) [J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2015, 63(44): 9869-9878.

[14] 湯莎莎, 蘆晨陽, 周君, 等. 基于電子鼻和HS-SPME-GC -MS技術(shù)解析烏牛早茶的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[J]. 食品工業(yè)科技, 2018, 39(14): 223-230. Tang S S, Lu C Y, Zhou J, et al. Volatile flavor compounds of different Wu Niuzao leaves and different heating temperatures based on electronic nose and GC-MS [J]. Science and Technology of Food Industry. 2018, 39(14): 223-230.

[15] Pongsuwan W, Bamba T, Yonetani T, et al. Quality prediction of Japanese green tea using pyrolyzer coupled GC/MS based metabolic fingerprinting [J]. J Agric Food Chem, 2008, 56(3): 744-750.

[16] 戴宇樵, 呂才有. 代謝組學(xué)技術(shù)在茶學(xué)中的應(yīng)用研究進展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2019, 47(2): 24-28. Dai Y Q, Lv C Y. Research progress of application of metabolomics technology in tea science [J]. Jiangsu Agricultural Sciences, 2019, 47(2): 24-28.

[17] Dai W D, Xie D C, Lu M L, et al. Characterization of white tea metabolome: Comparison against green and black tea by a nontargeted metabolomics approach [J]. Food Research International, 2017, 96: 40-45.

[18] Cai Y P, Weng K, Guo Y, et al. An integrated targeted metabolomic platform for high-throughput metabolite profiling and automated data processing [J]. Metabolomics, 2015, 11(6): 1575-1586.

[19] 崔桂友. 呈味核苷酸及其在食品調(diào)味中的應(yīng)用[J]. 中國調(diào)味品, 2001, 16(10): 25-29.Cui G Y. Favor nucleotides and its application in food seasoning [J]. Chinese Condiment, 2001, 16(10): 25-29.

[20] 沈浥. 調(diào)味品中呈味核苷酸的研究進展和我國標(biāo)準(zhǔn)化現(xiàn)狀[J]. 中國調(diào)味品, 2017, 42(1): 177-180. Shen Y. Research progress of the flavor nucleotides in condiments and standardization status in China [J]. China Condiment, 2017, 42(1): 177-180.

The Changes of Metabolites during the Withering Process of White Tea Based on HILIC LC-QqQ MS Method

CHEN Xiang, TIAN Yueyue, ZHANG Lixia*

College of Horticulture and Engineering, Shandong Agricultural University, Tea Engineering and Technological Research Center, Tai'an 271018, China

In this study, the metabolic profiles of fresh leaves (F), two indoor withered samples for 29?h (W) and 53?h (P) respectively were investigated by HILIC-QqQ MS based targeted metabolomics. Totally 111 metabolites were detected in the QC sample, including 47 amino acids and their derivatives, 29 nucleic acid metabolites, 12 vitamins and coenzymes, 17 sugar metabolites and 6 glycerophospholipid metabolites. Compared with the fresh leaves (F), 39 and 41 metabolites were significantly increased in withered samples W and P, with 35 overlapped metabolites. On the other hand, 9 and 11 metabolites were dramatically reduced, with 8 overlapped metabolites. The metabolite changes suggested that the cell membranes were damaged, DNA and RNA were degraded, amino acids derivatives were significantly increased and glucose metabolism was abnormal. Furthermore, according to the variations of metabolite contents and compositions, the marker metabolites of the withered leaves were identified which could reflect the physiological states of cell membrane, nucleic acid and glucose metabolism. Eventually, based on the characteristic changes in amino acids and nucleotides, the necessities of characterizing the flavor properties of amino acids and their derivatives as well as exploring the possibility of using metabolic profiling as white teawithering standardswere proposed.

white tea, withering, targeted metabolic profiling

S571.1；O657.63

A

1000-369X(2020)02-238-12

2019-08-30

2019-12-23

山東省高校“雙一流”建設(shè)團隊（SYL2007YY03）

陳翔，男，碩士研究生，主要從事茶葉加工與品質(zhì)化學(xué)方面的研究，592063686@qq.com。*通信作者：lxzhang@sdau.edu.cn

投稿平臺：http://cykk.cbpt.cnki.net