香茅草揮發(fā)物及其主要成分對3種茶樹病原真菌的抑制性研究

楊文，劉惠芳，陳瑤，蘇生，李天興，劉垚果，周玉鋒*

香茅草揮發(fā)物及其主要成分對3種茶樹病原真菌的抑制性研究

楊文1，劉惠芳1，陳瑤1，蘇生2，李天興3，劉垚果3，周玉鋒1*

1. 貴州省農業(yè)科學院茶葉研究所，貴州 貴陽 550006；2. 貴州省農業(yè)科學院草業(yè)研究所，貴州 貴陽 550006；3. 貴州大學茶學院，貴州 貴陽 550025

采用固相微萃取和氣相-質譜聯(lián)用儀檢測了香茅草鮮草莖和葉的揮發(fā)成分，分析確定了香茅草鮮草莖和葉中共51種揮發(fā)成分，主要成分為檸檬醛[包含()-檸檬醛與(Z)-檸檬醛]和香葉醇，莖中相對含量分別為81.39%（58.48%和22.91%）和4.79%；葉片中相對含量分別為78.50%（51.63%和26.87%）和3.68%。采用菌絲生長速率法，研究了檸檬醛和香葉醇分別對茶樹炭疽病病原菌（）、輪斑病病原菌（）、褐芽病病原菌（）的抑制活性。活性初測結果表明，500?mg·L-1處理96?h，兩種成分對供試輪斑病病原菌抑制率均低于56%；而對供試茶炭疽病和褐芽病病原菌的抑制率均可達100%。進一步活性測試結果表明，檸檬醛對茶炭疽病和褐芽病病原菌的抑制中濃度（EC50）值分別為(230.56±3.49)?mg·L-1和(124.79±10.29)?mg·L-1；香葉醇對兩種病原菌的EC50值分別為(238.38±5.51)?mg·L-1和(115.38±10.96)?mg·L-1。本研究初步明確了香茅草鮮草揮發(fā)成分及其對茶樹病害病原菌抑制活性的主要物質基礎，為茶園種植香茅草具有潛在防病害作用提供了理論依據(jù)。

香茅草；揮發(fā)成分；茶樹；抑菌

我國茶產業(yè)進入集約化階段后，茶園種植面積迅速擴大，茶區(qū)生態(tài)系統(tǒng)趨向簡單化，茶園生物多樣性低、食物鏈簡單，生態(tài)功能和組分均簡單化，容易導致病蟲害暴發(fā)[1-2]。很長時間內，茶園病蟲害的防控主要依靠化學農藥，不僅導致農藥殘留、抗性和再度猖獗“3R問題”，以及害蟲種群發(fā)生明顯的演替，而且導致茶園中天敵的種類和數(shù)量顯著降低，茶園生態(tài)平衡遭到破壞[1]。隨著我國化學農藥減施增效戰(zhàn)略實施，茶園減施化學農藥也成為必然趨勢。為了有效減少茶園化學農藥的使用，采用生態(tài)調控措施是未來茶園防控的必然選擇[3]，其中選用相關植物對現(xiàn)有純茶樹茶園進行生態(tài)改造，構建復合生態(tài)茶園來實現(xiàn)茶樹病蟲害種群數(shù)量控制是重要方法之一。為此，構建具調控茶樹病蟲害作用的“林-茶-草”復合生態(tài)茶園是關鍵。

近年來，植物揮發(fā)性物質在植物與植食性昆蟲互作的化學生態(tài)學研究中受到廣泛關注。植物揮發(fā)性物質的許多組分具有抗菌活性，在抵御病原菌侵入和擴展的防衛(wèi)策略中也具有潛在的生理功能[4]。篩選出含驅蟲殺菌揮發(fā)性物質的草本植物是構建具有驅蟲殺菌功能“林-茶-草”復合生態(tài)茶園的基礎。

香茅草[(DC.) Stapf]，別名檸檬草，大多種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)，是提取精油的一種原料[5]。香茅草全草蒸餾而得的香茅油對相關農業(yè)害蟲有胃毒、拒食、忌避活性；也具有抗真菌、細菌的作用，具備開發(fā)為植物性農藥的潛質[4,6-7]。已有研究表明，香茅草或其提取的精油中含有多種揮發(fā)性化學成分，其中檸檬醛（含橙花醛和香葉醛）、香葉醇、月桂烯、香茅醛、香茅醇等化合物是相關報道的常見成分[6,8-16]。相關研究開展了香茅油及其主要成分對植物病害病原菌的抑制活性[17-22]，但對茶樹病害病原菌的抑制作用鮮見報道。本文主要研究香茅草鮮草的揮發(fā)成分及其主要成分對茶樹炭疽病、輪斑病和褐芽病病原菌的抑制作用，為利用香茅草構建具有有效防病害功能的生態(tài)茶園提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

香茅草鮮草：2018年10月8日采集于貴州省草業(yè)研究所獨山縣資源圃，采樣時先澆足水，2?h后帶土全株取回實驗室。

供試菌株為茶樹炭疽病病原菌（）、茶輪斑病病原菌（）和茶褐芽病病原菌（），3種菌株由貴州省茶葉研究所分離鑒定保存。

97%檸檬醛和98%香葉醇購于上海阿爾法生物技術有限公司。2.1%丁子·香芹酚水劑由大連云林碳化藥業(yè)有限公司生產。

1.2 主要儀器

儀器：HP6890/5975C氣相-質譜聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）。手動固相微萃取裝置（美國Supelco公司），萃取纖維為：2?cm-50/30?μm DVB/CAR/PDMS Stableflex。

1.3 試驗方法

1.3.1樣品處理與檢測

將香茅草鮮草的莖和葉分別剪碎，各取0.5?g置于10?mL固相微萃取儀采樣瓶中，將采樣瓶放入60℃的水浴中，磁力攪拌器攪拌（轉速100?r·min-1）。插入裝有2?cm-50/30?μm DVB/CAR/PDMS Stableflex纖維頭的手動進樣器，頂空萃取40?min后，移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進樣口（溫度250℃）中，熱解析5?min后進樣。

色譜條件：色譜柱為FB-5MSI（30?m×0.25?mm×0.25?μm）彈性石英毛細管柱，柱溫40℃（保持4?min），以3℃·min-1升溫至160℃，再以15℃·min-1升溫至280℃，運行時間：52?min；汽化室溫度250℃；載氣為高純He（99.999%）；柱前壓7.62?psi，載氣流量1.0?mL·min-1；不分流進樣；溶劑延遲時間：1?min。

質譜條件：離子源為EI源；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電子能量70?eV；發(fā)射電流34.6?μA；倍增器電壓1?565?V；接口溫度280℃；質量范圍29~500?amu。

1.3.2室內生物活性測定

采用生長速率法[23]測定室內生物活性。在藥劑初篩的基礎上選出5個有效濃度梯度，配置成相應的含毒PDA培養(yǎng)基，用5?mm的打孔器在菌落邊緣打孔，將菌餅放入到培養(yǎng)皿中央，使帶菌絲與PDA培養(yǎng)基面相接觸，以含0.1%吐溫80和5%無水乙醇無菌水溶液作對照，每個處理4個重復。置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)96?h，采用十字交叉法測得菌絲體生長直徑，計算對茶樹褐芽病、炭疽病和輪斑病病菌生長的抑制率，求出毒力回歸方程及抑制中濃度（EC50）。抑制率計算公式如下。

生長抑制率=[（對照菌落直徑－菌餅直徑）－（處理菌落直徑－菌餅直徑）]÷（對照菌落直徑－菌餅直徑）×100%

1.3.3 活性測定數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

根據(jù)上述公式計算抑制率，毒力回歸方程、抑制中濃度、相關系數(shù)和共毒系數(shù)的計算方法參照李建明等[24]的方法。

2 結果與分析

2.1 香茅草揮發(fā)性成分分析

經(jīng)固相微萃取和氣相-質譜聯(lián)用儀檢測，香茅草莖和葉片中揮發(fā)性成分氣相色譜總離子流見圖1。對總離子流圖中的各峰經(jīng)質譜計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對Nist 2014和Wiley 275標準質譜圖，用峰面積歸一化法測定各化學成分的相對含量。

分析結果確定了香茅草鮮草中共51種揮發(fā)性化學成分（表1），其莖和葉中分別含42種和43種。香茅醇、-葎草烯、丁酸香葉酯等9種化合物僅于莖中檢出；()-3-己烯醛、()-2-己烯醛、2,3-環(huán)氧香葉醛等8種化合物僅于葉片中檢出；6-甲基-5-庚烯-2-酮、-月桂烯、羅勒烯、芳樟醇、香茅醛、香葉醇、檸檬醛等34種化合物在莖和葉中均檢出。香茅草莖和葉揮發(fā)性成分中相對含量大于或等于1%的組分均有5種，主要成分為()-檸檬醛（橙花醛）、()-檸檬醛（香葉醛）和香葉醇。莖中3種成分的相對含量分別為58.48%、22.91%和4.79%，葉中3種成分相對含量分別為51.63%、26.87%和3.68%；莖中()-檸檬醛和香葉醇的相對含量較葉片中分別高6.85%和1.11%，而葉片中()-檸檬醛的相對含量含較莖中高3.96%。

2.2 主要成分抑菌活性分析

2.2.1主要成分抑菌活性初測結果

檸檬醛和香葉醇的抑菌活性初測結果見表2。當濃度為500?mg·L-1時，處理96?h，兩種成分對茶炭疽病病原菌和茶樹褐芽病病原菌菌絲的抑制率可達100%，兩種成分對茶輪斑病病原菌菌絲的抑制率均低于56%。由此可見，檸檬醛和香葉醇對茶炭疽病病原菌和褐芽病病原菌表現(xiàn)較好抑制活性，而對茶樹輪斑病病原菌的抑制活性較差。

注：A 為莖，B 為葉 Note: A: Stem. B: Leaf

表1 香茅草莖和葉中揮發(fā)性成分

續(xù)表1

2.2.2 主要成分對茶樹炭疽病病原菌的毒力

根據(jù)抑菌活性初測結果，選擇已登記植物源殺菌劑2.1%丁子·香芹酚水劑為對照藥劑，進一步測試檸檬醛和香葉醇對茶樹炭疽病病原菌的活性。檸檬醛和香葉醇的起始濃度為300?mg·L-1，均按1.1倍稀釋；2.1%丁子·香芹酚水劑的起始濃度為5?000?mg·L-1，按1.3倍稀釋。由表3可知，處理炭疽病病原菌96?h，檸檬醛、香葉醇和2.1%丁子·香芹酚水劑對茶炭疽病病原菌的EC50值分別為230.56、238.38、2?339.30?mg·L-1。檸檬醛對茶炭疽病病原菌的抑制活性略高于香葉醇，檸檬醛和香葉醇對茶炭疽病病原菌的抑制活性均明顯高于對照藥劑（2.1%丁子·香芹酚水劑）。

2.2.3主要成分對茶樹褐芽病病菌的毒力

根據(jù)抑菌活性初測結果，選擇已登記植物源殺菌劑2.1%丁子·香芹酚水劑為對照藥劑，進一步測試了檸檬醛和香葉醇對茶樹褐芽病病原菌的抑制活性。檸檬醛的起始濃度為200?mg·L-1，按1.2倍稀釋；香葉醇的起始濃度為210?mg·L-1，按1.3倍稀釋；2.1%丁子·香芹酚水劑的起始濃度為5?000?mg·L-1，按1.2倍稀釋。由表4可以看出，處理茶樹褐芽病病原菌96?h，檸檬醛、香葉醇和2.1%丁子·香芹酚水劑的EC50值分別為124.79、115.38、2?709.29?mg·L-1。檸檬醛對茶樹褐芽病病原菌的抑制活性略低于香葉醇，檸檬醛和香葉醇對茶樹褐芽病病原菌的抑制活性均明顯高于對照藥劑（2.1%丁子·香芹酚水劑）。

表2 供試化合物處理后96?h對3種供試菌的抑制率

表3 供試物質處理后96?h對茶炭疽病病原菌的毒力

表4 供試物質處理后96?h對茶樹褐芽病病菌的毒力

3 討論

香茅草別名為檸檬草，是香茅屬多年生草本植物，廣泛分布在熱帶、亞熱帶地區(qū)，在我國主要分布于云南、廣東、廣西、海南等地[25]。香茅草揮發(fā)物成分研究報道較多，綜合分析已有相關研究報道[6,8-11]發(fā)現(xiàn)，檢測分析香茅草中的揮發(fā)性成分主要有兩種方式，一是采用各種提取方法提取香茅精油，然后采用GC-MS檢測分析其化學成分；二是采用頂空固相微萃取和氣相色譜-質譜檢測分析香茅草揮發(fā)性成分。其中，各種提取方法所得香茅草揮發(fā)油的化學組成很復雜，包括醛類、醇類、酚類、脂類、萜烯類和酮類等化合物；主要為檸檬醛（含香葉醛和橙花醛）、香葉醇、-月桂烯、香葉酸和芳樟醇，其總和約占精油總質量的70%~96%。利用第二種方法開展的研究報道中，黎華壽等[26]分析了廣州6月份活體全株香茅草中揮發(fā)成分，其中檢出莖葉揮發(fā)物有12種，主要為檸檬醛（總相對含量達88.38%），其次為乙酸香葉酯（相對含量為3.68%）；楊文秀等[27]分析了云南西雙版納12月份香茅草葉片中揮發(fā)成分，共鑒定出18種成分，主要為-月桂烯、香葉醛和橙花醛，相對含量分別為36.24%、25.28%和19.16%；胡彥等[9]分析了云南文山香茅草干燥莖葉粉碎物揮發(fā)性成分，所檢出50種成分中，主要成分為香茅醛、乙酸香葉酯、大香葉烯D-4-醇、乙酸香茅酯、香葉醇、香茅醇和大根香葉烯D等成分，其相對含量分別為34.69%、11.02%、9.48%、7.02%、6.67%、6.24%和3.68%。上述兩種檢測分析方式中，第一種方式需經(jīng)提取和濃縮兩個實驗步驟，且濃縮過程中相關揮發(fā)成分易損失，從而影響其種類和含量；第二種檢測方式更加簡便準確。

為了更加真實檢測香茅草揮發(fā)成分及其含量，本研究將香茅草全株帶土取回實驗室，采用固相微萃取和氣相-質譜聯(lián)用儀，分別檢測了香茅草鮮草莖和葉的揮發(fā)性成分。分析確定了香茅草鮮草全草中共51種揮發(fā)性化學成分，其莖和葉中分別含42種和43種。香茅草莖和葉揮發(fā)性主要成分為()-檸檬醛（橙花醛）、()-檸檬醛（香葉醛）和香葉醇，莖中3種成分的相對含量分別為58.48%、22.91%和4.79%，葉中3種成分相對含量分別為51.63%、26.87%和3.68%。本研究結果所檢出主要成分為檸檬醛，與黎華壽等[26]和楊文秀等[27]的研究結果相似；但本研究檢出成分種類明顯多于二者，這可能是產地和檢測時期不同所致。對比胡彥等[9]報道的香茅草干燥莖葉粉碎物的主要成分及其含量結果，與本研究檢測主要成分和含量均存在較大差異，可能是香茅草產地和原材料鮮干各異導致。利用干燥的香茅草進行檢測，在香茅草干燥的過程中，部分成分可能會揮發(fā)，甚至可能發(fā)生成分的轉化，因此利用干燥的香茅草進行檢測不能真實體現(xiàn)其內源揮發(fā)成分。

香茅草作為一種藥食兩用資源，越來越受到相關領域的重視[28]。在農藥領域，較為成功的應用是將香茅草開發(fā)為驅蚊劑，制成驅蚊貼、驅蚊手環(huán)等[25]。相關研究也報道了香茅草天然產物對植物病原真菌的抑制活性，特別是香茅精油對植物病原真菌活性研究報道較多，如番茄茄鐮孢菌、桔青霉菌、蘋果青霉病菌、黃瓜腐霉菌、辣椒尖孢鐮刀菌、小麥鐮孢菌、辣椒疫霉、棉花枯萎病菌和花生冠腐病菌等[17-22]。

本研究結合檢測結果，選取了香茅草中的主要成分檸檬醛和香葉醇作為供試化合物，研究了其對茶樹炭疽病、輪斑病和褐芽病病原菌的抑制活性。結果表明，檸檬醛和香葉醇對茶樹輪斑病病原菌的抑制活性較差，500?mg·L-1處理后96?h，其抑制率低于56%。兩種成分對茶炭疽病和褐芽病病原菌表現(xiàn)較好抑制活性，其中檸檬醛對兩種病原菌的EC50分別為(230.56±3.49)、(124.79±10.29)?mg·L-1，香葉醇對兩種病原菌的EC50分別為(238.38±5.51)、(115.38±10.96)?mg·L-1。研究結果明確了香茅草莖和葉主要揮發(fā)性成分檸檬醛和香葉醇對茶樹炭疽病和褐芽病病原菌具較好抑制活性。

茶樹炭疽病是茶園中普遍發(fā)生的真菌病害，為害嚴重，造成茶樹產量與茶葉品質的下降。該病害屬高溫高濕型病害，雨濕對分生孢子的傳播和萌發(fā)最為重要，全年多發(fā)生在5月—6月和9月—10月[29]。茶樹褐芽病是貴州湄潭和鳳岡茶區(qū)發(fā)生的一種茶樹新病害，主要為害茶樹幼嫩芽葉，導致芽頭基部褐變、葉莖交界處產生褐色病斑、葉片脫落；發(fā)生嚴重的茶樹枝條后期會鈍縮，以致新芽出芽率低或為畸形芽；感病芽葉采摘離體后會整芽變黑，茶青無法出售，導致茶農減產減收；全年以6月初至8月中下旬發(fā)生嚴重[30]。此兩種病害均屬高溫型病害，其發(fā)生季節(jié)也適于香茅草青割，同時高溫天氣有助于檸檬醛和香葉醇從香茅草青割傷口中揮發(fā)出來。因此，茶園種植香茅草實現(xiàn)茶樹炭疽病和褐芽病的防控具理論可行性。

生態(tài)茶園建設已成為目前茶園建設的基本要求。篩選出含驅蟲殺菌揮發(fā)性物質的草本植物是構建具驅蟲防病功能的“林-茶-草”復合生態(tài)茶園的關鍵之一。至今，茶園種植香茅草防治茶園病蟲害的實踐方面，僅見相關新聞媒體報道了臺灣茶業(yè)改良場在茶園中種植香茅草，有助驅離茶樹害蟲、減少蟲害；但鮮見相關研究性文獻報道。本研究僅證實了茶園種植香茅草防治茶樹炭疽病和褐芽病的理論可行性，但茶園種植香茅草對茶樹相關病害的實際防效需進一步田間試驗研究證實。

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Volatile Components fromand the Activity Research on Their Main Elements Against Three Fungal Pathogens of Tea

YANG Wen1, LIU Huifang1, CHEN Yao1, SU Sheng2, LI Tianxing3, LIU Yaoguo3, ZHOU Yufeng1*

1. Guizhou Tea Institute, Guizhou Academy of Agricultural Sciences, Guiyang 550006, China; 2. Guizhou Institute of Pratacultural, Guizhou Academy of Agricultural Sciences, Guiyang 550006, China; 3. Tea College of Guizhou University, Guiyang 550025, China

The volatile components from(DC.) Stapf were extracted by solid phase microextraction and analyzed by gas chromatography mass spectrometry. Fifty one volatile components from stems and leaves were identified. Citral [Contains two compounds ()-citral and ()-citral] and geraniol were found to be the major components. Their relative contentsin stems were 81.39%(58.48% and 22.91%) and 4.79%, respectively. Meanwhile, the contentsin leaves were78.50% (51.63% and 26.87%) and 3.68%, respectively.The activities of citral and geraniol to,andwere determined using mycelium growth rate method. The preliminarily test results showthat the inhibition rate of the two compounds againstwere lower than 56% under the tested concentration of 500?mg·L-1for 96?h.Bycontrast, they exerted high activities againstandwith a inhibition rate of 100%.Further evaluated results showthat the EC50of citral toandwere (230.56±3.49)?mg·L-1and (124.79±10.29)?mg·L-1, respectively. The EC50of geraniol to the two fungi were (238.38±5.51)?mg·L-1and (115.38±10.96)?mg·L-1, respectively. The present study preliminarily revealed the volatile components ofand the main active fractions against two pathogenic Fungi on tea. The results could provide a theoretical basis for the potential disease prevention ofthe interplantingofand tea.

, volatile components, tea, fungicidal

S571.1；S435.711

A

1000-369X(2020)02-269-10

2019-07-18

2019-08-20

國家現(xiàn)代農業(yè)（茶葉）產業(yè)技術體系建設專項資金項目（CARS-19）、貴州省農業(yè)攻關項目（黔科合支撐[2016]2550號、黔科合支撐[2018]2551號）、黔農科院自主創(chuàng)新科研專項字（2014）009、黔農科院青年基金[2017]14號

楊文，男，副研究員，主要從事茶樹病蟲害及其防控方面的研究，E-mail：yangwen3409@126.com。*通信作者：gzzhouyf@sohu.com

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