基于網絡藥理學探討丹參通絡方治療冠心病血瘀證的機制＊

胡 駿，陳恒文，廖江銓，談鈺濛，劉蘭椿，王 階＊＊

（1. 中國中醫科學院廣安門醫院 北京 100053；2. 中日友好醫院 北京 100029；3. 北京中醫藥大學研究生院 北京 100029）

冠心?。–oronary heart disease，CHD）是指由于冠狀動脈及其分支發生粥樣硬化或痙攣，使管腔狹窄或阻塞，導致心肌缺血、缺氧而引起的心臟病變[1]。近年來，我國冠心病的發病率、死亡率日趨提高，且呈年輕化趨勢，其住院患者的比例呈逐年上升的趨勢，已成為我國乃至全球的重大公共衛生問題[2，3]。冠心病屬于中醫“胸痹”“心痛”“真心痛”等病范疇，病機為“本虛標實”，本虛以氣虛為主、標實以血瘀為主[4]，血瘀證作為冠心病的基本證型之一，其主要表現包括了胸痛位置固定，舌質紫暗，有瘀斑瘀點，以及冠狀動脈狹窄、冠狀動脈血栓等[5]。故活血化瘀法是冠心病治療的基本法則，丹參通絡方是由丹參、三七、銀杏葉3 味藥組成，全方具有活血化瘀的功效，可用于治療冠心病血瘀證。

冠心病血瘀證證候生物學基礎的研究開始于上世紀70年代，經過幾十年的積累，成果斐然。宏觀層面上，冠心病血瘀證即是人體各級血管出現結構及功能異常的外在表現[6，7]；病理生理層面也已證實，冠心病血瘀證與微循環障礙[8]、血流動力學功能異常[9]、凝血功能障礙關系密切[10]；而炎癥因子及其他相關細胞因子的異常過表達則在分子水平上進一步詮釋了冠心病血瘀證的內涵[11]。近年來，基因組學、蛋白組學、代謝組學等生物技術的高速發展，為冠心病血瘀證提供了新的研究方法。通過生物信息學方法，篩選出冠心病血瘀證所特有的基因、蛋白質以及代謝產物，根據其之間的調控關系，可以構建出冠心病血瘀證的調控網絡，從多角度、深層次揭示冠心病血瘀證的本質。網絡藥理學即是通過對生物網絡進行分析，并與藥物作用靶點的網絡進行整合，構建“藥物成分-靶點-疾病網絡”，綜合研究藥物作用機制的一種方法[12，13]。目前，將網絡藥理學應用于中醫證候的研究已經取得一定的進展，如李梢等[14]發現寒證網絡以激素為主，熱證網絡以免疫因子為主，且與寒證、熱證相關的基因均存在于神經活性配體-受體相互作用的信號通路中。本研究結合課題組前期成果，發揮中醫“病證結合”的特色，將冠心病的靶基因與血瘀證靶基因取交集作為疾病靶基因，旨在運用網絡藥理學探討丹參通絡方治療冠心病血瘀證的可能機制，為中藥新藥研發等提供思路。

1 方法

1.1 篩選有效成分及靶點

檢索TCMSP 數據庫[15]（https://tcmspw.com/tcmsp.php/）和TCMID 數 據 庫（https://119.3.41.228: 8000/tcmid/）得到丹參通絡方中丹參、三七、銀杏葉3味藥的成分。TCMSP 數據庫中包含了500 余種常見中藥、30000多個中藥化合物及其藥代謝動力學、藥物-靶標蛋白網絡-疾病網絡信息，TCMID 數據庫包含了47000余種中藥方劑、8000余種中藥、25000余種化合物及其個對應的疾病信息[16]。TCMID數據庫的優勢在于其中藥品種更加齊全，而TCMSP數據庫的中藥化學成分信息更加全面，實際操作中一般綜合考慮2 個數據庫信息。同時查閱文獻，補充該方治療冠心病血瘀證可能的其他有效成分。由于中藥的成分復雜，結構多樣，需設置生物利用度OB ≥30%和類藥性DL ≥0.18篩選出活性成分。運用TCMSP 數據庫以及ChEMBL 數據庫（https://www.ebi.ac.uk/chembl/）預測丹參通絡方活性成分的靶基因。ChEMBL化合物靶標作用平臺是用于預測已知的化合物和蛋白質相互作用關系的平臺，應用較多。將獲得的靶點應用UniProt 數據庫（https://www.uniprot.org/）校正統一命名。

1.2 獲取丹參通絡方治療冠心病血瘀證的靶基因

1.2.1 冠心病血瘀證差異基因的獲取

選取2015年5月-2016年1月于中國中醫科學院廣安門醫院心血管科門診及病房診斷為冠心病不穩定型心絞痛的患者進行證型診斷。冠心病不穩定型心絞痛診斷標準參照2011年ACCF/AHA 制定的《不穩定型心絞痛/非ST 段抬高型心肌梗死診療指南更新》[17]；血瘀證診斷標準參照1988年王階、陳可冀制定的《血瘀證診斷標準量表》[18]，根據量表進行評分，≥19分為血瘀證，＜19分為非血瘀證。冠心病不穩定型心絞痛患者根據其證型診斷納入冠心病血瘀證組（A組）和冠心病非血瘀證組（B組），另外，選取中國中醫科學院廣安門醫院體檢中心健康查體者作為健康對照組（N 組），每組各20 例。每組5 例用于mRNA 高通量測序，將各組測序結果兩兩導入Cufflinks 軟件，使用Cuffdiff 命令篩選出差異基因。將A 組和B 組之間的差異基因以及A組和N組之間差異基因取交集則獲得冠心病血瘀證差異基因。剩余15 例標本用于熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，QRT-PCR）驗證其中的關鍵差異基因[19，20]。

1.2.2 冠心病血瘀證靶基因的獲取

在GeneCards數據庫[21]（https://www.genecards.org/）中搜索冠心病的關鍵詞“coronary heart disease”，與冠心病血瘀證差異基因取交集，作為冠心病血瘀證的靶基因，將丹參通絡方活性成分的靶基因與疾病基因取交集，得到丹參通絡方組方干預冠心病血瘀證的可能靶基因，并繪制韋恩圖。

1.3 構建藥物-成分-靶點-疾病網絡

將冠心病血瘀證的靶基因與篩選出的丹參通絡方活性成分映射，創建包含“疾病-靶點”“藥物-靶點”“藥物-成分”的“network”文件及描述節點類型的“type”文件，將兩個文件導入Cytoscape 3.7.2 軟件，繪制“成分-靶點-疾病”的交互網絡圖。網絡中的節點（node）代表活性成分、關鍵靶基因及冠心病血瘀證，邊（edge）代表上述節點間的相互作用關系。

1.4 構建蛋白-蛋白相互作用（PPI）網絡

利用STRING 數據庫（https://string-db.org/）整合預測蛋白質-蛋白質相互作用，可視化展示蛋白質-蛋白質相互作用網絡功能[22]。選擇“multiple proteins”輸入關鍵靶基因，對“Homo sapiens”進行檢索，選擇0.40置信度，得到核心靶蛋白的相關信息。

1.5 基因本體GO及KEGG通路富集分析

利用R 軟件（Version 3.6.1）和Bioconductor 軟件包對靶基因進行靶基因GO 與KEGG 功能富集分析，以P＜0.05作為篩選條件，并將結果以條形圖形式輸出。

2 結果

2.1 丹參通絡方有效成分及靶基因

在TCMSP 以及TCMSID 數據庫中檢索丹參通絡方的所有有效成分，以OB ≥30%和DL ≥0.18 進行篩選，篩選得到丹參活性成分65 個，三七活性成分8 個，銀杏葉活性成分27 個，查閱文獻[23，24]補充活性成分4個：人參皂苷Rg1（Ginsenoside Rg1）、人參皂苷Rb1（Ginsenoside Rb1）、人參皂苷Re（Ginsenoside Re）、三七皂苷（Notoginsenoside R1），共99 個活性成分。利用TCMSP 數據庫和ChEMBL 數據庫獲得丹參對應靶點61 個，三七對應靶點178 個，銀杏葉對應靶點118 個，經Uniprot統一校正并去重后，共得到丹參通絡方活性成分對應靶點214個。

2.2 治療冠心病血瘀證的相關基因

通過GeneCards 獲得6785 個冠心病相關基因，課題組前期通過高通量測序篩選出冠心病血瘀證差異基因221 個，兩者取交集作為冠心病血瘀證的靶點共84個（表1）。與丹參通絡方活性成分的靶基因去重后進行映射，共得到8 個丹參通絡方治療冠心病血瘀證的活性成分：木犀草素（Luteolin）、丹參酮IIA（Tanshinone IIA）、甘草素（DFV）、鄰苯二甲酸二異辛酯（Diop）、β-谷甾醇（β-Sitosterol）、豆甾醇（Stigmasterol）、人參皂苷Rh2（Ginsenoside Rh2）、槲皮素（Quercetin）（表2）以及7 個對應靶基因：ADRB2、NFKBIA、FOS、JUN、ERBB2、CXCL8、INSR（圖1）。

表1 冠心病血瘀證靶點

表2 丹參通絡方治療冠心病血瘀證的活性成分

2.3 藥物-成分-靶點-疾病網絡構建

利用Cytoscape（3.7.2）軟件構建的活性成分-靶點-疾病網絡（圖2）。大圓圈8 個黃色節點代表丹參通絡方3種中藥的活性化學成分。7 個紅色三角形節點代表丹參通絡方與冠心病血瘀證交集靶點。網絡拓撲學分析結果為網絡集中度0.337，網絡密度0.199，網絡異質性0.561，最短路徑342（100%）。根據網絡節點 的 度 值（degree）和 中 介 中 心 度（Betweenness centrality）進行分析，排名前五的活性化合物中分別是：槲 皮 素（Quercetin），degree 9，中 介 中 心 度：0.40715445；木犀草素（Luteolin），degree 4，中介中心度：0.07917237；丹參酮IIA（Tanshinone IIA），degree 3，中介中心度：0.05050913；β-谷甾醇（β-Sitosterol），degree 3，中介中心度：0.01817017；人參皂苷Rh2（Ginsenoside Rh2），degree 2，中介中心度：0.02445673。7個靶基因排名分別是ADRB2，degree 6，中介中心度：0.19730598；NFKBIA，degree 5，中 介 中 心 度：0.17702002；FOS，degree 3，中介中心度：0.05380434；ERBB2，degree 3，中 介 中 心 度：0.04583293；JUN，degree 3，中介中心度：0.02999081；CXCL8，degree 2，中介中心度：0.00216269；INSR，degree 2，中介中心度：0.00216269。

圖1 丹參通絡方治療冠心病血瘀證靶基因Venn圖

圖2 丹參通絡方活性成分-靶點-冠心病血瘀證網絡圖

2.4 蛋白-蛋白相互作用（PPI）網絡構建

通過STRING 構建丹參通絡方與冠心病血瘀證的交集靶點的PPI 網絡圖（圖3），其中節點代表靶蛋白，邊代表靶蛋白間的作用關系，圖中節點所連接的邊的數量越多則說明該蛋白在互作網絡中的作用越顯著。排名前4 的靶蛋白為原癌基因蛋白（FOS）、白細胞介素-8（CXCL8）、受體酪氨酸激酶（ERBB2）、轉錄因子AP（JUN）。冠心病、血小板、炎癥三者聯系密切，吳彩鳳[25]研究發現IL-8 具有激活血小板的作用，對血小板的聚集、釋放功能均有一定程度的影響。因此，IL-8可能是通過影響血小板活化來參與了冠心病的發病。

2.5 關鍵靶基因GO功能富集

通過關鍵靶基因，共富集23 個生物學過程和功能，根據校正后P進行排序，選擇前20 個進行條形圖展示（圖4）。為控制假陽性率，對富集進行了校正，校正后P＜0.05 認為交集靶基因在該通路或GO 功能存在顯著富集情況。結果丹參通絡方有效成分主要參與R-Smad 蛋白結合、肽結合、RNA 聚合酶II激活轉錄因子結合、酰胺結合、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性等生物過程，進而發揮對冠心病的治療作用。

2.6 關鍵靶基因KEGG功能富集

對關鍵靶基因與KEGG 進行映射，共富集60 條通路，根據校正后P進行排序，選取與心血管疾病相關的前20個富集通路進行條形圖展示（圖5）。根據P值大小可推測，靶基因主要參與白介素-17 信號通路（IL-17 signaling pathway）、Toll 樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）、環磷酸腺苷信號通路（cAMP signaling pathway）及部分感染性疾病相關信號通路。

3 討論

丹參通絡方藥味少，配伍精當，對于冠心病血瘀諸證有較好的療效。姜文睿[26]選取40 例冠心病心絞痛心血瘀阻證患者隨機分為兩組，在常規西藥治療基礎上，治療組使用丹參通絡方，對照組使用安慰劑，結果治療組總有效率、心絞痛發作次數、心絞痛積分、硝酸甘油用量、中醫血瘀證療效等顯著優于對照組。在本研究中，丹參通絡方發揮治療作用的成分包括丹參酮IIA、槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、人參皂苷Rh2等。丹參功能祛瘀止痛，活血通經，清心除煩，能增加冠脈流量，是多種臨床用于治療心血管病的中成藥的主要藥味。藥理研究已表明，丹參酮IIA 磺酸鈉能夠降低冠心病患者溶栓后早期再灌注損傷，保護心肌，并能起到改善患者預后的作用[27]；活性成分β-谷甾醇具有鎮痛[28]、抑制血小板聚集[29]、抗動脈硬化[30]等多種生物學作用；人參皂苷Rh2 具有顯著的抗腫瘤、改善心肌缺血作用[31]。三七、銀杏葉中的有效成分槲皮素則具有降血壓、降血糖、降血脂、護心血管等作用[32]，但目前對槲皮素的研究多集中在動物實驗中，關于槲皮素的臨床研究較少。丹參、銀杏葉中含有的木犀草素具有降血脂、預防胰島素抵抗、減少心肌細胞的凋亡等多種生物學作用[33]。

圖3 交集靶蛋白的PPI網絡圖

圖4 關鍵靶基因GO功能富集

圖5 關鍵靶基因KEGG功能富集

現有研究可以證實網絡圖中部分活性成分-靶點的對應關系。如腦缺血再灌注后有NF-κB 的持續高表達，而槲皮素能有效降低NF-κB 的激活，對急性腦缺血再灌注有保護作用[34]。丹參酮IIA 可以抑制AngII誘導的心肌細胞肥大，這可能與其抑制了原癌基因FOS 和JUN 的表達有關[35]；丹參酮IIA 也具有降低阿爾茨海默病模型大鼠的NF-κB 的表達水平的作用[36]。人參皂苷Rh2 可以抑制肝癌細胞的增殖，并且對肝癌細胞EGFR 的表達具有明顯的抑制作用[37]。根據網絡節點的拓撲學參數degree分析出的排名靠前的靶基因包括ADRB2、NFKBIA、FOS、ERBB2、JUN。已有研究顯示，上述部分治療靶點與冠心病具有相關性。有研究顯示，心肌梗死或冠狀動脈疾病患者中ADRB2基因突變頻率比健康者更高[38]。NFKBIA 過表達可以降低心肌細胞凋亡，并增強心肌細胞活力[39]；NFKBIA 的基因多態性也與新疆漢族、維吾爾族人群的冠心病易感性相關[40]。

實驗研究顯示，丹參注射液能夠阻斷IL-23/IL-17反應軸，可以降低博萊霉素誘導的大鼠肺纖維化程度[41]；三七總皂具有降低哮喘小鼠氣道炎癥反應的作用，顯著降低哮喘小鼠肺組織中IL-17 表達量[42]；銀杏葉提取物能夠調節潰瘍性結腸炎模型小鼠腸道炎癥反應，使結腸組織中IL-17 等炎癥因子的染色減少[43]。血瘀是多種疾病的共同的病因病機，炎癥是機體對有害刺激的一種防御性反應。目前大量研究已經證實，冠心病血瘀證與炎癥關系密切，一方面是因為炎癥反應可導致血管內皮損傷，促進冠狀動脈粥樣硬化斑塊的形成；另一方面，血管內皮細胞損傷使炎癥受體激活，白細胞介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎性因子大量分泌[44]，能進一步加重血管內皮的損傷，形成血栓，導致斑塊破裂等。如彭菊琴等[45]研究發現，冠心病血瘀證積分水平與超敏C 反應蛋白（hs-CRP）存在相關性，且隨著積分水平的提高，hs-CRP 水平有遞增趨勢。周菁等[46]發現與冠心病氣虛證患者相比，血瘀證患者的炎癥反應更為嚴重，使用加味血府逐瘀湯治療，能有效降低冠心病血瘀證患者白細胞介素-6（IL-6）、血管細胞黏附分子-1（VACM-1）和TNFα水平。丹參通絡方中的有效成分主要參與IL-17 信號通路、Toll 樣受體信號通路、cAMP 信號通路等相關信號通路。冠狀動脈粥樣硬化本質上是慢性炎癥反應的過程，其中IL-17 信號通路就是介導炎癥反應的信號通路，在冠心病的發生發展、血栓形成、多種不良心血管事件的發生中起到重要作用。另外，IL-17 在衰老小鼠中的表達顯著增加，與血管內皮細胞的衰老密切相關[47]，IL-17 在穩定型冠心病患者中的表達增加，能促進心室重構[48]。臨床研究顯示，血清IL-17 水平可為冠心病新的獨立危險因素[49，50]。

“病證結合”的診療模式由來已久，當代的“病證結合”是指借助現代醫學診斷疾病、通過中醫四診確立證候的中西醫結合的疾病診療模式[51]。所謂“證”即是指疾病過程中某一階段或某一類型的病理概括，傳統中醫受限于歷史條件，對“證”的認識停留在四診可得的癥狀、體征等外在表象的層面。隨著科學技術的進步，借助現代醫學手段，中醫學者對中醫“證”生物學基礎的研究不斷深入，使得通過檢測特異性的生物標志物診斷證候成為可能。通過證候的生物學基礎研究，尋找證候特異性的生物標志物，能夠規范中醫證候的臨床診斷；同時，證候生物標志物也應該是中藥發揮作用的靶點，可以實現基于證候的中藥精準治療，為中藥新藥研發提供新思路。由于目前仍缺少中醫證候相關的基因靶點數據庫等，影響了網絡藥理學預測中藥的作用機制及靶點、通路的準確性。受限于上述原因，以往的網絡藥理學研究多采用疾病的靶基因代替“病證結合”靶基因，預測結果較為寬泛，與實際情況也有偏差。本研究結合了前期研究結果，創新性的采用冠心病血瘀證基因作為靶基因，與以往研究相比，縮小了預測范圍，使得預測結果更加精準、更為可信。

綜上，本研究基于網絡藥理學的方法，構建丹參通絡方治療冠心病血瘀證的“藥物成分-靶點-疾病網絡”，篩選可能發揮作用的關鍵基因，并進行通路富集，推測丹參通絡方治療冠心病血瘀證可能與IL-17信號通路調控的炎癥反應密切相關。鑒于網絡藥理學為一種預測手段，會受制于數據來源的可靠性和可行性，另外，網絡藥理學的結果僅提示丹參通絡方與冠心病血瘀證的相關性，故在進行通路富集后，仍需實驗驗證通路上下游關鍵蛋白的表達水平，為后續深入研究冠心病的機制和中醫藥治療手段提供參考。

4 結論

本研究通過網絡藥理學方法，最終得到8 個丹參通絡方治療冠心病血瘀證的相關的有效成分，排名前五的分別是槲皮素、木犀草素、丹參酮IIA、β-谷甾醇、人參皂苷Rh2；7 個作用靶基因，ADRB2、NFKBIA、FOS、ERBB2、JUN、CXCL8、INSR。其有效成分主要參與R-Smad 蛋白結合、肽結合、RNA 聚合酶II激活轉錄因子結合、酰胺結合、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性等生物過程；主要涉及的信號通路為IL-17信號通路、Toll 樣受體信號通路、cAMP 信號通路等。因此，丹參通絡方治療冠心病血瘀證的機制具有多成分、多靶點、多通路的特點，該預測結果仍需進一步實驗驗證。