基于網絡藥理學研究瓜蔞薤白半夏湯治療冠心病的作用機制＊

譚雨晴，李 軍，陳恒文

（1. 中國中醫科學院廣安門醫院 北京 100053；2. 北京中醫藥大學研究生院 北京 100029）

冠心病又稱冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（Coronary atherosclerotic heart disease，CHD），是指由于冠狀動脈發生粥樣硬化病變致使血管管腔狹窄甚至閉塞，造成缺血缺氧損傷或壞死所致的心臟病[1]。目前，城鄉居民因心血管疾病死亡原因仍占居首位，日趨明顯的危險因素導致患病人數持續上增，根據推算我國心血管病目前患病人數2.9 億，其中冠心病高達1100 萬[2]。結合既往防治策略，注重二級預防和心臟康復，以綜合防控[3]。現代醫學干預冠心病主要有藥物、介入和外科手術等方法[4]，對于患者的癥狀有極大的改善。中醫藥干預冠心病也具備其特有優勢，如干預不能血運重建的冠心病及支架術后再狹窄等問題，也可以改善心功能、緩解缺血缺氧損傷、預防再狹窄、調節心率[5]。病證結合的模式融合了現代醫學的辨病和傳統醫學的辨證，可以貫穿整個疾病發展過程，準確對疾病的因、性、位、勢做出綜合判斷[6-7]。中醫學認為，冠心病屬于“痹”的范疇，病位在心，與其他臟腑密切相關，本虛標實，本虛有氣虛、陽虛、陰虛等；標實者為血瘀、痰濁、寒凝、氣滯等，為標，冠心病緩解期，痰瘀來疾去緩，聚濕成痰，膠著互結，疾病遷延不愈；元氣虧虛，無力行血亦可致痰瘀。痰瘀貫穿疾病發展歷程，痰瘀互結是常見證型[8-9]。

瓜蔞薤白半夏湯方出《金匱要略》，專為胸痹心痛而設，具有通心陽，散瘀滯、化痰濕、止痹痛的功效[10]。目前對于瓜蔞薤白半夏湯以單味藥或者藥對的作用機制研究較多，復方研究多以臨床研究為主，藥物作用機制尚未深入[11]，對于經典名方的開發利用造成了極大的阻礙。網絡藥理學的提出為中藥復方作用機制研究帶來了新的靈感與方法[12]。網絡藥理學借助于計算機系統，立足于疾病、單藥大數據的優勢，對中藥、化學成分、靶點信息、信號通路進行整合分析，與中醫復方整體調節，同病異治，異病同治的思想不謀而合[13]。基于此，本研究擬借助網絡藥理學的研究方法，構建“中藥-化合物-靶點-疾病”的網絡，初步分析瓜蔞薤白半夏湯治療冠心病的潛在作用機制，從復合網絡、生物功能、通路、分子等多個層面系統研究，為深入研究瓜蔞薤白半夏湯的實驗機制研究提供基礎和方向。

1 研究方法

1.1 瓜蔞薤白半夏湯主要活性成分獲取

檢索中藥系統藥理學數據庫和分析平臺TCMSP（https://tcmspw.com/index.php，Version 2.3），獲取瓜蔞薤白半夏湯的主要藥物的作用成分，分別收集瓜蔞、薤白、半夏的化合物，設定口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30% 且類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18 作為篩選條件，避免部分有效成分因不滿足OB 和DL 值設定條件被剔除，通過檢索論文查閱中國藥典對有效成分進行補充，檢索數據庫以“中國知網”（https://www. cnki. net/）、“ 萬 方 數 據”（http://wanfangdata.com.cn/index.html）為主，閱讀篩選文獻，提取瓜蔞薤白半夏湯干預心血管疾病的有效成分，匯總建立瓜蔞薤白半夏湯主要活性成分數據庫。

1.2 瓜蔞薤白半夏湯有效成分靶點預測

基于TCMSP平臺相關靶點預測功能，查找瓜蔞薤白半夏湯主要成分所對應的靶點信息，登陸Uniprot（https://www.uniprot.org/）數據庫，篩選物種信息為“homo sapiens”的數據，校正獲取的靶點蛋白，并將其轉換為標準基因名，創建瓜蔞薤白半夏湯靶點數據庫。

1.3 冠心病疾病靶點獲取

GeneCards 是一個集成數據庫，可檢索提供豐富的人類基因數據，在GeneCards 數據庫（https://www.genecards.org/，Version 5.0），以“coronary heart disease（冠心病）”為關鍵詞進行檢索，查找冠心病相關基因，導出Excel格式，篩選Relevance score（相關度）≥30的基因，創建冠心病疾病靶點數據庫。

1.4 瓜蔞薤白半夏湯靶蛋白PPI網絡構建

使用Cytoscape 3.7.2 軟件，將各化合物與對應的靶點進行關聯，構建“藥物-有效成分-作用靶點”網絡，合并瓜蔞薤白半夏湯靶點數據庫與冠心病疾病靶點數據庫，取交集，創建“成分-共同靶點”網絡；將交集 靶 點 導 入STRING（https://string-db.org/，Version 11.0）數據庫，選擇“homo sapiens”篩選，設定置信度為中等0.400，構建PPI 網絡，分析其網絡拓撲參數，得到關鍵靶點。

1.5 相關生物功能注釋和通路分析

為分析瓜蔞薤白半夏湯發揮藥理作用的主要信號通路及生物過程，將瓜蔞薤白半夏湯與冠心病映射靶點導入DAVID（https://david.ncifcrf.gov/，Version 6.8）生物信息平臺，對其進行GO（Gene ontology）功能和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析，以P值作為條件，篩選作用靶點可能參與生物學的途徑及通路，探討瓜蔞薤白半夏湯治療冠心病可能的作用機制。

1.6 瓜蔞薤白半夏湯主要活性成分與靶蛋白的分子對接

利用Uniprot 數據庫和RCSB PDB 蛋白質結構數據庫（https://www.rcsb.org/）查找關鍵靶點的PDB ID（Protein Data Bank Identification），獲取蛋白信息，利用Pymol 軟件處理分子結構，保存為pdb 格式。在TCMSP 數據庫下載靶點對應的藥物有效成分信息，保存為mol2 格式。利用SYBYL-X 2.0 軟件進行分子對接，通過獲取的Total score分析結果。

1.7 瓜蔞薤白半夏湯作用機制文獻驗證

檢索國內外數據庫，查找瓜蔞薤白半夏湯干預冠心病相關研究的可能機制，為網絡藥理學分析提供文獻支撐。

2 結果

2.1 瓜蔞薤白半夏湯主要活性成分獲取

通過TCMSP 檢索瓜蔞薤白半夏湯各藥物的化學成分，其中瓜蔞相關的化學成分11 個、薤白相關的化學成分11 個、半夏相關的化學成分13 個，結合藥典，增加了琥珀酸這一有效成分，檢索文獻對成分進行補充，補充瓜蔞[14-15]5個有效成分如下：4-羥基-2-甲氧基苯甲酸、木犀草素、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、油酸、β-谷甾醇，薤白[16-17]補充5 個有效成分，薤白苷a、薤白苷d、薤白苷e、薤白苷f、腺苷，半夏[18-19]補充3 個有效成分，麻黃堿、膽堿、腺苷，去除重復項，共得到46個化合物，其中腺苷為薤白、半夏共有的成分，β-谷甾醇為瓜蔞、薤白和半夏所共有的成分（表1）。

2.2 瓜蔞薤白半夏湯主要活性成分-靶點網絡

通過TCMSP 數據庫共檢索出瓜蔞薤白半夏湯各成分對應的靶點605 個，并通過Uniprot 數據庫予以校正，去除重復，最后獲得277 個靶點。繪制“瓜蔞薤白半夏湯-活性成分-藥物作用靶點”網絡圖，圖中活性成分取MOD ID 后5 位數字表示，共有326 個節點586條邊（圖1）。

圖1 瓜蔞薤白半夏湯-活性成分-藥物作用靶點網絡圖

2.3 瓜蔞薤白半夏湯治療冠心病潛在作用靶點預測

圖2 瓜蔞薤白半夏湯與冠心病靶點韋恩圖

表1 瓜蔞薤白半夏湯活性成分基本信息表

利用GeneCards 數據庫查找冠心病相關基因，根據1.3 中所提及的篩選條件進行篩選，最后獲取了450個疾病靶點，與瓜蔞薤白半夏湯主要活性成分靶點取交集，得到82 個共同靶基因（圖2）。利用Cytoscape 3.7.2 對瓜蔞薤白半夏湯活性成分治療冠心病作用靶點的對應關系進行可視化處理（圖3）。分析可知，網絡圖有114 個節點、200 條邊，節點度值（Degree）可以反應該節點在網絡中的重要性，利用度值反應網絡圖中各節點面積大小，面積與度值成正比；就藥物成分而言，槲皮素（MOL000098）、木犀草素（MOL000006）、油酸（MOL000675）、柚皮素（MOL004328）、β-谷甾醇（MOL000358）、黃 芩 素（MOL002714）、卡 文 定 堿（MOL002670）與多個靶點關聯，可能是瓜蔞薤白半夏湯治療冠心病的主要活性成分。前列腺素G/H 合成酶2（PTGS2）、β-2 腎上腺素能受體（ADRB2）、鈉通道蛋白5型亞基α（SCN5A）、半胱天冬酶3（CASP3）、核受體 亞 家 族3 組C 成 員2（NR3C2）、雄 激 素 受 體（Androgen receptor，AR）可能是網絡的核心節點，與多個化合物有靶向關系。

圖3 中藥化合物-作用靶點網絡圖

2.4 瓜蔞薤白半夏湯PPI網絡構建

登陸STRING 數據庫，輸入82 個交集靶點，構建PPI 網絡圖（圖4）。圖中82 個潛在靶點均有相互作用，1538 條邊表明了各個蛋白之間的作用。平均度值為37.5，高于平均度值的靶蛋白有45 個，關聯度排名前10 的分別是：胰島素（Insulin，INS）、白介素-6（Interleukin-6，IL6）、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT1）、腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）、血管內皮生長 因 子 A（Vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、C-C 基序趨化因子2（C-C motif chemokine 2，CCL2）、表皮生長因子（Pro-epidermal growth factor，EGF）、白介素1β（Interleukin-1 beta，IL1B）、基質金屬蛋白酶-9（Matrix metalloproteinase-9，MMP9）、內皮型一氧化氮合成酶（Nitric oxide synthase，endothelial，NOS3），這些靶蛋白在整個蛋白相互作用關系中出于關鍵地位，可能是瓜蔞薤白半夏湯干預冠心病的重要靶標。

2.5 相關生物功能注釋和通路分析

對瓜蔞薤白半夏湯和冠心病的交集靶點進行富集分析，包括生物學過程（Biological function，BP）、細胞組分（Cellular component，CC）、分子功能（Molecular function，MF）三個方面，以P＜0.01 進行篩選，獲取生物學過程266 個條目，主要涉及RNA 聚合酶II 啟動子轉錄的正調控、轉錄正調控，DNA 模板、藥物反應、基因表達的正調控、信號轉導、缺氧反應、凋亡過程的負調控、細胞增殖的正調控、炎癥反應等；細胞組分包括24個條目，主要涉及細胞外間隙、質膜、胞外區、胞質、細胞外泌體、細胞表面、細胞質核周區、內質網等；分子功能包括41個條目，主要涉及蛋白質結合、酶結合、蛋白質同源二聚體活性、細胞因子活性、受體結合、轉錄因子活性等，以基因富集數目降序排列，各選取3個方面排序前10 的條目，P值取負對數，繪制條形圖（圖5）。對瓜蔞薤白半夏湯和冠心病的交集靶點進行通路富集分析，有112 條通路與之相關，以P＜0.05 并且基因數目大于等于10 進行篩選，得到30 條通路。主要包括癌癥相關通路以及PI3K-Akt 信號通路、HIF-1信號通路、TNF 信號通路等。以富集數降序排列，選取前20項條目，繪制氣泡圖（圖6），圖中將P值取負對數，顏色表示P值大小，基因數目以氣泡面積表示。

圖4 瓜蔞薤白半夏湯治療冠心病靶點PPI網絡圖

圖5 瓜蔞薤白半夏湯治療冠心病靶點富集分析圖

圖6 瓜蔞薤白半夏湯治療冠心病KEGG分析氣泡圖

2.6 瓜蔞薤白半夏湯有效成分與疾病靶點分子對接分析

選取PPI 網絡中5 個關鍵靶點：INS、IL6、AKT1、TNF、VEGFA，獲取PDB ID 和靶點結構，將5 個靶點分別于其相對應的有效成分進行對接，靶點與化合物結構結合時，對接分數越高，靶點與化學物結合越穩定，能量最低（表2）。對接分數均高于4分，顯示結合強度較好，其中得分高于7 分的有2 個，5-7 分的有7 個，提示核心靶點與瓜蔞薤白半夏湯有效成分具有較好的結合能力。化合物大部分與核心靶點以氫-氫鍵連接，以對接分數降序排列，前3 分別為：INS 與油酸在CYS6 處形成氫鍵；IL6 與木犀草素在ASN169、ASN145、SER37、ARG40、ASP34、GLN175處形成氫鍵；AKT1 與 槲 皮 素 在 GLU228、THR291、ASP292、ALA230、LYS179 處形成氫鍵，對接分數大于6 的對接結構圖如下（圖7）。

表2 核心靶點與藥物成分對接分數

圖7 分子對接模式圖

2.7 瓜蔞薤白半夏湯干預冠心病文獻驗證

查閱文獻發現，瓜蔞薤白作為經典藥對，可用于治療心肌缺血、再灌注損傷、心肌纖維化、動脈硬化、高脂血癥，其作用機制可能與抑制氧化反應、下調自噬基因、抑制成纖維細胞增殖、改善血液流變性、增強巨噬細胞吞噬作用、調節脂蛋白水平有關。通過抑制p53、casepase-3 表達，調節Bcl-2/Bax 的水平，抑制心肌細胞凋亡，以保護心肌[20]。瓜蔞薤白半夏湯還可以抑制缺血再灌注的炎癥損傷，減少IL-6、IL-1β的產生，促進IL-10 的表達。通過抑制NF-κB，調節IL-1、IL-6、TNF-α的表達，保護心肌再灌注損傷[21]。綜上，已有的實驗研究也一定程度上說明了瓜蔞薤白半夏湯通過抗炎、抗氧化、抗纖維化、降脂等作用干預冠心病。

3 討論

瓜蔞薤白半夏湯是最為常用的“胸痹心痛”經方，其臨床療效已得到臨床試驗證實。一項納入20 個隨機對照試驗1810 例患者的系統綜述[22]顯示，瓜蔞薤白半夏湯加減方可提高冠心病心絞痛患者的心絞痛、心電圖和中醫癥候療效，且安全性較好。本方也被納入《冠心病穩定型心絞痛中醫診療指南》[23]，作為冠心病心絞痛痰濁閉阻證的首選方劑。然而，然而本方治療冠心病的具體作用機制研究尚未闡明，利用網絡藥理學方法有助于系統分析本方與冠心病的作用關系，挖掘潛在的作用靶點。

本研究基于Cytoscape 3.7.2 軟件建立“中藥-作用成分-靶點-疾病”網絡模型，共篩選出瓜蔞薤白半夏湯治療冠心病的46 個活性成分、277 個靶點。對瓜蔞薤白半夏湯中藥化合物-作用靶點網絡圖進行分析后發現，槲皮素、木犀草素、油酸、柚皮素、β-谷甾醇、黃芩素、卡文定堿等化學物在網絡圖占據重要地位，可能是瓜蔞薤白半夏湯發揮治療作用的主要成分。研究表明，槲皮素可以改善動脈粥樣硬化，可通過抗氧化，抗炎癥作用進而減輕內皮細胞功能障礙[24]。此外還可以降血壓，擴張血管，抑制血小板聚集和血管平滑肌細胞增殖，對心臟具有保護作用[25]。

木犀草素可以保護肝臟和心血管，具有抗炎抗氧化的功能，促進免疫器官的分化，提高CD4+和CD8+T細胞水平，增強免疫力，作用機制可能與下調PI3K/AKT 通路有關[26]。油酸是重要的不飽和游離脂肪酸，游離脂肪酸，與動脈粥樣硬化和糖尿病的發展密切相關[27]。柚皮素可以調節代謝，直接影響血管壁，可以預防內皮功能障礙具有明顯抑制動脈粥樣硬化作用，還具有降脂、降壓、抗炎的特性[28-29]。β-谷甾醇是一種天然的抗氧化劑，可以保護氧化應激損傷，調節能力代謝，保護心肌[30-31]，抑制炎性因子的聚集和釋放，增強阿司匹林的抗炎作用[32]。黃芩素可以通過作用于PI3K/Akt、MAPKs 和NF-κB/p65 信號通路，干預信號分子，保護心肌細胞缺血/缺氧損傷[33]。卡文定堿可抑制炎性因子，具有抗炎作用[34]。豆甾醇具有廣泛的生物學活性，是一種天然的抗炎抗氧化劑，有鎮痛、降脂、調節血糖的作用[35]。

預測瓜蔞薤白半夏湯與冠心病交集靶點82個，對靶點蛋白相互作用網絡進行分析發現，瓜蔞薤白半夏湯可能通過作用于INS、IL6、AKT1、TNF、VEGFA、CCL2、EGF、IL1B、MMP9、NOS3、CASP3、MAPK1、EDN1、PTGS2、CXCL8、TP53、IL10 等蛋白發揮治療作用。INS 可以提高葡萄糖代謝，從而發揮缺血缺氧心肌的保護作用，血糖升高作為心血管疾病的危險因素，胰島素對于血糖的調節作用尤為重要[36]。IL6與冠狀動脈粥樣硬化發生和發展密切相關，它可以通過激活巨噬細胞、刺激巨噬細胞低密度脂蛋白受體的表達，促進泡沫細胞形成，并刺激基質金屬蛋白酶合成，降低粥樣斑塊纖維帽的穩定性，導致斑塊破裂[37]。AKT1 參與多種生物學過程，如細胞代謝、細胞存活、周期調控、轉錄調控等，在心血管疾病、炎癥、癌癥及糖尿病的發生發展中均可發揮作用[38]。TNF 與炎癥反應關系密切，TNF-α刺激相關血管生長因子的表達，可促進缺血后血管再生[39]。VEGFA 涉及內皮細胞的血管舒張、增殖、通透性、遷移和存活，與血管生成密切相關[40]。瓜蔞薤白半夏湯作用于靶點可能與調節炎癥因子，作用于血管內皮細胞、心肌細胞，參與氧化還原反應有關。

GO 功能分析結果提示，生物學過程對于基因的調控、信號轉導、缺氧的反應、細胞增殖或凋亡過程的調節、炎癥反應等均與冠心病聯系密切；細胞組分主要涉及細胞外間隙、質膜、胞外區、胞質、細胞外泌體、細胞表面、細胞質核周區、內質網等；分子功能主要涉及蛋白質結合、酶結合、蛋白質同源二聚體活性、細胞因子活性等。富集分析進一步表示，瓜蔞薤白半夏湯作用于多層面通過復雜機制調節冠心病。

KEGG 分析結果提示，有5 條通路與心血管關系密切，PI3K-Akt 信號通路、TNF 信號通路、HIF-1 信號通路、MAPK 信號通路、FoxO 信號通路。PI3K-Akt 通路在細胞存活、增殖、凋亡中起著關鍵作用，影響動脈粥樣硬化的發展。作為通路，參與了細胞因子的信號轉導，同時對能量代謝也有重要作用[41-42]。TNF 信號通路與炎癥和免疫相關，TNF-α參與細胞生長、增殖、死亡等過程，協同IL-6、IL-1 等炎性因子導致心臟炎性反應[43]。HIF-1，可以調節缺氧引起的生理病理變化，如氧化應激、缺氧損傷、血管新生、炎癥反應、代謝等，參與調控多種細胞的增殖、分化、凋亡[44]。MAPK信號通路有助于細胞各項生理活動，如轉錄、合成蛋白、細胞周期等，參與了血管內皮細胞炎癥損傷，還可以調節泡沫細胞和動脈粥樣硬化斑塊的形成[45]。FoxO可以促進心肌細胞凋亡，抑制其表達可以助于心肌再生。FOXO1/3 可以抑制心肌纖維化，提示在早期可能起到保護心肌的功能，而在后期加速了疾病的發展進程[46]。

本研究存在一定的局限性，僅基于TCMSP數據庫檢索藥物成分及靶點，中藥數據庫較多，數據日漸完善，TCMSP 作為綜合考慮最優選的數據庫之一仍然存在部分藥物缺失、有效成分不全等問題，在今后的研究過程中，應盡量結合多個數據庫及文獻資料對數據進行補充。綜上，瓜蔞薤白半夏湯治療冠心病涉及多個有效成分、作用靶點及信號通路，與中藥多成分、多靶點、多途徑的特點吻合，瓜蔞薤白半夏湯具有的抗炎、抗動脈硬化、血管保護、抗缺血缺氧損傷等作用，一定程度上體現了其干預機制，為后續治療冠心病的研究提供了新的理論基礎和探索方向。