腎陽虛型慢性再障患者CD3+CD19-和CD3+CD25+T細胞與血小板的多重線性回歸分析＊

丁宇斌，唐旭東

（1. 中國中醫科學院研究生院 北京 100700；2. 中國中醫科學院西苑醫院血液科 北京 100091）

再生障礙性貧血（aplastic anemia，AA）是一種骨髓造血功能衰竭（bone marrow failure，BMF）綜合征，主要表現為骨髓造血功能低下，全血細胞減少和貧血、出血、感染。目前認為AA 的骨髓衰竭是自身反應性細胞毒性T 淋巴細胞介導的造血干/祖細胞（HSPC）免疫破壞的結果。以強力免疫抑制劑抗胸腺細胞球蛋白（ATG）或抗淋巴細胞球蛋白（ALG）聯合環孢素（CsA）為主的一線治療方案可獲得60-80%的有效率[1，2]，為此提供了有力的證據支持。慢性再生障礙性貧血（chronic aplastic anemia，CAA）較SAA病情相對穩定，但CAA 患者血象恢復過程中與中性粒細胞（ANC）、血紅蛋白（HGB）相比，PLT的上升最為緩慢甚至可能終身未能恢復正常[3]，CAA 患者可因PLT 數量持續低下出現皮膚散在瘀點瘀斑，尿血便血，口腔粘膜、牙齦、舌面出血，或見視網膜火焰狀出血及棉絨狀滲出以及扇形較大面積視網膜前出血，嚴重影響患者生存質量，口腔內出血或眼底出血頻發常提示顱內出血風險增加，嚴重威脅患者生命，因此探索和分析CAA 患者PLT 數量的影響因素具有重要的臨床意義；且由于PLT 數量與CAA 患者的出血癥狀、出血風險和生存質量密切相關，通過預測PLT 數量在臨床治療后的轉歸有助于臨床醫師及時判斷和評估CAA 患者在臨床結局中的出血風險及其對患者生存質量的影響，有利于提高CAA 患者在臨床治療中的依從性和堅定患者的治療信心。

中醫根據AA 的臨床表現特點，將AA 的中醫學病名稱為“髓勞病”，“髓”為病位，“勞”代表病情與病性。中國中醫科學院西苑醫院血液科自20 世紀90年代提倡補腎生血法聯合ATG/ALG治療CAA，已經取得了良好的療效，總有效率高達80%[4-8]。腎陽虛型是CAA 患者最為常見的中醫證型，此證型CAA 患者經中西醫結合治療的總有效率最高[9，10]，本研究擬選取腎陽虛型CAA 患者，在充分發揮中醫藥辨證治療優勢的同時，又能夠使研究成果最大可能地適用于CAA 患者群體。本研究收集2018年09月13日到2018月10月18日就診于西苑醫院血液科門診和住院部的腎陽虛型CAA患者外周血淋巴細胞中CD3+CD19-T 細胞比例、CD3+CD25+T 細胞比例和PLT 共3 個參數，建立多重線性回歸模型分析其線性關系并探討腎陽虛型CAA 患者PLT數量在治療轉歸中的預測因素。

1 研究對象

病例來源于2018年9月13日至2018年10月18日就診于中國中醫科學院西苑醫院血液科門診和住院部的腎陽虛型CAA患者共22例，其中男10例，女12例，年齡16-68歲，中位年齡43歲。

1.1 診斷標準

1.1.1 西醫診斷標準[11]

①血象：全血細胞減少，網織紅細胞減少，淋巴細胞比例增高。②骨髓穿刺：多部位（不同部位）骨髓增生減低或重度減低；小粒空虛，非造血細胞比例增高；巨核細胞明顯減少或缺如；紅系粒系均明顯減少。③骨髓活檢：全切片增生減低，造血組織減少，脂肪組織和/或非造血細胞增多，網硬蛋白不增加，無異常細胞。④除外PNH、hypo-MDS/AML等其他疾病。

1.1.2 中醫證候診斷標準[12]

腎陽虛證：乏力，心悸，氣短，活動后加重，面白唇淡，甲床蒼白，兼見畏寒喜暖，手足冷涼，腰酸，夜尿多，性欲減退，多無出血，或見大便稀溏，面浮肢腫，苔白質淡，脈細無力。

1.2 納入標準

①符合西醫診斷標準和中醫證候診斷標準；②年齡16-80 歲；③肝腎功能正常；④未參加其他臨床研究。

1.3 排除標準

①引起全血細胞減少的其他疾病，如陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥、骨髓增生異常綜合征、急性造血功能停滯、骨髓纖維化；②先天性再生障礙性貧血；③合并嚴重心、腦、肝、腎疾病及精神病患者；④妊娠、哺乳期婦女。

2 研究方法

2.1 簽署知情同意書

告知檢查目的，保護隱私，患者表示知情同意并簽署知情同意書。

2.2 病例觀察指標

外周血淋巴細胞中CD3+CD19-T 細胞比例、CD3+CD25+T細胞比例和PLT。T淋巴細胞免疫分型檢測方法：以肝素抗凝管（綠帽管）抽取空腹狀態患者靜脈血2 ml，以2-8℃冷藏運輸標本至天津協和華美醫學診斷技術有限公司進行檢測，標本制備采用全血溶紅細胞法，溶血素為BC OptiLyse C No-Wash Lysing Solution，抗體標記采用九色法，細胞獲取數量10000個，抗體生產廠家BD，檢測儀器BC NAVIOS，結果分析采用CD45/SSC 設門法。HGB 的檢測方法：以EDTA抗凝管（紫帽管）抽取空腹狀態患者靜脈血2 mL，搖勻后用COULTER?LH 750 全自動血細胞分析儀進行檢測分析（美國貝克曼庫爾特公司），最終顯示血常規分類的結果，其中包括PLT。

2.3 統計學方法

采用SPSS 25.0統計軟件進行分析，將外周血淋巴細胞中CD3+CD19-T 細胞比例、CD3+CD25+T 細胞比例和PLT進行多重線性回歸分析。

3 結果

本研究采用多重線性回歸，納入外周血總T 細胞（CD3+CD19-）、活化T 細胞（CD3+CD25+）2 個自變量預測PLT。因學生化刪除殘差（SDR_1）有超過3 倍標準差的離群值1個，強杠桿點（LEV_1）＞0.5者1個，對這2條觀測值予以刪除。

已經驗證研究觀測值之間相互獨立（Durbin-Watson 檢驗值為1.703）（表1）。本研究中兩個自變量相關系數為0.093 ＜0.7（表2），且所有容忍度值都大于0.1，且方差膨脹因子皆小于2，表明自變量不存在多重共線性（表3）。各觀測值Cook 距離皆小于1，即不存在強影響點，據此我們認為沒有需要處理的異常值。根據標準化殘差繪制的帶正態曲線的柱狀圖和P-P圖，判斷回歸殘差近似正態分布（圖1、圖2）。

表1 預測模型匯總

表2 多重共線性分析

圖1

圖2

表3 多重線性回歸結果

回歸模型具有統計學意義（表4）F（2,17）=19.479（P＜0.001），R2= 0.696，調整R2= 0.660。納入模型的2 個自變量對PLT 的影響均有統計學意義（P＜0.05），具體結果見表2。將表3 中系數代入回歸方程，得：PLT = 391.585 - 5.104 × (CD3+CD19-) + 23.851 ×(CD3+CD25+)。

表4 ANOVAa

由模型結果知，CD3+CD19-T 細胞占淋巴細胞的比 例 每 增 加1%，PLT 平 均 降 低5.104 × 109·L-1，CD3+CD25+T 細胞占淋巴細胞的比例每增加1%，PLT平均升高23.851×109·L-1。

4 討論

目前認為AA 的骨髓衰竭是自身反應性細胞毒性T 淋巴細胞介導的造血干/祖細胞（HSPC）免疫破壞的結果。AA 大致可以分為以異常免疫為主和以骨髓衰竭為主兩個階段，其中急性或重型AA（SAA）以異常免疫為主，此階段AA 中醫辨證多屬腎陰虛型；CAA 以骨髓衰竭為主，此階段患者辨證多屬腎陽虛型[13]。既往研究[14-16]認為細胞毒T 淋巴細胞(CTL) 的異常活化和增殖是引起AA 造血功能衰竭的重要原因，所分泌的造血抑制因子如IFN-γ、TNF-α最終可導致造血功能衰竭，可能是AA的免疫病理學機制基礎。T細胞亞群的表達、多種細胞因子（如IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-3、IL-10 和TGF-β）的水平皆與中醫辨證分型密切相關，在腎陰虛型、腎陽虛型和腎陰陽兩虛型AA 患者中呈現不同表現[14,17]。

近年研究[18-20]發現活化標記物CD25 不僅表達在活化的T細胞上，也表達于Treg細胞；Treg細胞表面標記物為CD4+CD25highCD127-/low，能夠在大于90% 的CD4+CD25highCD127-/lowTreg 細胞中檢測到細胞核蛋白Foxp3 的表達，且因Foxp3 能夠抑制CD127 的啟動子，CD127 與Foxp3 表達呈負相關，Foxp3highTreg 細胞呈現CD127low。Treg 細胞能夠進行免疫負向調控從而維持機體的免疫平衡，Treg 細胞數量的降低或功能減弱會導致自身免疫耐受損傷、免疫功能紊亂并最終導致自身免疫疾病的發生。T細胞亞群在SAA 治療中的療效預測價值研究表明[21]，CD3+CD25+T 細胞比例能夠作為SAA 療效的預測性指標，其升高提示療效較佳；CD3+CD25+T細胞比例大于3%提示預后較好和生存期較長。

CAA較SAA病情相對穩定，但CAA患者血象恢復過程中PLT 的上升最為緩慢，部分CAA 患者PLT 甚至終身未能復常[3]，若PLT 數量持續低下可出現尿血便血、皮膚粘膜或牙齦舌面出血、視網膜出血等多種出血表現并將嚴重影響患者生存質量，口腔內出血或眼底出血頻發常提示顱內出血風險增加，因此探索和分析CAA 患者PLT 數量的影響因素具有重要的臨床意義；由于PLT 數量與CAA 患者的出血癥狀和生存質量密切相關，通過預測PLT 數量在臨床治療后的轉歸有助于臨床醫師及時判斷和評估CAA 患者在臨床結局中的出血風險及其對患者生存質量的影響，有利于提高CAA 患者在臨床治療中的依從性。腎陽虛型是CAA 患者最為常見的中醫證型，此證型CAA 患者經中西醫結合治療的總有效率最高[9，10]，因此本研究中納入的病例均為腎陽虛型CAA 患者，在充分發揮中醫藥辨證論治優勢的同時，又能夠使研究成果具有更強的普適性。本研究發現腎陽虛型CAA 患者的外周血淋巴細胞中CD3+CD19-T 細胞的比例每增加1%，PLT 平均降低5.104×109·L-1，提示T 淋巴細胞與PLT 之間呈負相關，證實了T 淋巴細胞介導的造血干/祖細胞（HSPC）免疫破壞在CAA 病理機制中的重要作用。本研究也發現CD3+CD25+T 細胞占淋巴細胞的比例每增加1%，PLT 平均升高23.851 × 109·L-1，與CD3+CD25+T細胞比例作為SAA 療效的有利預測性指標的研究結論相一致[21]。本研究表明模型中引入的變量能夠解釋腎陽虛型CAA 患者PLT 數量變化的66%（調整R2=0.660），能夠在臨床上作為腎陽虛型CAA 患者PLT 數量變化的有效預測指標，即通過腎陽虛型CAA 患者的外周血淋巴細胞中CD3+CD19-T 細胞的比例和CD3+CD25+T 細胞的比例能夠估計和預測患者在未來的臨床轉歸中PLT 的值及其變化趨勢。譬如在外周血淋巴細胞中CD3+CD19-T 細胞的比例降低和CD3+CD25+T 細胞的比例增加將在很大程度上預示著該患未來PLT 有升高的趨勢。根據PLT 的轉歸趨勢，臨床醫師能夠及時判斷和評估CAA 患者在臨床結局中的出血風險及出血癥狀對患者生存質量的影響，有利于提高CAA 患者在臨床治療中的依從性和堅定患者治療信心。本研究納入病例數僅22例，尚需進一步擴大研究對象樣本數量以提供堅實可靠的數據支持和完善臨床研究；腎陽虛型CAA 患者PLT 數量的其他潛在影響因素也有待進一步研究。