AQP2、HSP70在痛風濕熱蘊結證模型中表達的意義＊

郭玉星，朱珊瑩，康佩芝，湯 智，易法銀＊＊，邵先舫，熊 輝，劉永利，毛 果

（1. 湖南中醫藥大學 長沙 410208；2. 湖南省中醫藥研究院附屬醫院 長沙 410006；3. 常德市第一中醫醫院 常德 415100；4. 湘潭市中醫院 湘潭 411100）

痛風作為一種臨床常見的代謝性疾病。隨著人們飲食結構的變化，患者數量猛增，有趕超糖尿病成為第一大代謝性疾病之勢，因其病程長及難以治愈性的特點，嚴重影響著人類生命健康和生存質量。目前臨床治療痛風藥物主要以秋水仙堿、非甾體消炎藥、糖皮質激素等緩解急性癥狀，苯溴馬隆、別嘌呤醇等降尿酸治療，雖然上述化學藥物治療效果可，但它們不良反應（如肝腎損害、胃腸道反應等）限制了它們的使用，尤其是痛風易反復發作且需長期服藥的特點，因此探尋一種安全性高、副作用小的治療藥物迫在眉睫。中醫藥對痛風認識已久，幾千年來痛風被稱為“歷節”“痹癥”等范疇。諸多資料記載中醫藥對其治療效果良好，因此從浩瀚的祖國醫學中探尋防治痛風藥物并對其作用機制、作用靶點研究具有重要意義。近年研究表明，痛風中濕熱蘊結是主要證型，課題組在臨床中也反復證實并以清熱利濕立法治療該病取得了非常好的臨床療效；實驗方面也研究過清熱利濕立法的中藥復方治療痛風性關節炎的作用機制，但是實驗造模常采用經典的大鼠模型（即關節腔注射尿酸鈉復制急性痛風性關節炎），不能區分痛風各類證型及辯證論治，加之國內學者有關痛風及濕熱證的探討雖多，但涉及痛風與中醫濕熱蘊結證病機及病證結合模型的研究較少[1]，因此探討中醫藥復方干預痛風濕熱蘊結證效應的研究具有重要意義及一定的創新性，通過諸多文獻學研究發現水通道蛋白-2（AQP2）、熱休克蛋白70（HSP70）與濕熱關系密切。因此課題組通過建立痛風濕熱蘊結證動物模型，并闡明該病癥與AQP2、HSP70 表達關系的機理，這對進一步研究中醫藥復方治療痛風濕熱蘊結證作用機制及療效判斷具有重要的意義。本研究采用多因素復合造模方法復制濕熱模型，在此基礎上采用改良Coderre法[2]，復制痛風濕熱蘊結證動物模型[3]，探討基于AQP2、HSP70 表達相關的痛風濕熱蘊結證可能的分子機制，為痛風“濕熱蘊結”病機提供科學內涵。現報告如下。

1 材料

1.1 實驗動物

本實驗選取8 周齡的SPF級健康成年SD 雄性大鼠作為實驗對象，它們體質量為（200±20）g，4 組共40只，每組10只。實驗動物由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供。

1.2 主要實驗試劑

造模試劑：52%紅星二鍋頭酒為北京紅星股份有限公司生產，尿酸鈉鹽購于北京索萊寶科技有限公司Solarbio產品等；

檢測試劑：AQP2 試劑盒購于碧云天生物技術研究所，HSP70 檢測試劑盒購于上海超研生物科技有限公司，尿酸（UA）檢測試劑盒購于德國羅氏診斷有限公司等。

1.3 主要儀器設備

人工氣候箱（型號：QHX-300BS-Ⅲ，上海新苗醫療器械制造有限公司），雙目生物顯微鏡及圖像采集和分析軟件（型號：MoticB1，麥克奧迪實業集團有限公司），北京普朗酶標儀（型號：DNM-9602，北京普朗新技術有限公司），臺式高速冷凍離心機（型號：TGL20，長沙英泰儀器有限公司），微型漩渦混合儀（型號：WH-2，江蘇盛藍儀器制造有限公司）等。

2 方法

2.1 試劑制備

參照改良Coderre造模法，課題組前期造模中藥物配制[2]。

具體步驟為：先稱取微晶尿酸鈉（monosodium urate，MSU）1250 mg，然后加生理鹽水（normal saline，NS）45 mL,再加吐溫80（Tween-80）5 mL，將它們加熱并充分攪拌，以上共同制備成濃度為25 g·L-1的尿酸鈉溶液，備用。

2.2 動物分組與造模

痛風濕熱證造模方法參照課題組尹明等[3]造模方法。

2.2.1 分組

40 只SPF級健康成年SD 雄性大鼠，適應性喂養1周后，采用隨機數字表方法分為正常對照組、痛風模型組、濕熱模型組、痛風濕熱模型組，每組10只。

2.2.2 造模

（1）正常對照組

在正常溫濕度環境（24-28℃、相對濕度60%-75%），給予普通飼料、自由飲水喂養，造模共計15日。

（2）痛風模型組

前15日同正常對照組。在第15日用5 號注射器針頭于受試大鼠右側踝關節外側后方進行穿刺（注意針口斜面朝前上方，針尖與脛骨成45°），刺入右踝關節腔后，予以提前配置好的25 g·L-1濃度的尿酸鈉溶液50μL 注入踝關節腔（以關節囊對側鼓起為標準），制備（急性）痛風模型。

（3）濕熱模型組[3]

前10日，在正常溫濕度環境（見正常對照組），大鼠喂食普通飼料+200 g·L-1蜂蜜水自由飲用（作為高糖），并采用油脂和白酒隔日交替方式（油脂0.1 g·kg-1（作為高脂）、52°白酒（紅星二鍋頭）0.1 mL·kg-1）。第11 天到15 天，將大鼠放入人工氣候箱中，溫度調節為(32±2）℃，相對濕度(92±3)%。濕熱度造模時間為每日上午8-12 點，下午1-5 點，上述方法共持續5日，以制備濕熱證模型。

（4）痛風濕熱模型組

綜合痛風模型組、濕熱模型組兩組造模方法，前15日喂養造模同濕熱模型組，第15日起踝關節造模同痛風模型組，制備痛風濕熱證模型。

2.3 一般情況觀察

考慮到濕熱證臨床特點及動物癥狀辨別的可行性，實驗組主要選取8個時相點進行一般情況的觀察，觀察的內容包括受試大鼠的外觀、精神狀態、食飲量、體質量等的變化情況。

8 個時相點分別為：造模開始（即第1日），造模過程中（第5日），開始進入人工氣候箱（第11日），痛風造模開始（第15日），及痛風造模結束后3 h、6 h、12 h、24 h。

2.4 關節炎癥指數[4-6]

2.4.1 分級標準

0級：正常，計0分；

1級：踝關節處皮膚發紅，輕度腫脹，可見其關節周圍骨性標志，計2分；

2級：踝關節處出現明顯發紅，局部明顯腫脹，但腫脹僅局限在踝關節部位，其關節周圍的骨性標志消失不可見，計4分；

3級：包含2級情況，同時出現踝關節部位以外肢體腫脹，計6分。

2.5 造模72 h各組大鼠的步態情況

參照大鼠步態分級評分標準[4-6]:

0級：正常行走，計0分；

1級：輕度跛行，其右下肢出現稍微彎曲狀態，計2分；

2級：明顯跛行，其右下肢在行走過程中僅能剛剛觸及地面，計4分；

3級：重度跛行，其右下肢在行走過程中不能觸及地面，僅可余三足行走，計6分。

2.6 尿液AQP2含量測定

造模開始后第15日，將各組實驗受試大鼠分別放于單獨的代謝籠中，遵循禁食但可任意飲水的要求。收集每只大鼠24 h 的尿液，對其進行低溫離心并取上清液，使尿液濃縮，量達至＜1 mL，置于-20℃冰箱中凍存。課題組采用的考馬斯亮藍法（Bradford）來測定尿液中的AQP2 含量。采用的方法為：以標準品濃度為縱坐標，OD 值為橫坐標，在坐標軸上繪制標準曲線，并得出標準曲線的直線回歸方程，從而計算樣品濃度，其代表尿液AQP2含量。

2.7 血漿HSP70、血尿酸含量測定

造模開始后第16日，先集中用一定濃度的水合氯醛腹腔注射使各大鼠麻醉，然后采用腹主動脈取血方法進行取血，取血約為2 mL，將其注入到含30 μL 7.5%EDTA-2Na（乙二胺四乙酸二鈉鹽）和40μL 抑肽酶的試管中，充分混勻，再在4℃下離心10 min（采用3000 r·min-1轉速，其離心半徑為30 mm），分離血漿。將樣品置于-20℃凍存。需要檢測時，取出并采用酶聯免疫吸附法（ELISA）對其血漿中HSP70、血尿酸的含量進行檢測。

2.8 踝關節滑膜組織病理檢測

各組實驗大鼠處死后，以其右踝為中心，分別從其上下0.5 cm 處進行離斷，取右踝關節及周圍軟組織，再迅速切取踝關節滑膜（在顯微鏡下用尖刀片剝取），將剝取的滑膜置于40 g·L-1中性甲醛溶液中固定。然后采用100 g·L-1的乙二胺四乙酸進行脫鈣，再經過常規脫水、透明、包埋、切片、HE 染色（蘇木精-伊紅染色）程序，將玻片置于電鏡下，觀察各組大鼠右踝關節滑膜組織病理變化，并進行比較。

2.9 統計學方法

所得數據，課題組采用SPSS 17.0統計軟件進行分析。針對4 組尿液AQP2、血漿HSP70 含量：采取方差分析進行組間總體比較，采用LSD-t檢驗進行組間兩兩比較，以α=0.05為標準。

3 結果

3.1 一般情況觀察結果

大鼠喂養期間，正常對照組一般情況（外觀、精神狀態、食飲量、體質量等）均正常；痛風模型組大鼠在造模前一般情況均正常，自第15日造模后出現食飲減少，煩躁不安，右踝關節明顯紅腫，關節局部皮溫升高，并伴活動受限情況；濕熱模型組大鼠在開始造模后漸漸出現毛發蓬松、色枯槁，倦怠懶動、行動呆滯，食飲減少，小便黃，接著出現大便溏瀉或粘膩的表現；痛風濕熱模型組大鼠造模后前15日一般情況與濕熱模型組大鼠相似，自第15日開始，合并出現痛風模型組大鼠造模后的表現。說明通過濕熱及急性痛風造模后，實驗大鼠出現了痛風、濕熱證的一般表現。

3.2 各組大鼠踝關節炎癥指數及步態評分比較

與正常對照組比較，痛風模型組、痛風濕熱模型組踝關節炎癥指數明顯增高，具有統計學意義（P＜0.05）；與濕熱模型組對比，痛風模型組、痛風濕熱模型組踝關節炎癥指數明顯增高，具有統計學意義（P＜0.05）；正常對照組與濕熱模型組比較，痛風模型組與痛風濕熱模型比較，踝關節炎癥指數均無統計學意義（P＞0.05，P＞0.05）。與正常對照組比較，痛風模型組、痛風濕熱模型組步態評分明顯增高，具有統計學意義（P＜0.05）；與濕熱模型組對比，痛風模型組、痛風濕熱模型組踝關節步態評分明顯增高，具有統計學意義（P＜0.05）；正常對照組與濕熱模型組比較，痛風模型組與痛風濕熱模型比較，步態評分均無統計學意義（P＞0.05，P＞0.05）。以上提示經過改良Coderre 法造模后大鼠踝關節炎癥指數及步態評分均明顯增加，符合急性痛風性關節炎表現（表1）。

表1 痛風造模72 h后各組大鼠踝關節炎癥指數、步態評分比較（n = 10,±s）

表1 痛風造模72 h后各組大鼠踝關節炎癥指數、步態評分比較（n = 10,±s）

注：與正常對照組比較，★P ＜0.05；與濕熱模型組比較，▲P ＜0.05

組別正常對照組痛風模型組濕熱模型組痛風濕熱模型組踝關節炎癥指數0±04.21±0.42★▲0±04.07±0.67★▲步態評分0±04.04±0.82★▲0±03.95±0.71★▲

3.3 踝關節滑膜組織觀察結果

正常對照組及濕熱模型組大鼠右踝關節及其周圍組織結構清晰完整，滑膜正常，無明顯組織病理學改變表現；痛風模型組大鼠右踝關節及其周圍組織可見滑膜壁增厚，炎癥細胞浸潤，痛風濕熱模型組表現同痛風模型組，亦可見明顯的炎性細胞浸潤。在給痛風模型組、痛風濕熱模型組大鼠手術取標本時，各大鼠右踝關節腔內均可見明顯的尿酸鹽結晶沉積。提示經過改良Coderre造模法造模后，受試踝關節出現尿酸鈉沉積及表現出明顯的炎癥病理變化（圖1）。

圖1 受試踝關節滑膜組織病理表現（×200）

3.4 各組大鼠尿液AQP2、血漿HSP70、血尿酸含量變化比較

4組大鼠尿液AQP2含量比較：正常對照組與痛風模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；濕熱模型組和痛風濕熱模型組比較，無顯著性差異（P＞0.05）。正常對照組明顯低于濕熱模型組和痛風濕熱模型組（P＜0.05；P＜0.05）；痛風模型組明顯低于濕熱模型組和痛風濕熱模型組（P＜0.05；P＜0.05）。提示通過復合型濕熱造模后尿液AQP2明顯增高（表2）。

表2 4組大鼠尿液AQP2、血漿HSP70、血尿酸含量比較（n = 10,±s）

表2 4組大鼠尿液AQP2、血漿HSP70、血尿酸含量比較（n = 10,±s）

注：與正常對照組比較，★P ＜0.05；與痛風模型組比較，◆P ＜0.05

組別正常對照組痛風模型組濕熱模型組痛風濕熱模型組AQP2/(mg·mL-1)0.237±0.0110.229±0.0160.254±0.013★◆0.247±0.022★◆HSP70/(pg·mL-1)19.39±2.7719.96±2.5746.08±4.52★◆45.93±4.64★◆血尿酸/(μmol/L)199.12±45.70207.88±37.08246.58±69.11★▲264.75±44.85★▲

4 組大鼠血漿HSP70 含量比較：正常對照組與痛風模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；濕熱模型組和痛風濕熱模型組比較，無顯著性差異（P＞0.05）。正常對照組明顯低于濕熱模型組和痛風濕熱模型組（P＜0.05；P＜0.05）；痛風模型組明顯低于濕熱模型組和痛風濕熱模型組（P＜0.05；P＜0.05）。提示通過復合型濕熱造模后血漿HSP70明顯增高（表2）。

4 組大鼠血尿酸水平比較：正常對照組與痛風模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；濕熱模型組和痛風濕熱模型組比較，無顯著性差異（P＞0.05）。正常對照組低于濕熱模型組和痛風濕熱模型組（P＜0.05；P＜0.05）；痛風模型組低于濕熱模型組和痛風濕熱模型組（P＜0.05；P＜0.05）。提示提示通過復合型濕熱造模后血尿酸也有一定增高（表2）。

4 討論

隨著社會快速發展，人類飲食結構變化，號稱“富貴病”的痛風患者越來越多，其中濕熱蘊結型是其常見證候類型[7-9]。在臨床中，濕熱蘊結證為主要證型[10，11]，因此通過建立痛風性關節炎濕熱證動物模型，對其相關分子機制進行研究，具有重要的臨床和科研意義。

根據《中醫內科病證診斷療效標準》[12]中關于痛風濕熱蘊結證的診斷標準：下肢小關節突發紅腫熱痛，其局部拒按，觸之有灼熱感，遇熱則重，得涼則緩；并伴發熱口渴，小便色黃，舌質紅，苔黃膩，脈象滑數。在本實驗結果中從大鼠的一般狀態提示：痛風濕熱證模型組中大鼠的一般狀態表現與上述痛風濕熱蘊結證的診斷標準中表現相符合。本實驗結果提示大鼠踝關節炎癥指數、步態評分可以能夠作為證明痛風造模成功的重要指標，從而揭示可以作為證明痛風加濕熱模型造模成功的一個重要因素。在對受試右踝關節進行局部解剖取材時發現痛風模型組及痛風濕熱證模型組大鼠關節中明顯可見尿酸鈉結晶的沉積，這兩組滑膜的病理形態變化均符合尿酸鈉結晶誘導大鼠急性痛風性關節炎模型的滑膜組織病理變化[13]，也進一步證實痛風造模成功，保障了實驗的正行性及后續研究可信性。

水通道蛋白（AQPS），又稱為水孔蛋白，是一種特異性的轉運水的蛋白，它可顯著增加細胞膜對水的通透性，常在細胞內外平衡、對水的分泌吸收的調節中起重要作用。AQPS 目前已知有十三種亞型，而AQP2是其中常見的一種，它是存在于腎臟集合管中，具有調節水重吸收作用的關鍵蛋白之一[14]。付偉等實驗研究發現[15]：尿液AQP2 含量變化可作為評價“濕”邪的重要指標。熱休克蛋白(HSPs)是一種廣泛存在的熱應激蛋白，它的特點是當機體遭受熱或其他應激刺激時，其表達則明顯增多。目前共分為HSP70、HSP60等5類。而HSP70是其中最受關注且研究最為透徹的一種，它在應激刺激下合成最為迅速、表達豐度最高，被稱為主要熱休克蛋白。諸多實驗證實AQP2、HSP70關系密切[16]。實驗證實[17]檢測AQP2、HSP70 可作為濕熱證辨證論治的量化指標，因此將其用于對濕熱觀察具有一定的參考意義。

本研究中濕熱模型組、痛風濕熱證模型組尿液AQP2、血漿HSP70 含量低于正常對照組、痛風模型組，且比較差異有統計學意義；而濕熱模型組與痛風濕熱證模型組比較及正常對照組與痛風模型組比較，以上兩指標均無統計學意義，從上述實驗結果可以看出，AQP2 含量、HSP70 含量兩個指標在判斷濕熱蘊結證型時有著重要作用。血尿酸水平是痛風病程度的一個重要指標，在本實驗結果中提示:濕熱模型的造模在一定程度上提高了模型大鼠血尿酸水平，而常規痛風造模（尿酸鈉關節腔注射）并沒有明顯影響其血尿酸水平，說明濕熱因素在痛風中具有重要作用。

綜上所述，本研究結果提示：通過多因素（飲食+氣候環境+致病因子+局部用藥+全身用藥）復合造模方法可以復制出痛風濕熱蘊結證病證結合模型[3,18]，而且在判斷痛風濕熱蘊結證型時AQP2、HSP70 兩個指標起著重要作用，痛風濕熱蘊結證模型建立成功與否可選取觀察AQP2、HSP70 含量變化以作為評價指標，其在臨床治療痛風濕熱蘊結證患者療效判定也可以作為重要參考指標，值得進一步研究。