四君子湯對脾氣虛證模型大鼠股四頭肌線粒體自噬和細胞凋亡水平的影響＊

段志園，許欣竹，謝 鑫，劉文俊，陳 靖，柴紀嚴，吳成舉，單德紅＊＊

（1. 遼寧中醫藥大學教學實驗中心 沈陽 110847；2. 遼寧中醫藥大學研究生學院 沈陽 110847；3. 遼寧中醫藥大學中西醫結合學院 沈陽 110847）

線粒體產能（三磷酸腺苷，ATP）為細胞執行生物學功能提供動力；骨骼肌富含線粒體，其收縮需消耗大量ATP，線粒體損傷則收縮力下降。線粒體不僅決定細胞生存，還決定細胞死亡，這是因為氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation，OXPHOS）過程中活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS）異常積累可損害其功能。對此，宿主細胞可啟動線粒體自噬機制清除損傷，如不能及時清除，可誘導細胞凋亡[1，2]。前期研究發現，脾氣虛證大鼠肌力下降與骨骼肌OXPHOS 損傷和自噬紊亂有關，但其是否誘導細胞凋亡尚不完全清楚[3]。中醫學認為“脾氣虛則四肢不用”，可治以四君子湯。四君子湯由人參、白術、茯苓、炙甘草組成，是健脾益氣的代表方劑。已有研究發現，四君子湯可提高脾氣虛證大鼠骨骼肌線粒體生物合成進而提高肌力[4，5]，但其對線粒體自噬的作用并不清楚，其是否影響細胞凋亡也未見報道。為此，本研究主要圍繞線粒體自噬和細胞凋亡機制，以脾氣虛證大鼠股四頭肌線粒體為對象，探討四君子湯治療“脾氣虛四肢不用”的機制。

1 材料

1.1 動物

50 只SPF級7 周齡雄性SD 大鼠，體質量（200 ±10）g，購于遼寧省本溪巿實驗動物中心，許可證號：SCXK（遼）-2010-0001，飼養于遼寧中醫藥大學實驗動物中心，許可證號：SYXK（遼）-2013-000-9。室溫18-23℃，相對濕度45-55%，自由飲水進食，適應性飼養1周后，開始實驗。

1.2 倫理審查

項目通過遼寧中醫藥大學實驗動物倫理委員會審核，批準號：20151205。

1.3 儀器與試劑

BCA 蛋白測定試劑盒（批號：K20316，TransGen 公司）、組織線粒體分離試劑盒（批號：C3606，Beyotime公司）、ATP 含量測定試劑盒（批號：201901，南京建成生物工程研究所）、過氧化氫檢測試劑盒（批號：S0038，Beyotime 公司）、線粒體膜電位檢測試劑盒（批號：C1071S，Beyotime 公 司）、LC3B 抗 體（批 號：3199111-5，Abcam 公司）、p62 抗體（批號：00052579，Proteintech 公 司）、Bcl-2 抗 體（批 號：00012789，Proteintech 公 司）、Bax 抗 體（批 號：00050599，Proteintech 公 司）、Cyt-c 抗 體（批 號：00010933，Proteintech 公司）、Caspase3 抗體（批號：00058210，Proteintech 公司）、PARP 抗體（批號：9532T-9，CST 公司）、GAPDH 抗體（批號：L10515，Proteintech 公司）、COX-4 抗體（批號：10001421，Proteintech 公司）、辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔二抗（批號：7074P2，CST公司）、辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗鼠二抗（批號：20000002，Proteintech 公司）、ECL 化學發光試劑盒（批號：M20926，TransGen 公司）。高速冷凍離心機（Thermo Scientific）、全波長酶標儀（Tecan infinite 200Pro）、超聲破碎儀、電泳儀（Bio-Rad）、轉膜儀（Bio-Rad，Trans-Blot Turbo Transfer System）、顯影儀（Tanon 5200）。

2 方法

2.1 動物

大鼠隨機分為對照組（n=10）和脾氣虛證模型組（n=40）。按文獻[3,6]方法復制和評價飲食失節＋勞倦型脾氣虛證模型。造模結束后，將脾氣虛證模型組大鼠分為四君子湯治療低、中、高劑量治療組和鹽水組，每組10 只，常規飼喂。人參、白術、茯苓、炙甘草購自遼寧中醫藥大學附屬醫院藥房并煎煮，按成人劑量折算為大鼠灌胃中劑量（1.40 g·mL-1），× 2 為高劑量（2.80 g·mL-1），1/2 為低劑量（0.70 g·mL-1），鹽水組灌胃等體積生理鹽水，療程2周。

2.2 ATP、MMP和ROS水平

按文獻[3]方法裂解股四頭肌組織，分別測定ATP和H2O2含量（間接評價ROS 水平）[7]；提取線粒體，測定MMPs，嚴格按照試劑盒說明書操作。去除線粒體的胞漿蛋白用于后續測定Cyt-c蛋白表達。

2.3 LC3B、p62、Bcl-2、Bax、Cyt-c、cleaved-Caspase3和PARP蛋白表達

采用Western blot 法，其中LC3B、p62 蛋白表達使用上述線粒體提取物，Cyt-c 使用胞漿蛋白，Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase 3、PARP 使用總蛋白；總蛋白/線粒體裂解液裂解肌組織/線粒體沉淀；BCA 蛋白定量；以30 μg 蛋白計算加樣量，SDS-PAGE 凝膠電泳；PVDF 轉膜（0.25 μm）；5%BSA 封閉1 h；4℃搖床孵育16 h；TBST 洗膜；二抗孵育1 h；TBST 洗膜后化學發光顯影。AlphaView SA 軟件灰度分析；目的蛋白/COX-4或GAPDH計算相對表達量。

2.4 統計方法

采用SPSS17.0 統計軟件，計量數據以均值±標準差（±s）表示，組間比較采用方差分析，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 抓力和體質量

與對照組比較，鹽水組抓力和體質量下降（P ＜0.05，P＜0.01）。與鹽水組比較，低劑量組二者未見差異（均P＞0.05）；中、高劑量組抓力升高（均P＜0.01）；體質量未見差異（均P＞0.05）。與中劑量組比較，高劑量組二者未見差異（均P＞0.05）（表1）。

表1 5組大鼠抓力與體質量水平（±s；n = 10）

表1 5組大鼠抓力與體質量水平（±s；n = 10）

注：與對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與鹽水組比較，##P ＜0.01

對照組鹽水組低劑量組中劑量組高劑量組抓力/g 1835.2±195.151453.0±319.59**1507.6±198.501668.6±215.95##1731.6±263.74##體質量/g 396.58±15.96310.36±18.59*299.89±12.51303.02±13.60300.74±12.55

3.2 ATP、MMP和H2O2水平

與對照組比較，鹽水組股四頭肌ATP、MMP 水平下降（均P＜0.001），H2O2水平升高（P＜0.05）。與鹽水組比較，低劑量組三者未見差異（均P＞0.05）；中、高劑量組ATP、MMP 水平升高（P＜0.01或P＜0.001），H2O2水平下降（P＜0.05，P＜0.01）。與中劑量組比較，高劑量組ATP、MMP 水平未見差異（均P＞0.05），H2O2水平下降（P＜0.05）（表2）。

表2 5組大鼠股四頭肌ATP、MMP和H2O2水平（±s；n = 6）

表2 5組大鼠股四頭肌ATP、MMP和H2O2水平（±s；n = 6）

注：與對照組比較，*P ＜0.05，***P ＜0.001；與鹽水組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01，###P ＜0.001；與中劑量組比較，△P ＜0.05

對照組鹽水組低劑量組中劑量組高劑量組ATP（μM）11.20±0.664.12±0.15***4.54±0.299.36±1.01###9.47±1.04##MMP 4.838±0.4891.937±0.576***2.030±0.5003.670±0.178##3.800±0.561##H2O2（μM）1.134±0.1981.532±0.138*1.206±0.1841.030±0.149#0.809±0.127##△

3.3 LC3B、p62蛋白表達

Western blot 實驗結果顯示，與對照組比較，鹽水組股四頭肌LC3B-II 蛋白表達升高（P＜0.05），p62 表達下降（P＜0.001）。與鹽水組比較，低劑量組二者表達未見差異（均P ＞0.05）；中、高劑量組LC3B-II 表達下降（均P＜0.05），p62 表達升高（均P＜0.05）。與中劑量組比較，高劑量組二者表達未見差異（均P ＞0.05）（圖1、表3）。

圖1 5組大鼠股四頭肌LC3B及p62蛋白印跡分析

表3 5組大鼠股四頭肌LC3B及p62蛋白相對表達量（±s；n = 4）

表3 5組大鼠股四頭肌LC3B及p62蛋白相對表達量（±s；n = 4）

注：與對照組比較，*P ＜0.05，***P ＜0.001；與鹽水組比較，#P ＜0.05

對照組鹽水組低劑量組中劑量組高劑量組LC3B 0.977±0.1121.174±0.118*1.211±0.1790.920±0.125#1.007±0.146#p620.470±0.0650.252±0.016***0.241±0.0340.412±0.034#0.497±0.017#

3.4 Bcl-2、Bax、Cyt-c、cleaved-Caspase3、PARP 蛋白表達

Western blot 實驗結果顯示，與對照組比較，鹽水組股四頭肌Bax、Cyt-c、cleaved-Caspase3 和PARP 蛋白表達升高（P＜0.05 或P＜0.01 或P＜0.001），Bcl-2表達下降（P＜0.001）。與鹽水組比較，低劑量組各蛋白表達未見差異（均P＞0.05）；中、高劑量組Bax、Cytc、cleaved-Caspase3 和PARP 表達下降（P＜0.05 或P＜0.01 或P＜0.001），Bcl-2 表達升高（均P＜0.01）。與中劑量組比較，高劑量組Bax 表達下降（P＜0.01），其余表達未見差異（均P＞0.05）（圖2、表4）。

4 討論

前期研究發現，脾氣虛證模型大鼠肌力下降，但四君子湯對其是否具有修復作用并不清楚[3]。為此，我們檢測了不同濃度四君子湯對脾氣虛證模型大鼠抓力的影響。實驗結果表明，中、高劑量四君子湯能夠提高大鼠肌力。

線粒體產能是細胞執行生物學功能的基礎，也是“脾主肌肉”的重要環節，骨骼肌富含線粒體，其收縮需消耗大量ATP，線粒體損傷則收縮力下降。前期研究發現，脾氣虛證模型大鼠呼吸鏈代謝產物ATP、MMP 水平下降，H2O2水平升高，推測四君子湯可能通過影響呼吸鏈代謝提高肌力。為此我們進一步檢測了不同濃度四君子湯治療脾氣虛證模型大鼠股四頭肌ATP、MMP 和H2O2水平。實驗結果表明，中、高劑量四君子湯均能減少ROS 積累，恢復MMP 并提高線粒體產能，不僅如此，高劑量四君子湯對ROS 的清除作用更加顯著。

表4 5組大鼠股四頭肌Bcl-2、Bax、Cyt-c、cleaved-Caspase3及PARP蛋白相對表達量（±s；n = 4）

表4 5組大鼠股四頭肌Bcl-2、Bax、Cyt-c、cleaved-Caspase3及PARP蛋白相對表達量（±s；n = 4）

對照組鹽水組低劑量組中劑量組高劑量組Bcl-20.731±0.0670.452±0.048***0.529±0.1170.628±0.143##0.620±0.102##Bax 0.533±0.0811.018±0.166***0.992±0.1770.751±0.185##0.430±0.040###△△Cyt-c 0.879±0.1011.017±0.119*0.890±0.0780.812±0.114#0830±0.129#Caspase30.288±0.0320.433±0.081**0.430±0.0110.309±0.023#0.275±0.051#PARP 0.704±0.0961.002±0.177**1.025±0.1610.800±0.100#0.676±0.099##

MMP正常是線粒體進行氧化磷酸化、產生ATP的先決條件，維持其穩定有利于發揮細胞的正常生理功能；ROS 作為線粒體代謝副產物，其異常積累可組成攻膜復合體，損害MMP進而影響產能，如持續積累，可誘導細胞凋亡。對此，細胞可啟動線粒體自噬機制清除損傷，維護內環境穩態[8，9]。我們的研究發現脾氣虛證模型大鼠股四頭肌線粒體自噬紊亂，但細胞凋亡情況不明，四君子湯是否能夠影響自噬和凋亡機制也并不清楚。

線粒體自噬是細胞選擇性降解損傷線粒體的分解代謝過程。LC3B 是自噬過程中的特異性信號蛋白，其具備兩種空間構象，在自噬發生時，LC3B-I 與PE 泛素樣結合并轉變為LC3B-II，LC3B-II 與下游自噬相關受體結合，啟動自噬過程；而p62作為自噬的底物常與LC3B-II 共同作為衡量自噬流的標準[10-12]。適度水平自噬有利于維持能量供應及細胞內環境穩態，但當線粒體損傷嚴重時，線粒體無法通過有效自噬清除損傷，自噬紊亂可導致凋亡因子如Cyt-c 等釋放入胞漿，進而誘導細胞凋亡[13]。實驗結果表明，脾氣虛證模型大鼠股四頭肌線粒體自噬水平升高，經中、高劑量四君子湯治療后線粒體自噬水平下降。該結果提示，脾氣虛狀態下股四頭肌線粒體自噬水平上調，但過度自噬并未提高OXPHOS 功能，該結果也證明適度自噬能夠應對應激，而過度自噬將損害線粒體網絡。經中、高劑量四君子湯治療后線粒體維持基礎自噬水平，推測四君子湯可能通過減少過度自噬并維持適度自噬進而降低ROS 積累，恢復MMP 并提高線粒體產能，最終導致線粒體網絡恢復正常。

抗凋亡蛋白Bcl-2 及促凋亡蛋白Bax 均為Bcl-2家族成員。Bax 是線粒體應激引起細胞凋亡的關鍵組分，受凋亡性刺激后，Bax 形成寡聚體并轉位至線粒體膜，增加膜的通透性并導致Cyt-c 釋放，進而激活caspase 途徑，啟動細胞凋亡；而Bcl-2 能夠通過改變Bax 空間構象抑制細胞凋亡[14，15]。Caspase 3 是凋亡的關鍵執行者，Cleaved-Caspase3 是其活化形式，而PARP作為應激環境下通過DNA修復維持細胞生存能力的重要因子，是體內Caspase-3 的主要剪切靶標之一。因此，PARP 的剪切和Cleaved-Caspase 3 活化可作為衡量細胞凋亡水平的標志[16]。實驗結果表明，脾氣虛證模型大鼠股四頭肌細胞凋亡水平升高，經中、高劑量四君子湯治療后細胞凋亡水平下降；不僅如此，高劑量四君子湯還能顯著降低Bax 表達和ROS 水平。提示脾氣虛狀態下過度自噬并未修復線粒體損傷，不僅如此，線粒體應激還導致Bcl-2/Bax失衡，Cytc 釋放并誘導細胞凋亡。經中、高劑量四君子湯治療后，Bcl-2/Bax 恢復平衡，Cyt-c 釋放減少，細胞凋亡水平下降。

線粒體自噬調控機制復雜，研究發現，多種信號通路可介導不同種類的自噬過程，如PINK1/Parkin 依賴的膜電位降低引起的線粒體自噬；與細胞死亡有關的蛋白Bnip3/Nix 介導的線粒體自噬及FUNDC1 參與缺氧介導的線粒體自噬[17]。但何種機制介導脾氣虛骨骼肌自噬紊亂，四君子湯是否直接調控線粒體自噬又是怎樣誘導細胞凋亡還并不清楚。因此，這也是本課題組后續研究重點關注的領域。本研究認為，四君子湯可能通過抑制過度線粒體自噬，維持適度自噬改善線粒體應激，降低細胞凋亡水平治療脾氣虛四肢不用。