UPLC-Q-Exactive四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜聯用快速分析瑤藥黃紅鉆的成分＊

韋 瑋，張 萌，周江煜，郝二偉，謝安然，陸海蘭，王愛玲，梁瓊平，侯小濤**，鄧家剛**

（1. 廣西中藥藥效研究重點實驗室 南寧 530200；2. 農作物廢棄物功能成分研究協同創新中心 南寧 530200；3. 廣西中醫藥大學藥學院 南寧 530200；4. 金秀瑤醫醫院，廣西金秀545700）

瑤醫藥是我國傳統醫藥學的重要組成部分，在漫長醫療實踐中，瑤醫根據藥物的性味功效、臨床應用特點及形態特征，歸納出104 味效果較佳、流傳廣泛、較為常用的瑤藥，并稱為“老班藥”（即祖上傳下的藥物之意），根據功能主治可以分為“五虎”“九牛”“十八鉆”以及“七十二風”。“十八鉆”類瑤藥中含有苯丙素類、萜類、黃酮類、生物堿、有機酸、甾體等多種成分。具有抗癌、鎮痛抗炎、抗氧化、抗衰老、抑菌、保肝、鎮靜抗癲癇等多種作用，傳統瑤醫認為“鉆”類藥物藥效峻猛，能透利關節、疏通經絡，多為活血化瘀、行氣、止痛藥，對瘀阻、濕滯的的患者具有較好的療效，為瑤族民間常用的傳統“打藥”，多用于治療各種“腫癥”[1]。黃紅鉆（wiang hongh nzunx）別名膽草、銅釵風、青竹藤，是木犀科植物厚葉素馨（Jasminum pentaneurumHand.-Mazz）的莖葉，在瑤族有著悠久的使用歷史，主要分布于廣東、海南、廣西，屬于鉆類瑤藥“十八鉆”之一。廣西以金秀瑤族自治縣為主要分布區，此外還分布于上思、靈山、羅城、防城、巴馬、梧州、鹿寨、玉林、上林等地。其味苦、甘、辛，性平；具有止咳化痰、健脾消腫、補腎益肺、祛風通絡等功效；瑤族民間用于崩閉悶（風濕痛、類風濕性關節）、播沖（跌打損傷）、卡西悶（胃痛）、榮古瓦卡西悶（產后腹痛）以及流心黑身翁（虛弱浮腫）等[2]。

瑤藥在瑤族民間使用廣泛，但卻缺少系統的現代藥學研究。由于歷史的原因，瑤族沒有形成自己的文字，瑤醫藥傳承僅靠口授心傳，面臨著失傳的風險，急需進行系統的研究并加以保護。近些年來，為了促進瑤醫藥的發展和保護，《瑤醫效方選編》《中國瑤醫學》《中國瑤藥學》《實用瑤醫學》《瑤醫常用植物藥化學與藥理研究》和《中國現代瑤藥》等著作相繼出版，為瑤藥的研究及保護等提供了技術依據。為了提升瑤藥材質量，推廣瑤藥，《廣西壯族自治區瑤藥藥材質量標準（第一卷）》已收載部分“十八鉆”類瑤藥質量標準。本課題組承擔了“廣西瑤藥材質量標準（第二卷）品種研究項目”《瑤藥材黃紅鉆質量評價與標準研究（部分）》，前期已開展黃紅鉆的質量標準研究及化學成分[3，4]研究，結果表明，黃紅鉆中主要有酚酸類及環烯醚萜苷類化合物，包括反式肉桂酸、10-hydroxyoleoside-11-methyl ester、10-hydroxyoleoside dimethyl ester、10- (3-hydroxy-4-methoxybenzoate) -ligustroside、別旁茶苷等，但還未對黃紅鉆的全成分進行系統分析研究。

本研究采用UPLC-Q-Exactive 四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜技術，利用其具有高分辨率、高靈敏度等特點，結合自動觸發多級質譜技術，得到黃紅鉆化學成分質譜數據，根據分離的對照品和數據庫，比對各色譜峰的一級、二級質譜數據，首次對黃紅鉆主要成分進行了全面準確的快速識別，共鑒定了23個成分，其中包括有機酸類8個、生物堿類3個、木脂素類3個以及環烯醚萜苷類5 個。黃紅鉆療效確切，但尚無有關黃紅鉆藥理活性、質量標準等的文獻報道，這與其在瑤族地區的廣泛應用是不匹配的。

本研究通過對黃紅鉆成分的全面分析，以及前期進行的黃紅鉆化學成分的分離鑒定[3，4]，可以為黃紅鉆質量標準的研究提供定量、定性的指標性成分；同時也為黃紅鉆藥效物質基礎、質量控制及臨床應用等提供了科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UPLC-Q Exactive 四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜儀（Thermo Fisher Scientific 公司，美國），離子源采用HESI 源（heated ESI），Thermo Gold C18色譜柱（2.1 mm × 100 mm，1.9 μm），Xcalibur 3.0 軟 件（Thermo Fisher Scientific 公司，美國），十萬分之一天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司），超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），粉碎機（天津太斯特儀器有限公司）。

1.2 試劑

乙腈為質譜純（默克公司，美國），超純水（Milli-Q SP Regent Water system，美國），乙酸銨為質譜純（Fisher，美國），甲醇為分析純（科隆化學品有限公司，成都），甲酸為色譜純（東京化成工業株式會所，日本），其余試劑為分析純。

1.3 藥材

黃紅鉆藥材采于廣西壯族自治區金秀瑤族自治縣，經廣西中醫藥大學韋松基教授鑒定為木犀科厚葉素馨（Jasminum pentaneurumHand.-Mazz）的莖葉。

2 方法

2.1 UPLC檢測條件

色譜柱為Thermo Gold C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；流動相：乙腈A-0.1%甲酸水（含10 mmol 乙酸銨）B；梯度洗脫：0-2.0 min，5%A；2.0-42.0 min，5%-95%A；42.0-47.0 min，95%A；47.1-50 min，95%-5%A；流速為0.3 mL·min-1；進樣量1 μL；柱溫35℃。

2.2 MS檢測條件

離子源采用HESI源（heated ESI），噴霧電壓：3.5 kV(+)、3.2 kV (-)，鞘氣體積流量：30 μL·min-1，離子傳輸管溫度：320°C；輔助氣體流量：10 μL·min-1；輔助氣溫度：300°C。掃描方式Full MS/dd-MS2 模式，采用正、負離子同時采集，掃描m/z范圍：100-1500，其中一級Full MS 全掃描選擇分辨率為70000 FWHM，dd-MS2的二級掃描選擇分辨率為17500 FWHM，特定離子掃描模式為“off”，噴霧氣為氮氣，碰撞氣為高純氮。

2.3 供試品溶液

干燥黃紅鉆藥材粉碎，過65 目篩，精密稱取黃紅鉆藥材粉末1 g（精確至0.0001 g），置于具塞錐形瓶中，加入70%甲醇25 ml，稱定質量，超聲提取30 min，再次稱定質量，用70%甲醇補足失重，過0.22 μm 微孔濾膜，即得。

3 結果與分析

取黃紅鉆供試品溶液及混合對照品儲備液，按“2.1”、“2.2”項下色質譜條件進行分析，分別得到正、負離子及質譜圖（圖1）。使用Xcalibur 3.0軟件對高分辨質譜信息進行數據分析，結合相關文獻報道、中醫藥資料庫及對照品進行化合物的確認（表1）。

圖1 黃紅鉆UPLC-Q-Exactive MS的TLC圖

3.1 有機酸類

有機酸類化合物廣泛存在于自然界植物中。本實驗從黃紅鉆中共鑒定出了8 個有機酸類化合物，分別為莽草酸、原兒茶醛、丁香醛、苯甲酸、對羥基肉桂酸、對羥基安息香醛、阿魏酸乙酯以及6-姜酚。酚酸類化合物在負離子模式下一般能夠產生豐度較大的準分子離子峰[M-H]-，在二級質譜中一般都會丟失中性分子（如H2O、CO、CO2等）。以莽草酸為例，該化合物分子式為C7H10O5，負離子模式下，得到m/z173.0450[M-H]-的準分子離子峰，響應值較正離子模式好。該化合物的二級離子碎片信息主要有m/z137.0241、111.0449、93.0343，分 別 對 應[M-H-2H2O]-、[M-HH2O-CO2]-、[M-H-2H2O-CO2]-，根據該化合物的精確分子量、二級裂解方式以及文獻報道[5]，確定該化合物為莽草酸。

3.2 生物堿類

在ESI+模式下，共鑒定出3 個生物堿類化合物。化合物5保留時間為1.49 min，一級質譜顯示該化合物的準分子離子峰為m/z123.0553 [M+H]+，進一步進行二級質譜掃描，碎片離子為m/z106.0290，是由于準分子離子丟失一個NH2后形成，繼續丟失一中性分子CO得到碎片離子。化合物6保留時間為3.81 min，準分子離子峰m/z263.1749 [M+H]+，對母離子進行MS/MS 掃描，主要產生2 個碎片離子，分別為m/z245.1643[M+H-H2O]+，150.1279[M+H-H2O-C5H5NO]+，結合文獻報道，鑒定該化合物為氧化槐果堿。同理，根據峰19 的準分子離子峰m/z336.1226 [M+H]+，以及二級質譜碎片離子m/z318.0760[M+H-CH3-H-2H]+、292.0963[M+H-CH3-H-CO]+，并結合文獻報道[6]，鑒定該化合物為小檗堿。

3.3 木脂素類

表1 UPLC-Q-Exactive四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜對黃紅鉆化學成分的鑒定分析結果

木脂素類化合物為苯丙素氧化聚合而成。黃紅鉆中鑒定的該類化合物均為苯丙素二聚體并帶糖的木脂素類。這些化合物均易脫去葡萄糖或者鼠李糖殘基。比如刺五加苷及松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷均丟失葡萄糖基。苷元在正離子模式下容易丟失H2O中性分子。此外，苷元可斷開呋喃環從而得到相應的碎片離子。以松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷[7]為例，該化合物的保留時間為11.48 min，正離子模式下該化合物的準分子離子峰為m/z538.2275[M+NH4]+，準分子離子峰直接丟失一個葡萄糖和H2O 中性分子得到m/z341.1372[M+H-Glc-H2O]+，此后分子中的呋喃環開裂并伴隨丟失苯環上的一分子甲氧基從而得到m/z175.0754[M+Na-Glc-H2O-C7H7O2-OCH3]+。

圖2 莽草酸的質譜主要裂解途徑

圖3 氧化槐果堿質譜主要裂解途徑

圖4 松脂醇-β-D-吡喃葡萄糖苷質譜主要裂解途徑

3.4 環烯醚萜苷類

本實驗鑒定了5個環烯醚萜苷類成分。根據前期結果，黃紅鉆中的含量較大的主要成分為裂環環烯醚萜苷類，且化合物21 為新的裂環環烯醚萜苷類化合物[3]。除了化合物10 以外，其他化合物均有丟失162的葡萄糖分子，得到苷元離子。對苷元離子進行二級質譜分析，結果表明，這類化合物的苷元大多易失去H2O、CO2、CO、CH3OH 等中性分子。下面以藥材中含量較大的化合物7、20、21為例說明其裂解途徑。

化合物7 的保留時間為5.31 min，在負離子模式下，一級質譜信息顯示，該化合物的準分子離子峰為m/z419.1194[M-H]-，以此為母離子進行二級質譜掃描，碎片離子為m/z375.1263，為丟失1 個中性CO2分子；碎片離子為m/z239.0562，是母離子丟失1個Glc及1 個中性H2O 分子；碎片離子m/z195.0899 是準分子離子峰接連丟失1 分子Glc、1 分子H2O 和1 分子CO2所致。根據裂解規律，并與對照品比對并結合文獻[3,8]，鑒定該化合物為10-hydroxyoleoside 11-methyl ester（圖5）。

化合物20的保留時間為15.37 min，負離子模式下給出該化合物的準分子離子峰為m/z549.1686[M-H]-，以此為母離子進行二級質譜掃描，得到m/z239.4657的碎片離子，為母離子丟失1 分子的Glc，隨后丟失1分子的肉桂酸酰基所致。除此以外，還得到了其他離子碎片m/z221.0453[M-H-Glc-C9H6O-H2O-H2O]-、177.0554[M-H-Glc-C9H6O-H2O-H2O-CO2]-、145.0292[M-H-Glc-C9H6O-H2O-H2O-CO2-CH3OH]-、117.0344[M-H-Glc-C9H6O-H2O-H2O-CO2-CH3OH-CO]-。根據裂解規律，并與對照品比對，結合文獻[3,8]，鑒定該化合物為Jasminoside（圖6）。

化合物21 為前期從黃紅鉆中分離鑒定的新的裂環環烯醚萜苷類化合物。與其他環烯醚萜苷類似，該化合物的負離子模式給出準分子離子峰為m/z689.2081[M-H]-，以該母離子進行MS/MS 掃描，首先得到二級碎片離子m/z527.1548[M-H]-，為母離子丟失一分子Glc 所致。二級質譜離子m/z389.0891，為母離子連續丟失一個Glc，一個對羥基苯乙烷分子，一個H2O得到。m/z389.0891 的碎片離子陸續丟失CH2O 及中性分子CO2得到m/z359.1129 及m/z359.1129。m/z291.0877為該化合物經類似于非裂環環烯醚萜苷類化合物母環斷裂，生成1,6F-特征碎片離子的模式而產生[8]。根據裂解規律，并與對照品比對，鑒定該化合物為10-(3-hydroxy-4-methoxy-benzoate)-ligustroside（圖7）。

圖5 化合物10-hydroxyoleoside 11-methyl ester的質譜裂解途徑

圖6 化合物jasminoside的質譜裂解途徑

4 討論與結論

本研究通過高分辨質譜正、負離子模式檢測黃紅鉆藥材中所含成分，根據各成分所形成的色譜峰在質譜中的色譜保留時間、精確相對分子質量、質譜裂解規律和二級質譜離子碎片信息，并結合對照品的質譜信息和參考文獻，快速地闡明了黃紅鉆中的成分并首次鑒定出黃紅鉆中的23 個化學成分，包括有機酸類8個、生物堿類3 個、木脂素類3 個、環烯醚萜苷類5 個，并對有機酸、生物堿、木脂素、環烯醚萜苷四類成分的裂解途徑進行了分析總結。本研究為其后續藥效物質基礎的研究以及更深入的開發利用提供了依據。

圖7 化合物10-(3-hydroxy-4-methoxy-benzoate)-ligustroside的質譜裂解途徑