國醫大師尼瑪治療藏醫“青乃丹吾”病的用藥規律研究和潛在靶點預測＊

仁增加，李啟恩，2，切羊讓忠，彭毛東主，3，貢卻堅贊，2＊＊

（1. 青海大學藏醫學院 西寧 810000；2. 藏藥新藥開發國家重點實驗室 西寧 810000；3. 青海省藏醫院 西寧 810016）

“青乃丹吾”病是藏醫學18種肝病之一，對應于現代醫學疾病分類中的乙型肝炎（HBV）[1]，是引起肝硬化、肝細胞癌的主要因素之一[2]，據世界衛生組織報道，全球約20 億人曾感染HBV，其中2.4 億人為慢性HBV 感染者[3]，每年約有65 萬人死于HBV 感染所致的肝功能衰竭、肝硬化和肝細胞癌[4]。我國肝硬化和肝細胞癌患者中，由HBV感染引起的比例分別為60%和80%[5]。近年來藏醫臨床研究表明，藏藥治療乙型肝炎具有獨特的療效和臨床價值[6]。

國醫大師是當代名老中醫的杰出代表，體現著當代中醫學術和臨床發展的最高水平[7]。藏醫泰斗尼瑪是青海省首位國醫大師，也是全國名中醫和中華非物質文化遺產傳承人，現年88歲高齡仍供職于青海省藏醫醫院，依然堅持服務患者，已從事藏醫臨床工作63年，有著豐富的臨床經驗和獨到的學術見解。其醫案作為臨床經驗記錄的載體，是分析和挖掘中醫治療有效性和實用性的科學依據[8]。因此本文以臨床醫案為切入點，運用數據挖掘方法分析國醫大師尼瑪治療“青乃丹吾”病的用藥規律，探究其用藥思想和經驗處方背后的潛在特點，為藏醫臨床用藥提供新的指導思想和理論依據。

1 資料與方法

1.1 資料來源

本研究的醫案數據來源于國醫大師尼瑪傳承工作室數據庫，以治療“青乃丹吾”病（乙型肝炎）的醫案處方信息為研究對象，收集2014年1月3日-2016年5月23日期間在青海省藏醫院診治的門診患者的有效病例資料，包括患者姓名、就診時間、年齡、性別、藏醫診斷、西醫診斷、藏藥處方等信息。

1.2 診斷標準

西醫診斷以2015年中華醫學會肝病學分會和感染病學分會制定的《慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）》為依據。藏醫診斷以《四部醫典》記載的“青乃丹吾”病證候為依據。

1.3 納入標準

①符合藏醫“青乃丹吾”病的診斷標準；②西醫診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）》；③性別及年齡不限。

1.4 排除標準

①診斷不符合上述標準者；②患有嚴重的精神障礙和腫瘤患者等；③西藥介入的醫案。

1.5 研究方法與數據分析

從青海省藏醫院共收集到510例國醫大師尼瑪治療“青乃丹吾”病的病歷，依據排除標準整理和去重處理后，得到有效病歷452 例，應用SPSS Modeler 18.0 和TBtools v0.66837 軟件進行關聯規則（Apriori）和層次聚類分析。應用BATMAN-TCM、Genecard、String、R語言等數據庫和軟件對高頻藏藥（藥物頻數≥50）進行生物信息學分析。

2 結果

2.1 一般資料

“青乃丹吾”病男性患者301 例，占患者總人數的66.6%，平均年齡（37±14.06）歲。女性患者151 例，占患者總人數的33.4%，平均年齡（34.22±14.68）歲。

2.2 方劑和藥物頻數

在國醫大師治療“青乃丹吾”病的104 首方劑中，使用頻數≧23的藏藥有方劑15首，藥材15個，使用頻數＞100 的方劑有6 首，從高到低依次是二十五味馬寶丸（282 次）、七味紅花殊勝散（235 次）、松石膠囊（233）、甘露月晶丸（214次）、十八味紅花散（210次）和仁青芒交（164 次）。使用頻數＞33 的藥材有6種，從高到低依次為訶子（63 次）、川木香（53 次）、紅花（50次）、豆蔻（38 次）、余甘子（37 次）、和肉豆蔻（34次）（表1）。

表1 國醫大師尼瑪治療“青乃丹吾”病處方中用藥頻數≧23的方劑和藥材

2.3 方劑和藥材關聯規則

運用SPSS Modeler 18.0軟件中的Apriori算法對藏藥方劑和藥材進行關聯規則分析，設置最小支持度為10%，方劑最小置信度為75%，藥物最小置信度為80%，得到置信度最高的藏藥方劑組合為二十五味馬寶丸-十三味紅花丸→松石膠囊，藥材組合為余甘子-毛訶子→訶子（表2、圖1）。

2.4 擇時用藥規律分析

藏醫學根據時令、飲食、疾病性質、人的體質和年齡，以及隆、赤巴、培根“三因”的蓄、發、息期等因素，采取不同的服藥方法，具有鮮明的擇時用藥特點，這一特點在國醫大師尼瑪治療“青乃丹吾”病的用藥原則中尤為突出。本文將擇時用藥特點和方劑藥性結合分析發現，國醫大師尼瑪治療“青乃丹吾”病時清晨以解毒類方劑為主，早上以保肝類方劑為主，中午以清熱除瘟類方劑為主，晚上以調隆舒肝類方劑為主，擇時用藥的藥性以治療赤巴為主，調隆為輔，降培根為次（圖2）。

表2 國醫大師尼瑪治療“青乃丹吾”病的藏藥方劑關聯規則

圖1 藏藥方劑中高頻藥材之間的關聯規則弦圖

2.5 方劑功效分類

依據數據庫中的104 首方劑，對全部方劑的功效參照文獻進行分類統計，并應用cytoscape 3.7.2軟件按度值大小構建“分類-方劑”的網絡圖，度值最高的前5類方劑分別是清熱解毒藥、溫胃消食藥、清肝熱藥、調和查隆藥和驅蟲藥（圖3）。

2.6 方劑藥性聚類分析

選取頻數≧12的方劑，依據藏醫“味性化味”藥性理論，參照《四部醫典》《晶珠本草》《藏藥晶鏡本草》等經典著作整理每首方劑的組成藥材、藥味、劑量、藥性等。繪制味和化味的頻數分布（圖4），并運用層次聚類分析法之中的組間平均法，區間采用Euclidean 距離，分析和構建國醫大師尼瑪治療“青乃丹吾”病高頻方劑的藥性聚類圖（圖5）。結果發現，國醫大師尼瑪治療“青乃丹吾”病高頻方劑的味和化味均以苦和甘為主，藥性以重、涼、鈍為主。

2.7 高頻藥物治療“青乃丹吾”病的潛在靶點預測

2.7.1 交集靶點與PPI蛋白互作網絡的構建

將頻數≥50 的訶子、木香、紅花三味藥輸入到BATMAN-TCM 在線分析工具，將“Cutoff”值設為80，“AdjustP-value”設為0.01[9]，去重處理后得到364個靶點，與“Hepatitis B”為檢索詞在Genecards（https://www.genecards.org/）數據庫設Relevance Score ＞7.5 獲取的1411 個靶點，進行交集后得80 個基因。將80 個交集基因上傳至String 數據庫，物種選為Homo sapiens，評分條件設為0.4，然后利用cytoscape 軟件構建作用靶點 互 作 網 絡 圖，顯 示AKT1（degree = 42）、TNF（degree = 28）、JUN（degree = 25）的度值最高，推測這些靶點可能是治療乙型肝炎的關鍵靶點（圖6）。

2.7.2 GO功能和KEGG富集分析

利用perl 工具將80 個關鍵靶點轉為entrez ID，然后以R 語言為平臺，運用“clusterProfiler”程序包，利用Bioconductor 提供的GO 注釋信息和KEGG pathway 數據庫，以P＜0.05為條件，進行信號通路富集可視化分析[10]。GO 功能富集結果顯示，其主要涉及輔因子結合（16個靶點）、羧酸結合（12個靶點）、有機酸結合（12個靶點）、核受體活動（11 個靶點）、轉錄因子活性、直接配體調控序列特異性DNA結合（11個靶點）、類固醇激素受體活性（11個靶點）、類固醇結合（9個靶點）、血紅素結合（9 個靶點）和四吡咯結合（9 個靶點）等生物學調控過程（圖7）。

圖2 藏醫治療“青乃丹吾”病擇時用藥規律樹狀圖

KEGG 通路富集結果顯示，其主要涉及Rap1 信號通路（11 個靶點）、鞘脂信號通路（9 個靶點）、ErbB 信號通路（10 個靶點）、HIF-1 信號通路（8 個靶點）、FoxO信號通路（8個靶點）、內分泌抵抗（7個靶點）和磷脂酶D 信號途徑（7 個靶點）等，表明高頻藥物可能作用于這些通路達到治療乙型肝炎的目的（圖8）。

3 討論

藏醫學認為，“青乃丹吾”是精華未化和多攝味性相克之飲食，導致精華隨糟粕混合入脈，瘟毒蓄積于肝臟而引起，其本質為陳舊熱和瘟毒。方劑和藥材頻數分析發現，國醫大師尼瑪治療“青乃丹吾”病使用次數最多的方劑中二十五味馬寶丸（劑量1.0 g）和仁青芒覺（劑量1.0 g）具有清熱解毒的作用，主治各類中毒癥、陳舊熱、木布等疾病。七味紅花殊勝散（劑量0.9 g）和十八味紅花散（劑量1.05 g）具有清熱消炎、保肝退黃的功效，用于新舊性肝病，勞傷引起的肝血增盛和肝腫大。松石膠囊（劑量0.75 g）有清熱解毒，疏肝利膽的功效，主治血瘀及熱性肝病。甘露月晶丸（劑量1.2 g）主治肝毒癥、木布等疾病。使用次數最多的單味藥材訶子能平衡三因、減少藥物的毒副作用，川木香、紅花、豆蔻、余甘子等具有行隆保肝、清熱涼血等功效。從關聯度最強的核心方劑組合二十五味馬寶丸-十三味紅花丸→松石膠囊可以看出，國醫大師尼瑪治療“青乃丹吾”病以解毒、清肝熱、保肝為主進行治療。核心單味藥材余甘子-毛訶子→訶子組成的基礎方在藏藥中稱之為“三果湯”，是藏醫臨床常用的加減方和藥引劑，也是本次研究的23 例方劑的核心藥材，具有調和氣血、增強藥性、減少毒副作用的功效。以上用藥規律，體現了國醫大師治療“青乃丹吾”病的同時特別關注藥物毒副作用的治療原則。

圖3 分類-方劑統計網絡圖

圖4 高頻方劑的味和化味頻數條形圖

圖5 高頻方劑的藥性聚類圖

圖6 高頻藏藥治療乙肝的PPI蛋白互作網絡圖

藏醫的因時用藥與現代時辰藥理學的觀點不謀而合，這既體現了藏醫理論特色又符合疾病的發生與轉歸[11]。從擇時用藥規律分析發現，國醫大師尼瑪在實際用藥時，清晨以二十五味馬寶丸（n= 220）、仁青芒覺（n= 140）等治療“青乃丹吾”病主要病因的方劑為主，有中毒癥狀時輔以藏醫治療毒癥藥物仁青芒覺[12]；早上以七味紅花殊勝散（n=178）、十三味紅花丸（n=80）、甘露月晶丸（n=78）等保肝和助胃火類方劑配合應用；因“青乃丹吾”在藏醫學中屬于熱病的范疇，且中午又恰為熱病之發病期，故在中午時選擇十八味紅花散（n= 179）、九味牛黃丸（n= 52）等清熱除瘟的方劑進行治療；晚上則選擇松石膠囊（n= 141）、甘露月晶丸（n=60）等舒肝調隆的方劑，因為在藏醫學中隆病是很多疾病的誘因，因此在疾病治療過程中需時刻監視和調和隆，這樣才能起到良好的治療效果。

方劑分類分析結果顯示，尼瑪國醫大師治療“青乃丹吾”的104首方劑中，清熱解毒藥和溫胃消食藥的使用頻率最高，其次為清肝熱藥、調和查隆藥和驅蟲藥，再次為干黃水、調理白脈藥和調隆安神藥。此結果很好地揭示了國醫大師尼瑪針對“青乃丹吾”是精華未化導致精華隨糟粕混合入脈，瘟毒蓄積于肝臟而引起的基本病機，陳舊熱和瘟毒是“青乃丹吾”的本質，隆失調為其常見伴發病等特點，進行標本兼職的基本原則和用藥規律。

圖7 交集基因GO功能富集柱狀圖

頻數≧12的方劑的味、化味和藥性聚類分析結果顯示，六味中以苦和甘為主，辛澀為次；三化味中以苦和甘化味為主，主治赤巴病及兼顧隆的調節；藥性聚類中鈍、涼、重、稀、糙為一類，藥性數值最高，分別作用于赤巴的銳、熱、輕和隆的輕、柔等性質，具有清熱、止痛、解毒、安神、清脈管等功效。第二類藥性聚類中柔、潤、穩、輕、動、干、熱、溫、燥、銳、寒、軟等藥性數值相對較高，其中溫、燥、銳的藥性值最低，提示國醫大師尼瑪治療“青乃丹吾”病的藥性配伍以遞增鈍、涼、重、稀、糙為主，遞減穩、燥、銳的藥性為輔，在消除疾病本質的同時，加強對隆的調和，以防止病情反彈。

圖8 KEGG通路富集分析氣泡圖

通過BATMAN-TCM、Genecards、String 數據庫對高頻藥物訶子、木香、紅花進行網絡藥理學分析發現，與乙型肝炎有關的主要靶點有AKT1、TNF、JUN 等，GO 功能主要富集在核受體活動、轉錄因子活性、直接配體調控序列特異性DNA 結合、類固醇激素受體活性、羧酸結合等生物過程。KEGG 通路主要富集在Rap1 信號通路、鞘脂信號通路、ErbB 信號通路、HIF-1信號通路、FoxO 信號通路等，表明高頻藥物的活性成分和關鍵靶點可能通過調控上述主要生物功能和通路達到治療乙型肝炎的目的，但這一預測尚需通過相關藥理和分子生物學實驗進行驗證。

綜上，本研究通過采用數據挖掘技術初步分析了國醫大師尼瑪治療“青乃丹吾”病的用藥特點和規律，并利用網絡藥理學分析預測了潛在作用靶點。得出尼瑪國醫大師治療“青乃丹吾”病以解毒、清肝熱、保肝為主，輔以調和隆和養胃火，使用方劑的藥性配伍以鈍、涼、重、稀、糙為主。推測AKT1和TNF 可能是治療乙型肝炎的潛在關鍵靶點。本研究是對尼瑪國醫大師多年治療藏醫“青乃丹吾”病經驗的總結，可為后續深入研究藏醫治療“青乃丹吾”病的作用機制和指導藏醫臨床用藥提供新的思路。