HPLC-MS/MS法測定人體血液中阿米替林的濃度

陳澤冠

摘 要：目的：建立血液中阿米替林的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）檢測方法。方法：以乙腈為沉淀劑，經(jīng)蛋白質(zhì)沉淀，取上清液進(jìn)高效液相串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)（LC-MS/MS）分析。結(jié)論：阿米替林的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-0.00996052+2.83477*X（R^2=0.9998），定量下線為10ng/mL（S/N≥10：1），線性范圍為10～300ng/mL。阿米替林的精密度（RSD）在0.60～1.64%之間，準(zhǔn)確度為99.08～122.84%，在低、中、高質(zhì)量濃度下，阿米替林的平均提取回收率為97.99～98.22%。該方法操作簡單，靈敏度高，特異性強(qiáng)，可用于血液中阿米替林的定量測定。

關(guān)鍵詞：阿米替林;血液;高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

中圖分類號：R115 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1671-2064（2020）01-0247-02

阿米替林（amitripthyline）是臨床最常用的三環(huán)類抗抑郁藥，能選擇性地抑制中樞神經(jīng)突觸部位對去甲腎上腺素（NA）和5-羥色胺（5-HT）的再攝取，使突觸NA和5-HT的含量增加并促進(jìn)突觸后膜5-HT2受體的敏感性。阿米替林經(jīng)肝臟代謝，主要代謝產(chǎn)物為去甲替林，也有阿米替林的N-氧化物和10-羥衍生物以及去甲替林的10-羥衍生物，均有活性。

目前，國內(nèi)外文獻(xiàn)報道的有關(guān)阿米替林血濃度的測定方法較多，包括高效液相色譜法（HPLC）[1]、氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用色譜法（GC-MS）[2]、高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS，LC-MS/MS）[3-5]。本文采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS），采用蛋白沉淀方法測定血液中阿米替林濃度。

1 材料與試藥

1.1 儀器

臺式三重四極桿串接質(zhì)譜系統(tǒng)（含ESI電噴霧離子源）;U3000二元超高效LC;德國賽多利斯Quintix35-1CN。

1.2 試劑

鹽酸阿米替林，批號：100518-201303，純度：99.7%，中國食品藥品檢定研究院;SKF525A，批號：3-SNM-27-2，純度：99.83%，Toronto。

1.3 色譜條件

分析柱為Allure PFP Propyl 100mm×2.1mm×5μm，流動相為乙腈：20mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸緩沖液（70∶30），流速為200μL/min。柱溫為常溫。

1.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（H-ESI）正離子選擇多反應(yīng)檢測（SRM）掃描分析，定量分析離子對分別為：m/z278.300→m/z233.268（阿米替林）;m/z354.300→m/z209.000（SKF525A）。

2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

在空白血液中分別加入阿米替林的工作液，配置成阿米替林濃度分別為10、20、50、100、200、300ng/mL的血液標(biāo)準(zhǔn)液。

3 血液樣品處理

精密量取100μL血液，加入內(nèi)標(biāo)50μL和沉淀劑乙腈900μL，混旋2min，10000轉(zhuǎn)/min離心2.5分鐘，取上清液1μL供LC-MS/MS分析。

4 方法考察

4.1 專屬性

分別取6份不同來源的不服用阿米替林的正常人空白血液100μL，不加內(nèi)標(biāo)，按“血液樣品處理”項處理，進(jìn)樣分析，得空白樣品色譜圖。另取空白血3份，1份加內(nèi)標(biāo)，1份加分析物，1份加內(nèi)標(biāo)和分析物，同法處理，得相應(yīng)色譜圖。

4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下線

含藥標(biāo)準(zhǔn)曲線血液按“血液樣品處理”處理后進(jìn)樣分析。以阿米替林添加濃度為X軸，樣品與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比為Y軸，進(jìn)行線性回歸，經(jīng)“Equal”權(quán)重得阿米替林標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

4.3 精密度、準(zhǔn)確度和提取回收率

取24份空白血液，分別配制定量下線及低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品各6份，按“血液樣品處理”項處理，進(jìn)樣分析，連續(xù)測定3批，計算精密度和準(zhǔn)確度。

分別配制低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品各8份，其中6份于提取前加入工作液和內(nèi)標(biāo)，另2份于提取后加入工作液和內(nèi)標(biāo)，進(jìn)樣分析，計算提取回收率。

4.4 穩(wěn)定性

制備低、高質(zhì)量濃度的血液質(zhì)控樣品，分別考察在常溫光照放置放置24h、反復(fù)凍融3次、-70℃凍存1個月、進(jìn)樣器內(nèi)24h條件下的穩(wěn)定性。

4.5 基質(zhì)效應(yīng)

分別取6種不同來源的空白血清90μL，按“血液樣品處理”處理，得空白基質(zhì)后，分別加入低、高質(zhì)量濃度工作液10μL及內(nèi)標(biāo)50μL，制備成基質(zhì)考察樣品，進(jìn)樣分析，得分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積比值A(chǔ)1。用去離子水代替血液，同法操作，得分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積比值A(chǔ)2。內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子=A1/A2×100%。

5 結(jié)果

5.1 專屬性

阿米替林的保留時間約為4.54min，SKF525A的保留時間約為5.70min，血液中內(nèi)源性物質(zhì)對目標(biāo)分析物及其對應(yīng)內(nèi)標(biāo)的測定無干擾，專屬性好，見圖1。

5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限

阿米替林的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-0.00996052+2.83477* X（R^2=0.9998），定量下線為10ng/mL（S/N≥10∶1），線性范圍為10～300ng/mL。

5.3 精密度、準(zhǔn)確度和提取回收率

阿米替林的精密度（RSD）在 0.60～1.64%之間，準(zhǔn)確度為99.08～122.84%，在低、中、高質(zhì)量濃度下，阿米替林的平均提取回收率為97.99～98.22%，結(jié)果見表1。

5.4 穩(wěn)定性

含藥血液質(zhì)控樣品在常溫光照下放置24h、反復(fù)凍融3次、-70℃凍存1個月、進(jìn)樣器內(nèi)24h各條件下穩(wěn)定，RSD小于15%。

5.5 基質(zhì)效應(yīng)

阿米替林在低和高2個質(zhì)量濃度水平下的內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子RSD分別為1.87%、0.85%，小于15%，樣品測定不受基質(zhì)效應(yīng)影響。

6 討論

本實驗采用LC-MS/MS建立的檢測人血液中阿米替林的方法，所需血液樣品量少，專屬性好，靈敏度高，準(zhǔn)確穩(wěn)定。以乙腈為沉淀劑，采用蛋白沉淀法處理樣品，簡單快捷，可快速對樣品進(jìn)行定性定量分析。

參考文獻(xiàn)

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