組蛋白去乙酰化酶抑制劑CUDC-101對去勢抵抗性前列腺癌AR-V7表達的影響

張燁 張璐 劉修恒

[摘要] 目的 探討組蛋白去乙酰化酶抑制劑CUDC-101對去勢抵抗性前列腺癌（CRPC）雄激素受體剪切變異體7（AR-V7）表達的影響，為臨床提供相應的理論參考。 方法 2018年1月～2019年6月通過免疫印跡法對CRPC的PC-3、VCaP、22Rvl、LNCap等17株細胞株中的AR-V7蛋白表達情況進行檢測，篩選AR-V7表達最高細胞株進一步研究。并按照不同抑制劑分為MG149組和CUDC-101組，比較兩種抑制劑對CRPC細胞中AR-V7表達降低情況。再按照不同制劑方法分為單獨使用MDV3100組、30 nmol劑量CUDC-101聯合應用組、300 nmol劑量CUDC-101聯合應用組，分析對CRPC細胞中AR-V7表達的影響。 結果 CRPC細胞株22Rvl存在AR-V7陽性表達，PC-3、VCaP和LNCap等CRPC細胞株，均未發現AR-V7陽性表達。CUDC-101組AR-V7表達陽性率低于MG149組，差異有統計學意義（P < 0.05）。30、300 nmol 劑量CUDC-101聯合應用組AR-V7陽性表達率均低于單獨使用MDV3100組，差異有統計學意義（P < 0.05）。 結論 組蛋白去乙酰化酶抑制劑CUDC-101應用在CRPC患者中，可以降低AR-V7表達水平，提高內分泌治療敏感性，具有治療CRPC的潛力。

[關鍵詞] 組蛋白去乙酰化酶抑制劑;CUDC-101;前列腺癌;雄激素受體剪切變異體7

[中圖分類號] R733.7? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）03（a）-0011-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of histone deacetylase inhibitor CUDC-101 on the expression of androgen receptor shear variant 7 （AR-V7） in castration-resistant prostate cancer （CRPC）， and to provide relevant theoretical reference for clinical practice. Methods From January 2018 to June 2019， the expression of AR-V7 protein in CRPC PC-3， VCaP， 22Rvl， LNCap and other 17 cell lines were detected by immunoblotting， while the highest AR-V7 expression was screened further the study. According to different inhibitors， the cell lines were divided into MG149 group and CUDC-101 group. The two inhibitors were compared to reduce the expression of AR-V7 in CRPC cells. Then according to different preparation methods， the cell lines were divided into using MDV3100 alone group， 30 nmol dose CUDC-101 combined application group， and 300 nmol dose CUDC-101 combined application group. The effects on the expression of AR-V7 in CRPC cells were analyzed. Results CRPC cell line 22Rvl had AR-V7 positive expression， and PC-3， VCaP and LNCap CRPC cell lines did not find AR-V7 positive expression. The positive rate of AR-V7 expression in the CUDC-101 group was lower than that in the MG149 group， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. The AR-V7 positive expression rate 30， 300 nmol dose CUDC-101 combined application group were lower than that in the MDV3100 group alone， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Histone deacetylase inhibitor CUDC-101 can reduce the expression level of AR-V7， while improve the sensitivity of endocrine therapy. It has the potential to treat CRPC.

[Key words] Histone deacetylase inhibitors; CUDC-101; Prostate cancer; Androgen receptor splice variants 7

前列腺癌是指發生在前列腺的上皮性惡性腫瘤，好發于中老年群體，尤其是70歲以上老年群體發病率保持在較高水平，是男性泌尿系統發病率較高的惡性腫瘤[1]。流行病學調查顯示[2]，全世界每年因前列腺癌死亡的男性患者數量超過25萬，并仍然呈上升趨勢。前列腺癌發病原因比較復雜，目前普遍認為前列腺癌發生與發展依賴于雄激素（AR）信號傳導以及雄激素本身，即AR信號持續傳導在支持腫瘤細胞存活方面發揮著積極作用[3]。針對目前臨床對前列腺癌的治療，對于AR信號通路的過度激活普遍采用雄激素剝奪治療。盡管最初有一定效果，但是絕大部分患者在一段時間的治療后會產生不同程度的抵抗，逐步進展為去勢抵抗性前列腺癌（CRPC）[4]。CRPC的發生意味著前列腺癌發展到嚴重程度，病情十分危急，是臨床上棘手的難題[5]。雄激素受體剪切變異體7（AR-V7）是AR的重要變異體，由于特殊的結構受到越來越多的關注。同時，研究顯示其與CRPC的發生發展以及耐藥性的形成存在密切的關系，與患者的預后存在密切聯系[6]。近年來，隨著CRPC的研究不斷深入，有研究發現組蛋白去乙酰化酶抑制劑對于CRPC患者AR表達具有一定的抑制作用，但目前并無太多報道。本研究通過分析組蛋白去乙酰化酶抑制劑CUDC-101的應用對于CRPC患者AR-V7表達的影響，探究其對于CRPC治療并取得了理想效果。現報道如下：

1 材料與方法

1.1 試驗材料

組蛋白去乙酰化酶抑制劑中CUDC-101和MG149抑制劑（上海賽導通生物科技公司，871026-44-7）;MDV3100（北京樂博生物科技公司，915087-33-1）。中科院研究所提供PC-3、VCaP、22Rvl、LNCap等前列腺癌細胞株。抗人AR-V7特異性小鼠抗體（GR2195 17-16）及辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗小鼠抗體（1387300604）分別購自Abcam公司及上海碧云天生物科技公司，細胞活性檢測試劑盒（080719190830）購自北京智杰方遠科技有限公司。

1.2 方法

前列腺細胞的培育和給藥檢測，嚴格按照文獻[7]進行操作。采用免疫印跡法對AR-V7表達情況進行檢測：在完成前列腺癌細胞的培養之后，對細胞總蛋白進行提取，并對其濃度予以測定，進行蛋白電泳、轉膜處理。轉膜完成后，使用濃度為5%脫脂奶粉溶液將其封閉，1 h后加入抗人AR-V7特異性小鼠抗體。第2天清晨洗滌3次后加入HRP標記的羊抗小鼠抗體，1 h后洗滌4次加人ECL試劑，使用化學發光法獲取目標條帶，使用bandscan（version 5.0）凝膠圖像分析軟件測定灰度值，進而比較AR-V7表達的差異。

采用免疫印跡法對不同前列腺癌細胞株PC-3、VCaP、22Rvl、LNCapAR-V7陽性的表達進行監測：分別向不同的前列腺癌細胞株中加入濃度20 μmol的MDV3100，而后收集細胞進行檢測。進一步檢測蛋白去乙酰化酶抑制劑中CUDC-101和MG149抑制劑對前列腺癌細胞株陽性表達的影響：AR-V7陽性的細胞株中，分別加入CUDC-101和MG149抑制劑，2 d后收集不同的細胞株，使用免疫印跡法檢測AR-V7的表達。進一步比較CUDC-101聯合MDV3100對前列腺癌細胞株AR-V7陽性表達的影響：AR-V7陽性的細胞株中，分別加入30 nmol、300 nmol的CUDC-101以及30 μmol的MDV3100，2 d后收集不同的細胞株，使用免疫印跡法檢測AR-V7的表達。

1.3 統計學方法

采用SPSS 25.0統計軟件對所得數據進行統計分析，計數資料以例數或百分比表示，比較采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫印跡試驗結果分析

CRPC患者細胞株PC-3、VCaP和LNCap，均不存在AR-V7陽性表達情況（AR-V7陽性表達率為0.00%）。CRPC患者細胞株22Rvl，存在AR-V7陽性表達，AR-V7陽性表達率為75.60%。細胞株22Rvl處理后AR-V7陽性表達率高于其他細胞株，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖1。

2.2 CUDC-101和MG149處理細胞株22Rvl后AR-V7陽性表達率比較

蛋白去乙酰化酶抑制劑中CUDC-101和MG149分別處理CRPC細胞株22Rvl后，CUDC-101組AR-V7陽性表達率低于MG149組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表1。

2.3 不同抑制方法對前列腺癌細胞株的抑制作用比較

30 nmol劑量CUDC-101聯合MDV3100組及300 nmol劑量CUDC-101聯合MDV3100組對AR-V7陽性表達的抑制率均高于單獨使用MDV3100組，差異有統計學意義（χ2 = 4.250、5.765，P < 0.05）。30 nmol劑量CUDC-10聯合MDV3100組與300 nmol劑量CUDC-101聯合MDV3100組抑制率比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見表2。

3 討論

我國前列腺癌患者很大一部分在初診時已處于中晚期，手術效果不理想或已失去手術根治的機會，內分泌治療是主要治療方法，因此CRPC患者比例在增加[8]。在前列腺癌患者中，普遍存在前列腺特異性抗原升高的現象，并且以CRPC患者表現得尤為明顯，而又受到AR通路調節，升高幅度因此受影響[9]。臨床實踐調查顯示，采用內分泌治療后，幾乎所有患者在取得最初良好收益后，病情會逐步發展為CRPC[10]。而AR通路過度激活，被領域內研究學者認為是進展的主要原因[3，11]。MDV3100和阿比特龍，可以通過結合AR，阻斷受體與雄激素結合，從而降低AR的陽性表達，對抗腫瘤的生長[12]。該方法能夠在一定程度上延長患者的生存期，一般在5個月作用，但是在遠期產生耐藥性的可能性非常大，疾病的惡化同樣會出現[13]。

AR信號通路的作用，從前列腺癌的發病、發展到惡化，直至患者死亡，始終存在并出現。作用機制表現為：雄激素結合AR后，構象發生變化而被激活，可進一步激活一系列下游信號的轉導，促進腫瘤細胞的增殖和生長，進而影響疾病的變化發展[14]。AR通路傳導在支持前列腺細胞存活方面發揮積極作用，通過以下3種方式上調：增加雄激素生物合成、AR擴增及過表達、AR突變。AR-V7是AR突變的重要表現形式，也是AR信號通路的重要介質之一，AR-V7的持續激活被認為是AR通路過渡激活的主要因素之一[15]。相關研究顯示[16]，MDV3100和阿比特龍無法阻斷AR-V7的激活，而這也導致了AR-V7能夠在雄激素水平較低的情況下對任意前列腺癌細胞遺傳物質的控制，誘發細胞的生長增殖和擴散轉移，從而導致耐藥性的出現。本研究結果顯示，AR-V7陽性的細胞株22Rvl對MDV3100具有很強的耐藥性，進一步提示AR-V7在前列腺癌細胞對MDV3100耐藥性的產生過程中發揮積極作用。

現已證明在雄激素存在的條件下，AR-V7具有AR的活性;而在沒有雄激素配體的情況下，AR-V7在大量共調節因子的幫助下完成最終的激活并調控其下游基因的轉錄，增強AR的轉錄活性，與CRPC密切相關[17]。因此，有學者認為[18-19]，可以將AR-V7的表達水平的高低作為預測CRPC患者預后的重要指標，AR-V7過度表達則往往意味著CRPC復發率和死亡率的上升。若降低CRPC患者的AR-V7表達水平能夠改善患者抗雄治療效果，間接提示AR-V7可以其促進耐藥性的產生[20-21]。相關研究顯示[22]，前列腺癌中的AR-V7表達與表觀修飾可能存在一定的聯系。表觀遺傳抑制劑包括許多類型，本實驗CUDC-101便是其中一種。表觀遺傳抑制劑與內分泌治療藥物聯合應用在前列腺癌領域顯現出巨大的潛力[23-24]。本研究結果顯示，使用CUDC-101處理CRPC細胞株22Rvl后，AR-V7陽性表達率低于蛋白去乙酰化酶抑制劑中MG149（P < 0.05），提示CUDC-101對CRPC細胞株22Rvl中AR-V7陽性表達的抑制效果更好。在不同抑制方法方面，30、300 nmol的CUDC-101聯合MDV3100使用AR-V7陽性表達率低于MDV3100單獨使用（P < 0.05），這主要是因為聯合使用降低了CRPC耐藥性，對AR-V7陽性表達的抑制作用更明顯，同樣為CRPC新藥的研究探索新方向。但是本研究也存在一定的不足，不同藥物濃度對AR-V7陽性表達的抑制效果并無進一步分析，需要在今后研究中加以改進。

綜上所述，在CRPC患者中采用組蛋白去乙酰化酶抑制劑CUDC-101可以降低AR-V7表達水平，可作為治療CRPC潛在治療藥物。

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（收稿日期：2019-09-10? 本文編輯：王曉曄）