EtOH/K2HPO4雙水相體系萃取分離絞股藍中的總黃酮

張亦琳，張 琴，王 吾，鄢 強，王銀銀

(商洛學院 生物醫藥與食品工程學院，陜西 商洛 726000)

0 引言

絞股藍為葫蘆科植物的全草，主要分布在亞洲國家，具有清熱排毒的功效，對于治療病毒性肝炎、慢性支氣管炎、體虛乏力等癥在臨床上有確切的療效[1,2]，被"星火計劃"列為需開發的"名貴藥材"首位。2002年，絞股藍被列入保健產品清單，可以制成保健茶等功能性食品[3]。

絞股藍采用乙醇提取效果最好，得到粗提物，無法確定具體活性成分，但是藥效得到廣泛認可，藥理作用主要體現在皂苷、黃酮和多糖等成分中[4]。研究發現，絞股藍中含有大量皂苷，含量約為人參的3倍[5, 6]，總黃酮含量約為3%～5%[7]，主要有商陸素、蘆丁、槲皮素及蕓香苷等十余種[8]。近年興起的微波萃取技術[9]能有效分離絞股藍總黃酮和總皂苷，但是對設備要求較高，不利于工業化生產。因此開發條件溫和、成相穩定、用時較短的雙水相萃取技術對拓展絞股藍的應用領域和工業化生產有重要意義。

雙水相萃取技術的原理是被分離物在兩相中的溶解特性不同，實現兼具分離和純化雙重功能的技術[10,11]，而且親水性兩相體系可提供良好的生物環境[12]，實現藥用植物活性成分的分離純化。筆者采用EtOH/NaCl、EtOH/Na2CO3、EtOH/KBrO3、EtOH/K2HPO4和EtOH/(NH4)2SO45種雙水相體系，用于分離絞股藍中的總黃酮和總皂苷，運用相平衡原理分析不同雙水相體系中總黃酮的分配特征，確定最佳雙水相萃取體系，實現絞股藍總黃酮和總皂苷的有效分離，為絞股藍的提取分離開拓新的思路。

1 材料

UV1780型紫外-可見分光光度計(日本島津有限公司)

絞股藍購自北京同仁堂西安大藥房、人參皂苷Rb1標準品和蘆丁標準品購自南京道斯夫生物科技有限公司；KBrO3、(NH4)2SO4購自成都西亞試劑有限公司；NaCl、Na2CO3、K2HPO4購自西安順達化學試劑儀器公司。

2 方法

2.1 乙醇/無機鹽雙水相體系成相

在常溫常壓下，以EtOH為有機相，NaCl、KBrO3、Na2CO3、(NH4)2SO4、K2HPO4五種鹽作為試驗用無機鹽，通過濁點滴定法分別繪制EtOH與上述鹽在水中的相圖[13]。將無機鹽(ms)溶于水(mw)，滴加EtOH后振蕩混合至出現渾濁，記錄消耗EtOH質量(mei)和溶液總質量(mi)；然后繼續加入去離子水(mwj)至澄清，此時體系的總質量為mj；再滴加無水EtOH，振蕩混合至渾濁，如此反復操作，并繪制相圖。

EtOH質量濃度：ωei=∑mei/mi(i=1，2，3，…，n)鹽的質量濃度：ωs=∑ms/mj(j=1，2，3，…，n)

2.2 乙醇/無機鹽雙水相體系的選擇

向EtOH和無機鹽體系中加入提取液，混勻后離心，測定樣品各相的吸光度值，代入標準曲線求得絞股藍總黃酮的濃度，考察相比(R)、分配系數(K)和萃取率(Y)。相比計算公式R = Vt/Vb，其中，Vt、Vb分別是上、下相體積(mL)；分配系數(K)的計算公式為K=Ct/Cb，其中Ct、Cb分別是上下相提取液的質量濃度(g/L)；萃取率(收率)計算公式Y=RK/(1+RK)。

2.3 供試液的準備

在EtOH濃度80%，提取溫度60℃，料液比1∶10，提取時間為120 min條件下(通過響應面試驗設計法確定的提取參數)提取絞股藍(5 g)，得到提取液總黃酮的含量：0.3713 mg·mL-1，總皂苷的含量：2.6123 mg·mL-1。

2.4 分析方法

總黃酮分析波長的確定：在200～600 nm區間內，通過紫外分光光度計對蘆丁標準液和雙水相體系供試液的各相進行掃描，最大吸收峰為510 nm。

總皂苷分析波長的確定：在200～600 nm區間內，加入顯色劑香草醛-高氯酸-冰醋酸對人參皂苷標準液和雙水相的各相進行預處理后，紫外分光光度計進行掃描，最大吸收峰為550 nm。

3 結果

3.1 乙醇/無機鹽雙水相體系分相能力

常溫下，調整無機鹽的質量分數，通過濁點法繪制各體系相圖。實驗證明：NaCl無法與EtOH形成雙水相；(NH4)2SO4容易沉淀，形成的體系缺乏穩定性；而KBrO3、Na2CO3、K2HPO4則可與EtOH形成較為穩定的雙水相體系，結果如圖1所示。EtOH/Na2CO3、EtOH/K2HPO4、EtOH/KBrO33種雙水相體系中，Na2CO3的相分離范圍稍窄；KBrO3雖能穩定分相，但萃取分離能力較差；K2HPO4在EtOH中相分離范圍廣，萃取能力強。因此選擇EtOH/K2HPO4系統用于提取分離絞股藍總黃酮的雙水相體系。

3.2 EtOH/K2HPO4雙水相體系分離純化絞股藍總黃酮的最佳參數

3.2.1 乙醇和水的體積比對EtOH/K2HPO4雙水相體系的影響 當加入固定量的EtOH和水時，K2HPO4的加入量越多，下相體積越大，最后達到飽和；當加入固定量的EtOH和K2HPO4時，如加入水過多，則體系不能維持雙水相狀態，如加入水太少，K2HPO4不能完全溶解；當加入恒定量的K2HPO4和水時，EtOH加入量過多會導致K2HPO4沉淀，EtOH加入量過少會導致不能形成雙水相。結合圖1，最終對水與EtOH的體積比為5 ∶5、4 ∶6、3 ∶7做進一步研究。

3.2.2 磷酸鹽含量對EtOH/K2HPO4雙水相體系的影響 在水和EtOH體積比分別為5∶5、4∶6、3 ∶7的條件下，改變K2HPO4的添加量，并測定萃取后上下相的吸光度，結果如圖2所示。

從圖2可以看出，當EtOH或K2HPO4的含量增大時，上相絞股藍總黃酮的含量會減小。當K2HPO4的加入量恒定時，下相溶液的體積隨著EtOH濃度增高而減小，提高了K2HPO4的濃度，溶液堿性增大，總黃酮的溶解度增加；當EtOH加入量恒定時，隨著K2HPO4加入增多，上相EtOH濃度增加，總黃酮的濃度也增加。在形成過程中，EtOH和K2HPO4在雙水相體系中競爭水分子，K2HPO4與水更易結合，從而降低了上相溶液中總黃酮的含量。實驗表明，V水∶VEtOH=3 ∶7時，體系的分配系數和萃取率最高，且隨K2HPO4加入量增加，相比減小，分配系數增加，萃取率變化較小，因此，選用V水∶VEtOH=3 ∶7，K2HPO4的加入量為2.0 g為雙水相萃取體系的最佳體系。該體系EtOH的質量分數為52.49%，K2HPO4的質量分數為19.01%，此時相比R為2.84，分配系數K為19.87，總黃酮的萃取率Y為98.26% 。

3.2.3 EtOH/K2HPO4雙水相體系萃取絞股藍總黃酮的應用 將制備好的絞股藍供試液加入到最佳雙水相體系中，混合均勻，上下相分配完全后，離心分相，測定供試液的吸光度，結果如圖3所示。萃取前，絞股藍供試液中總黃酮含量為2.1992 g·mL-1，體積為5.4 mL；萃取后上相濃度為6.1294 g·mL-1，體積為6.7 mL；下相濃度為0.5609 g·mL-1，體積為1.3 mL。由此可知，絞股藍總黃酮主要富集在EtOH/K2HPO4雙水相體系的上相中，純度較高。

絞股藍提取液不僅含有豐富的黃酮類化合物，還有較多的皂苷，因此我們進一步測定了在最佳EtOH/K2HPO4雙水相體系下絞股藍皂苷在上下相中的分配情況，結果如圖4所示。實驗表明，用雙水相體系萃取后，絞股藍皂苷主要富集在下相，而黃酮主要富集在上相，從而在一定程度上實現了純化絞股藍黃酮的目的。

3 結論

絞股藍因其藤蔓較多，提取前需要完全粉碎，以增加有效成分的溶解。黃酮是絞股藍中含量較多的物質之一，大部分能溶于乙醇，因此雙水相試驗中使用EtOH作為溶劑，而且EtOH具有較大的水化能，很少有無機鹽能與其形成雙水相，且相比R難趨近于1[14]。K2HPO4在EtOH/H2O溶液中，有相當寬的相分離區間和較高的K，同時，K2HPO4是弱堿鹽，能夠使體系得pH保持在弱堿性環境中，確保了黃酮在體系中的完全溶解，并且也不會因堿性過高而使黃酮失活。本研究最后確定的最佳EtOH/K2HPO4體系為：EtOH的體積分數為52.49%，K2HPO4的質量分數為19.01%，此時K為19.87，R為2.84，總黃酮的萃取率為98.26%。絞股藍總黃酮在EtOH上相富集，而易溶于水的皂苷等水溶性成分主要富集在下相，此萃取技術實現了黃酮與皂苷化合物的提取分離，在絞股藍活性物質的分離方面有較大應用前景。