提高黑米酒中花色苷含量的釀造方法研究

楊舒婷,楊 燁

(1.陜西中醫藥大學，公共衛生學院，陜西 咸陽 712100 ; 2.陜西朱鹮黑米酒業有限公司，陜西 洋縣 723300)

1 引言

黑米是一種藥食兩用的大米，素有“黑珍珠”和“世界米中之王”的美譽，其釀造的黑米酒酒體為紫紅色，晶瑩剔透；口感清新淡雅，果香與米香相融合，是飲品中的佳品[1]，酒中含有16種氨基酸[2]、多種維生素及錳、鋅、銅等無機鹽，含有大米所缺乏的維生素C、葉綠素、花青素、胡蘿卜素及強心甙等特殊成分，尤其是含有抗氧化、消除自由基的花色苷等多酚類物質。

已有研究表明[3]黑米中最具有營養價值的就是“花色苷”，它是花色素與糖以糖苷鍵結合成的一類化合物，并且花色苷化合物與 2-苯色原酮的黃酮基本骨架結構相似，因此花色苷類化合物也被統稱為黃酮類化合物[4]。花色苷經常被應用于清除體內自由基[5]、增殖葉黃素、抗腫瘤、抗癌[6]、抗炎[7]、抑制脂質過氧化和血小板凝集[8]、預防糖尿病[9]、減肥、保護視力等，并且是一種天然、安全、無毒的色素，已被應用于多種行業中。

傳統黑米酒釀造工藝流程[10]：精米→洗米→浸米→蒸飯→冷卻→拌曲→加酵母→糖化→發酵→壓榨→澄清→過濾→殺菌→灌裝→成品。張名位[11]等研究表明，黑米剝4 mm，所得米皮累計重量不到總量的15%，而花色苷占到總量的98%以上，在此過程中，精米這一加工步驟使集中在黑米表皮的花色苷被白白浪費；洗米、浸米[12]、高溫蒸米和酶制劑的添加[13]等工藝，都會造成黑米花色苷的大量流失，大大降低了黑米酒的花色苷的含量。

在高如嵩[14]的研究中表明，陜西洋縣的黑米雖然脂肪含量相差不大，但脂肪酸的組成與普通黑米差別還是很大的，尤其是不飽和脂肪酸。因此，本文以洋縣黑米為原料，在繼承黑米黃酒傳統生產工藝[12]的基礎上，通過提取和還原法、黑米整米提取法來生產黑米酒，解決了我國傳統黑米酒生產工藝中存在的黑米花色苷含量低的技術難題。

2 黑米酒釀造工藝優化研究

為了提高黑米酒中的花色苷含量，本部分設計了提取與還原法、黑米整米提取法等關鍵工藝，以洋縣黑米(洋黑3#)為試驗材料，以黑米花色苷含量為影響因素的響應值，在單因素實驗的基礎上，利用響應面分析法，來確定影響花色苷提取率的關鍵因素及其最佳組水平合，并進一步優化規模化生產中黑米花色苷的提取工藝。

2.1 提取與還原法

2.1.1 實驗材料 ①黑米原料(品種為洋黑3#)，黑米潤糧、黑米蒸糧、黑米糖化醪、黑米發酵醪，由陜西朱鹮黑米酒業有限公司提供；②矢車菊素-3-葡萄糖苷與芍藥花素-3-葡萄糖苷標準品，購自挪威 polyphenol AS 公司。

2.1.2 實驗設備 ①LC-15C 高效液相色譜儀，日本島津公司；②UV 2550型紫外-可見分光光度計，日本島津公司；③數顯恒溫水浴鍋，HH-2，江蘇省金壇市富華儀器有限公司。

2.1.3 實驗方法與結果 采用高效液相色譜法(HPLC)聯合紫外-可見分光光度計(UV-2550)對黑米酒釀造過程中各個階段的花色苷含量進行檢測。從表1和圖1可以發現花色苷在原料中含量最高，隨著釀造流程的進行，花色苷含量越來越少，特別在糖化和發酵期中下降最為突出，并且從大量花色苷研究中可得到較為相同的結論。

表1 黑米在釀造過程中花色苷含量變化 (mg·kg-1)

注：黑米花色苷組成成分有矢車菊素、芍藥素、多燕草素等[15][16]

因此，為了更大程度保留黑米中花色苷的含量，課題組決定采用直接從原料中提取花色苷并重新還原至酒液的方法，即“提取與還原”法優化加工工藝。 “提取”是利用黑米花色苷的水溶性，將黑米原料在一定條件下浸入乙醇溶劑之中從而將溶液中花色苷進行分離提純。“還原”是將提純提煉的花色苷重新加入到米酒溶液中，從而還原出黑米原有的色澤、活性物質和營養物質。該方法直接從黑米原料中提取花色苷，最大程度地提取了黑米花色苷，再將其還原至釀造好的米酒原液中，最大程度地保留了黑米花色苷，可以極大地提高黑米酒中花色苷含量。

2.2 黑米整米提取法

2.2.1 實驗材料 ①黑米、黑米皮、脫皮米粒，品種為洋黑3#，由陜西朱鹮黑米酒業有限公司提供；②矢車菊素-3-葡萄糖苷與芍藥花素-3-葡萄糖苷標準品，購自挪威 polyphenol AS 公司；③乙醇，分析純，西安化學試劑廠；鹽酸，分析純，西安化學試劑廠。

2.2.2 實驗設備 ①LC-15C 高效液相色譜儀，日本島津公司；②UV 2550型紫外-可見分光光度計，日本島津公司；③數顯恒溫水浴鍋，HH-2，江蘇省金壇市富華儀器有限公司；④低速臺式離心機，TDZ4-WS，長沙湘儀離心機儀器有限公司等。

2.2.3 實驗方法與結果 ①樣品制備。分別將黑米、黑米皮、脫皮米粒篩除干凈，放入高速粉碎機中進行粉碎，過 40 目篩得到待測樣品粉末，并加貼標簽，常溫下放置待用。②花色苷的提取。稱取 2.0 g 樣品于 250 mL 錐形瓶中，分別加入無水乙醇及 1%的鹽酸溶液混合液(體積比均為 1∶10)。用保鮮膜封口后固定于超聲波振蕩器中提取(溫度為室溫 20℃，頻率為 100Hz)30min。冷卻至室溫，再進行離心分離 10 min(轉速3 000 r·min-1)，取上清液。殘渣繼續用上述提取液提取，反復 2 次，合并上清液等到花色苷提取液。用 0.45 μm 濾膜過濾，待測。③花色苷含量分析。將黑米整米、黑米皮和黑米浸米水這三種方法進行了對比。通過表2、圖2的數據，我們可以得出三種介質中提取的花色苷含量是黑米皮>黑米整米>黑米浸米水。

表2 黑米不同部位花色苷的含量 (mg·kg-1)

2.2.4 分析與討論 通過實驗發現，顯然，黑米皮中提取的花色苷含量最高，其次是黑米整米中提取的花色苷。然而在實際生產中，黑米皮在剝離過程中會有一部分淀粉、脂肪存在，這些雜質不易去除，易變質，影響黑米多酚的提取純度、穩定性及后期酒品的穩定性。為了解決這一問題，我們采用了離心過濾、布袋過濾、微孔膜過濾去除雜質，但效果都不太理想。因此，本文調整了方案，選擇黑米整米的方法進行提取花色苷。黑米整米提取雖然沒有黑米皮提取率高，但由于有黑米皮的包裹，提取液中就沒有淀粉殘留，提取的純度大大的提高，不再產生沉淀，過濾也變得更加簡單，花色苷及后期酒液穩定性較好。再將提取花色苷后的黑米原料采用研磨技法粉碎成米糊，破壞黑米皮層、釋放內部淀粉，直接進入下一步糖化發酵程序。

在實際的生產試制過程中，我們發現“黑米整米提取法”完美的將花色苷的提取與后期黑米酒發酵結合在一起。“黑米整米提取法”在提取花色苷的同時，又能凈化除雜，使花色苷提取率大大提高。同時，該工藝摒棄了“精米”工序，解決了黑米皮層包裹難題，做到了全米利用，極大地提高原料利用率。

2.3 黑米花色苷提取條件的優化

2.3.1 實驗材料 ①黑米，品種為洋黑3#，由陜西省水稻研究所提供；②矢車菊素-3-葡萄糖苷與芍藥花素-3-葡萄糖苷標準品，購自挪威 polyphenol AS 公司；③乙醇，分析純，西安化學試劑廠；鹽酸，分析純，西安化學試劑廠。

2.3.2 實驗設備 ①UV 2550型紫外-可見分光光度計，日本島津公司；②數顯恒溫水浴鍋，HH-2，江蘇省金壇市富華儀器有限公司；③低速臺式離心機，TDZ4-WS，長沙湘儀離心機儀器有限公司等。

2.3.3 實驗方法與結果 主要有:

(1)單因素實驗。以黑米為實驗材料，以不同濃度梯度酸性乙醇為提取溶劑，以黑米提取液花色苷含量為評價指標，分別考察不同的提取溫度、時間、乙醇濃度、鹽酸濃度、液料比和提取次數，對花色苷取液含量的影響。以花色苷量高低為判斷標準，確定影響花色苷提取各因素中具有顯著影響的因子，為下一步響應面實驗設計做準備。從影響黑米花色苷提取效果的 6個單因素實驗可以發現，顯著影響黑米中花色苷提取效果的是PH值、乙醇濃度和提取溫度這3個因素。單因素實驗結果如圖3-5。

(2)響應面實驗[17～18]。根據單因素實驗的結果，選擇顯著影響花色苷提取效果的pH值、乙醇濃度、提取溫度這3個因素與黑米花色苷得率進行響應面實驗。準確稱取經預處理的黑米10.000 g，放入200 mL燒杯中，每組3個重復，在其他條件相同的情況下，采用不同的乙醇濃度、PH值、提取溫度進行提取，每次提取50 min，以黑米花色苷得率為響應值，采用響應面實驗法逐個考察各提取條件對提取效果的影響。

①響應面實驗的水平設計。 采用Design Expert 8.0.6軟件中的Box-Benhnken模型，以黑米花色苷得率Y為響應值，在提取時間50min條件下，選取乙醇濃度(A)、PH值(B)及提取溫度(C)進行三因素三水平響應面分析實驗，實驗方案見表3。

②響應面實驗的結果。

③響應面數學模型的建立及檢驗。

利用Design Expert8.0.6程序，對表4數據進行回歸擬合，以黑米花色苷的提取得率(Y)為響應值，乙醇濃度(A)、pH值(B)和提取溫度(C)為自變量，得回歸方程如下，并經可信度分析表明該方程可靠性較高。

Y=-87.14664+1.91197A+5.48756B+0.45899C+8.55000E-004AB-4.15000E-004AC-9.43333E-003BC-0.013222A2-0.72245B2-2.68244E-003C2。

利用Design Expert8.0.6程序做方差分析，結果見表5。表5表明，模型的P<0.0001，說明模型顯著；A(乙醇濃度)、B(PH值)、C(提取溫度)及所有二次項對Y值的影響高度顯著，矢擬項(Lack of Fit)的P=0.887>0.05，表明方程對實驗擬合度較好。

表5 回歸方程方差分析結果

注：**表示相關系數在0.01的顯著性水平下顯著

④響應面圖形分析。

圖6-圖8是根據回歸方程繪制的Y = f(A，B，C)響應面和等高線分析圖。響應面分析圖是指在其他因素水平固定的條件下，響應值與試驗中的兩個因素所構成的三維曲面圖。響應面可以直接反映出各因子對響應值的影響大小；等高線圖可以直接看出最優條件下各因子的取值。

從圖6、圖7可以看出，在pH值、溫度固定條件下，花色苷得率隨乙醇濃度的升高而增加但并非持續增大，當乙醇濃度達到68%時出現拐點，花色苷得率開始下降。同樣，圖7、圖8 說明在pH值、乙醇濃度固定條件下，溫度顯著影響花色苷得率，拐點出現在810 C。圖6、圖8說明在乙醇濃度和溫度固定的條件下， pH值也顯著影響黑米中花色苷得率，拐點出現在pH值為3.5時。

⑤實驗結論。

由Design Expert8.0.6程序分析得到的花色苷提取的最佳工藝條件為：乙醇濃度66.94%，pH3.5，提取溫度81℃。此時，黑米中花色苷的理論得率達到了6.857%，為實驗期間的最大值。

2.4 規模化生產中黑米花色苷提取工藝的優化

實驗室響應面法試驗，給出了黑米花色苷提取的最佳工藝條件。但是在企業規模化實際生產中，原料本身的特質、原料與溶劑的料液比、料液比、萃取溫度、萃取時間、萃取次數、酒精濃度、攪拌和溶液流動、pH值等都會影響到提取率與提取質量。

為了考慮到實際生產的便利性，項目組經過多次試驗，最終以乙醇濃度65%，pH3.2為最佳；考慮到溫度提高會導致雜質的溶出量及能耗的增加，最終提取溫度以78℃最佳；提取到的花色苷實際平均得率為6.558%，與理論值相差0.299%。最優工藝方案如下：

(1)獲取食用酒精：收集黑米酒發酵副產物酒糟、貯酒過程中倒罐分離的酒腳和經蒸餾后回收得到的蒸餾酒，獲得食用酒精(調制至濃度65度)，做萃取溶劑。

(2)提取：按照黑米和食用酒精(濃度65度)1∶2～1∶3的比例浸漬清洗后的黑米，并加熱物料至600C -800C，恒溫提取黑米多酚，收集黑米多酚提取液；

(3)過濾：用膜過濾技術過濾，并對過濾后的黑米多酚提取液真空濃縮，回收蒸餾酒，得到黑米多酚濃縮液；

(4)冷凍：濃縮液經48 h的冷凍除雜，感官呈現紫紅色液體；

(5)還原：取色后的黑米釀成成品酒，將黑米多酚濃縮液均勻加入并封罐存貯。

3 新老工藝下黑米酒花色苷含量測試

花色苷有兩個最大吸收波長范圍，一個在可見光區，最大吸收波長為 500～550 nm，另一個在紫外光區，最大吸收波長為 270～280 nm。根據花色苷在不同 PH 值條件下有最大吸收波長的特點，當pH1.0時，520 nm處有最大吸收峰；而當pH值為4.5時，花色苷轉變為無色查爾酮形式，在520 nm處無吸收，采用pH 試差法測示計算黑米酒中花色苷含量[19]，測試結果如表8所示。

表6 pH試差法測定黑米多酚吸光度值

注：A=(A520-A700)PH1.0-(A520-A700)PH4.5

據表6數據計算得出原有工藝釀造的黑米酒花色苷含量 1.50 mg·L-1；新工藝下花色苷含量5.7 mg·L-1。新工藝下花色苷百分比含量是有工藝花色苷含量的3.8倍。對比分析可知，新工藝增加了黑米酒中花色苷的含量。

4 結果與討論

在傳統的黑米酒釀造工藝的基礎上，本項目提出了“提取和還原法”和“黑米整米提取法”以提高黑米酒中花色苷含量。

首先，為了有效解決了原工藝中黑米酒天然色素損失、花色苷等活性物質流失嚴重的技術難點，本項目采用運用提取和還原法、對黑米花色苷提純并還原至酒液中，更好地保留了黑米中的營養物質和活性物質。其次，擯棄了原有工藝中的“精米”工序，運用了“黑米整米提取技術”，有效地完成了黑米花色苷的提取，最大程度地保留了黑米中特有的花色苷等多酚類活性物質。最后，摒棄了為控制酒體氧化而添加抗氧化劑、為改善色香味而添加人工色素的傳統工藝。酒的顏色來自黑米本身的天然花色苷色素，不僅優化了品質，還做到了有機環保，綠色健康。