參七蟲草膠囊干預肺間質纖維化大鼠模型PI3K/Akt信號通路實驗研究

董 梅，張念志，陳 煒，紀 娟，倪 興

(1.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院呼吸內科，安徽 合肥 230031；2.安徽中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院呼吸內科，安徽 合肥 230061)

參七蟲草膠囊是安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院呼吸內科在總結多年臨床實踐經(jīng)驗基礎上研制的院內制劑，治療肺部疾病(如肺纖維化、慢性阻塞性肺疾病)具有顯著臨床療效[1]。為進一步探討參七蟲草膠囊治療肺間質纖維化的作用靶點，筆者觀察了其對肺間質纖維化模型大鼠外周血及肺組織中磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine protein kinase B，Akt)含量的影響，為臨床應用參七蟲草膠囊治療肺間質纖維化提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物 參七蟲草膠囊由安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑室提供，藥物組成為西洋參、三七和冬蟲夏草。

1.2 實驗動物和分組 40只清潔級SD大鼠，由江蘇省常州卡文思實驗動物有限公司[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2016-0010]提供，體質量為(200±25)g，適應性飼養(yǎng)1周。動物飼養(yǎng)室為清潔級，室溫控制在(24±2)℃。

1.3 實驗藥物和試劑 潑尼松(產(chǎn)品批號：1701021)：西安利君制藥有限責任公司；參七蟲草膠囊(產(chǎn)品批號：20170016)：安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑中心；博萊霉素注射液(產(chǎn)品批號：322C022)：北京索萊寶；大鼠Akt試劑盒(產(chǎn)品批號：Q23013186)、PI3K試劑盒(產(chǎn)品批號：Q25013187)：武漢華美生物工程有限公司。

1.4 主要儀器 TGL-16C臺式離心機：安徽嘉文；AJC-0501-P純水儀：上海力康；TL-420D水浴鍋：常州奧華；DNP-9056BS-Ⅲ電熱恒溫箱：上海三發(fā)；EPOCH酶標儀：深圳雷杜；WH-4微型旋渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造公司。

2 方法

2.1 模型復制和給藥方法 大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，將其隨機分為4組：空白對照組、模型組、參七蟲草膠囊組、氫化潑尼松組，每組10只。采用博萊霉素氣道噴霧復制肺纖維化大鼠模型[2]，應用10%水合氯醛，按照3.5 mL/kg劑量腹腔注射麻醉大鼠后，將光源直接照射于大鼠咽喉部黏膜，一手戴手套提起舌頭向外向上，暴露會厭，在舌根和會厭交界區(qū)，顯露出聲門，將霧化器的噴霧頭經(jīng)聲門裂輕輕插入氣管內，予博萊霉素5 mg/kg霧化給藥復制模型。4組均于模型復制成功后第2天灌胃，空白對照組和模型組每日給予生理鹽水10 mL/kg灌胃，羥化潑尼松組每日給予羥化潑尼松6 mg/kg灌胃，參七蟲草膠囊組每日給予參七蟲草膠囊0.35 g/kg灌胃，療程均為28 d。

2.2 指標觀察方法

2.2.1 肺組織觀察 按照3.5 mL/kg劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠后，分離腹主動脈，即刻取血3.0 mL，離心(3 000～4 000 r/min)15 min，及時取上清，置4 ℃冰箱保存待檢，取左肺上葉肺組織，分為兩部分，其中一部分采用4%甲醛固定1 d后，石蠟包埋，按照4 μm厚度連續(xù)組織切片，行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色，光鏡下觀察肺組織病理圖片。另一部分肺組織，用9倍勻漿介質研磨，然后將研磨液3 000～4 000 r/min，離心10 min，取上清制備成10%的組織勻漿，置于4 ℃冰箱保存待檢。

2.2.2 Akt和PI3K水平檢測 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測治療前后大鼠肺組織中Akt和PI3K的水平。將大鼠抗Akt、PI3K單克隆抗體包被于酶標板上，標品和樣品中Akt、PI3K與單抗體結合，鏈霉素-辣根過氧化物酶受體與加入生物素的抗大鼠Akt、PI3K抗體結合，形成粘附在酶標板上的免疫復合物，未結合的酶通過溫浴和洗滌方法除去，將底物A、B加入標本中，顯示藍色，終止液酸被加入后，藍色轉變?yōu)辄S色，樣品中Akt、PI3K的濃度與黃色的深淺呈正相關，肺組織中大鼠Akt、PI3K水平通過繪制標準曲線計算。

3 結果

3.1 各組大鼠血清及肺組織中Akt、PI3K水平比較 與空白對照組比較，模型組大鼠血清和肺組織中Akt及PI3K水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，參七蟲草膠囊組和氫化潑尼松組血清及肺組織中Akt及PI3K水平顯著降低(P<0.05)；參七蟲草膠囊組大鼠血清和肺組織中Akt、PI3K水平顯著低于氫化潑尼松組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清及肺組織Akt、PI3K水平比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與氫化潑尼松組比較，△P<0.05

3.2 4組大鼠肺泡上皮細胞及間質的組織形態(tài)學變化比較 光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，空白對照組大鼠肺泡壁上皮細胞形態(tài)及數(shù)量正常，肺泡間隔形態(tài)正常，纖細均勻；模型組大鼠肺泡壁上皮細胞形態(tài)雜亂不規(guī)則，數(shù)量減少，肺泡間隔增厚，間距增大，間質增生；氫化潑尼松組及參七蟲草膠囊組大鼠肺泡壁上皮細胞形態(tài)雜亂，數(shù)量較模型組有所增多，肺泡間隔較模型組減小，間質減少。見圖1。

注：A.空白對照組；B.模型組；C.氫化潑尼松組；D.參七蟲草膠囊組

圖1 4組大鼠肺泡上皮細胞及間質的組織形態(tài)學變化比較(HE染色，10×20倍)

4 討論

特發(fā)性肺間質纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)近年來發(fā)病率日漸增高,發(fā)病人群以中老年人常見[3]，主要累及肺間質、肺泡和(或)細支氣管等部位，是一種病因不明的慢性炎癥性間質性肺疾病，由于臨床療效不佳，相關研究逐漸增多。

在肺間質纖維化病理過程中，肺成纖維細胞(lung fibroblast，LF)和肺肌成纖維細胞抗凋亡能力增強，這兩類細胞的持續(xù)存在導致肺間質纖維化發(fā)展[4]。結締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)、轉移生長因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、胰島素樣生長因子-1等諸多細胞因子可通過激活PI3K/Akt信號途徑使LF具有抗凋亡的能力[5]，研究證明，當受到細胞凋亡的刺激，細胞內活化的PI3K及Akt信號能保護細胞免于凋亡。

廣譜抑制劑LY294002可抑制PI3K/Akt等多種信號通路，可完全阻斷TGF-β誘導體外培養(yǎng)的人LF纖維化的發(fā)生[6]。PI3K/Akt信號激活后，導致TGF-β1下游Smad3蛋白的轉錄活性進一步增強，繼而成纖維細胞表達Ⅰ型膠原蛋白過程持續(xù)活化。LF表面的血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)受體由TGF-β1介導的Smad、P38MAPK、JNK、PI3K/Akt等通路信號所活化，AngⅡ與其受體結合后促進LF分泌細胞外基質。由此可見，PI3K/Akt信號與TGF-β1因子協(xié)同作用而參與肺纖維化病程，提示PI3K/Akt信號在IPF的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

肺纖維化在病機方面多表現(xiàn)為本虛標實：標實表現(xiàn)為肺纖維化有瘀血阻絡；本虛表現(xiàn)在早期為上焦肺虛，病程遷延日久則累及下焦腎臟，耗傷氣陰，后期則肺腎氣陰兩虛[7]。參七蟲草膠囊是安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院院內制劑，由西洋參、三七、冬蟲夏草三味名貴中草藥組成。西洋參具有補肺益氣養(yǎng)陰功效，作為君藥；臣藥冬蟲夏草具補益肺腎之精作用；三七活血散瘀，為佐藥。三藥合用，具有益肺補腎、養(yǎng)陰益氣、活血散瘀之功效，祛邪而不損傷正氣，補虛而不留邪毒。全方配伍嚴謹，標本同治，臨床療效顯著。

課題組前期研究結果表明，在博萊霉素誘導肺纖維化大鼠模型實驗中，參七蟲草膠囊抑制肺纖維化早期肺泡的炎癥反應與其降低肺組織基質金屬蛋白酶9及基質金屬蛋白酶抑制劑-1表達密切相關[8]。與氫化潑尼松比較，參七蟲草膠囊能顯著抑制肺纖維化患者骨橋蛋白表達[9]。降低白細胞介素4(interleukin-4,IL-4)，升高γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)，糾正IFN-γ/IL-4失衡[10]。參七蟲草膠囊降低肺纖維化大鼠肺組織上皮細胞鈣黏素(E-cadherin，E-cad)，升高α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)以及波形蛋白，從而抑制肺泡上皮細胞轉化[11]。筆者在既往研究的基礎上，研究參七蟲草膠囊對肺纖維化模型大鼠外周血及肺組織中PI3K/Akt信號通路的影響，為參七蟲草膠囊臨床防治肺纖維化提供實驗依據(jù)。

本實驗結果顯示，肺纖維化模型組大鼠血清及肺組織PI3K、Akt水平均明顯升高，而參七蟲草膠囊可顯著改善血清及肺組織PI3K、Akt水平，表明其延緩肺間質纖維化的機制可能是通過抑制PI3K/Akt信號通路的激活，減輕肺纖維化炎癥反應而實現(xiàn)的。