TLR-8 激動劑刺激的DC 對CD4+CD25+調節性T 細胞的體外增殖及殺傷功能的研究

楊阿麗，劉欣，王興兵，汪安友，汪健

（安徽醫科大學附屬省立醫院 血液內科，安徽 合肥）

0 引言

急性髓細胞白血病（AML）是一種常見的惡性血液病，目前主要治療方法是化療和造血干細胞移植。CD34+白血病細胞具有無限增殖、自我更新及多向分化的潛能，在體內選擇性過度生長，并且干擾正常造血干細胞的分化，能逃逸大多數化療藥物的殺傷，處于相對靜息狀態的CD34+白血病細胞在體內可以長期潛伏，化療不能完全消滅它[1]。目前有研究者認為CD34+白血病細胞是白血病起源、治療后復發及耐藥的主要根源[2]。Toll樣受體（TLRs）作為模式識別受體中的一員，可以識別病原微生物的保守結構分子模式，通過胞內信號傳導通路產生細胞因子和趨化因子，促進抗原提呈細胞（APCs）的成熟以及誘導適應性免疫應答[3],CD4+CD25+調節性T細胞（Tregs）參與機體免疫抑制功能，CD34+白血病細胞通過招募 Tregs并利用其功能來逃避機體的免疫監視，在白血病發生過程中參與激活白血病特異性[4]，故推測通過干預Tregs細胞的增殖和免疫抑制功能將可作為CD34+白血病細胞清除的一個靶點。

本研究通過TLR-8激動劑在體外條件下干預前后，觀察負載CD34+白血病細胞的DC對CD4+CD25+調節性T細胞的體外增殖及殺傷功能的影響。

1 材料與方法

1.1 標本來源 初發的急性白血病患者經過骨髓細胞學、流式細胞術免疫分型、染色體核型分析、融合基因（MICM）檢查確診，采用WHO診斷分型。入組8例AML（M3除外）患者，男性5例，女性3例，年齡23-55歲，中位年齡42歲，M1 1例，M2 1例，M4 2例，M5 4例。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑

人淋巴細胞分離液：Solarbio公司；RPMI1640 培養基 ：美國Hyclone 生物科技有限公司。胎牛血清：杭州四季青公司；DMSO：美國Amresco公司；RPMI-1640培養基、0.25%胰蛋白酶溶液：美國Hyclone生物科技有限公司；磁珠（CD34抗體和FcR阻斷劑，CD14抗體，CD8抗體、CD4抗體、抗生物素微球和CD25微球）：德國美天旎生物技術有限公司；去甲氧柔紅霉素：輝瑞制藥有限公司；硼替佐米：西安楊森制藥有限公司；IL-4、GM-CSF、TNF-α：美國PeproTech公司；VTX-2337：美國ImmunoWay公司；雙抗：青霉素、鏈霉素：賽業生物科技有限公司；冰醋酸、95%乙醇、75%乙醇、生理鹽水、PBS晶體：上海生工生物公司；CD14-PE、CD25-FITC、7AAD、CD4-PE、CD3-APC、CD8-FITC、CFSE：美國 BD公司；DC培養液：50mL RPMI1640 培養基加入5mL胎牛血清，加入青霉素、鏈霉素（雙抗濃度均為100U/mL），密封并置于4℃冰箱中保存；細胞凍存液：將DMSO與RPMI1640 培養基、血清按照1：7：3比例混合配置，配置為總體積為50mL的凍存液，封閉并并置于4℃冰箱中保存；PBS-E溶液：將PBS晶體溶于800mL蒸餾水中，調整pH為7.4左右，加蒸餾水定容至1000mL配成PBS溶液，每100mL溶液中加入1mLEDTA溶液，在高壓蒸汽滅菌器中滅菌至少30分鐘，室溫保存；PBS-EB溶液：取45mLPBS-E溶液加入200ul胎牛血清，冰水浴放置，磁珠分選時臨時配置用。

1.2.2 主要儀器

LS分選柱、MS分選柱、Mini MACS磁珠分選架：德國美天旎生物技術有限公司；流式細胞儀（FACSCanton Ⅱ型）：美國BD有限公司；倒置相差顯微鏡、顯微照相系統：日本Olympus公司；圖像分析系統：VideoTest Fish 2.0；低溫超速離心機、超凈工作臺：江蘇蘇凈集團安泰公司；CO2孵育箱:RSBiotech 公司。

2 方法

2.1 分選CD34+白血病細胞

2.1.1 細胞來源：簽署知情同意書后，采集2017-2019年安徽醫科大學附屬省立醫院安徽省立醫院血液科初治AML（M3除外）患者的肝素抗凝的骨髓5mL。

2.1.2 提取單個核細胞并計數：將收集的骨髓用人淋巴細胞分離液采用密度梯度離心法提取單個核細胞并洗滌2次。棄上清，用手彈散底層細胞，加入RPMI1640至總體積5mL，混勻管內細胞液。取10μL至EP管中，加190μL冰醋酸稀釋至20倍，充分分散細胞，吸取少許細胞懸液在光學顯微鏡下計數，重復計數3次，取平均值。細胞數/mL=（四大格細胞總數/4）×104×稀釋倍數×細胞懸液總體（mL）。

2.1.3 磁珠分選CD34+白血病細胞：將2.1.2得到的單個核細胞離心、重懸后，在避光條件下加抗體阻斷劑FcR及CD34+抗體磁珠，進行磁珠陰性分選，獲得即為CD34+白血病細胞。

2.1.4 CD34+白血病細胞的凍存與復蘇：將分選的CD34+白血病細胞凍存并保存于液氮罐中，待該患者達到完全緩解期時復蘇備用。

2.2 樹突狀細胞的培養

2.2.1 細胞來源：簽署同意書后，多次累計采集完全緩解期患者的外周血20mL，提取單個核細胞（PBMC）并計數，用CD14+抗體磁珠陰性分選獲得CD14+單個核細胞，用作DC（步驟同2.1.2-2.1.3）。

2.2.2 培養成熟DC：用含10% FBS、1U/mL青霉素、1μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養液將分選的單核細胞的濃度調整為2×106/2mL，置于6孔培養板中， 加入GM-CSF 1000 U/mL、IL-4 500 U/ mL（每孔液體量調為2mL），均勻吹打細胞，置于5%CO2，37℃培養箱中培養，每48小時觀察細胞形態，半量換液及添加細胞因子，第5天再次半量換液，加入TNF-α 50 U/mL，繼續5%CO2，37℃培養箱中培養48小時，收集細胞，獲得成熟DC。

2.2.3 成熟DC的凍存與復蘇：將2.2.2獲取的細胞液移至離心管中，向每孔加入37℃預熱的0.25%胰酶，將培養板置于培養箱中消化5分鐘，待細胞充分消化后，向每孔加入2mL RPMI 1640培養液以停止細胞消化，收集成熟DC于無菌離心管中，凍存與復蘇同2.1.4。

2.3 制備負載CD34+白血病細胞的DC

復蘇凍存的CD34+的白血病細胞于6孔板中，加入RPMI 1640培養液，置于5%CO2，37℃培養箱中培養24小時，加入去甲氧柔紅霉素（15ng/mL）聯合硼替佐米（0.25μM），培養箱中繼續培養18小時，收集細胞。冰上孵育30分鐘后，洗滌2次，與DC按1：2混合培養2小時，收集細胞。

2.4 CTL 的生成

多次累計取完全緩解期患者外周血10mL，分離外周血單個核細胞（PBMC），將負載CD34+白血病細胞的DC與分離的PBMC按1：2共培養，第7天和第14天加入DC反復刺激。同時，從第3天起，每隔2-3天加入IL-2（20IU/mL）。第21天，采用磁珠陽性分選獲得CD8+CTL。

2.5 CD4+CD25+T 細胞分選

多次累計取完全緩解期患者外周血10mL，分離外周血單個核細胞（PBMC），磁珠分選出CD4+T細胞，再通過抗CD25的磁珠分選獲得將CD4+CD25+T細胞。

2.6 誘導調節性T 細胞增殖作用的檢測

在6孔板中加入負載藥物誘導凋亡CD34+白血病細胞的DC和 CFSE（2.5μmol/L）標記 CD4+CD25+T細胞（2×105個 / 2mL）按照10：1共培養，分為兩組：1）對照組：僅加入含有10% FBS的RPMI 1640培養液；2）TLR-8激動劑組：加入含有10% FBS的RPMI 1640培養液及 TLR-8激動劑（VTX-2337，3μg/mL），分別于5%CO2，37℃培養箱中培養，7天后，利用流式細胞術檢測CD4+CD25+T調節性T細胞的增殖情況。

2.7 TLR-8 激動劑干預下CD4+CD25+調節性T 細胞對CTL 殺傷CD34+白血病細胞作用的影響檢測

2.7.1 TLR-8激動劑（VTX-2337）預處理CD4+CD25+調節性T細胞：分選的CD4+CD25+調節性T細胞（2×105個/2mL）在含有TLR-8激動劑(VTX-2337，3μg/mL)的介質中培養3天，洗滌后，用于下述試驗。

2.7.2 殺傷實驗：自體CD34+白血病細胞作為靶細胞，在5%CO2，37℃ 條件下用終濃度為2.5μmol/L的CFSE標記10min。洗3次去除殘余的染料，并懸浮于完全培養基中。實驗用U型96孔板，分為3組：1）空白組（單獨靶細胞組）：靶細胞（自體CD34+白血病細胞）100μL，2）對照組：加入TLR-8激動劑（VTX-2337）預處理前CD4+CD25+調節性T細胞、效應細胞（CD8+CTL）和靶細胞（自體CD34+白血病細胞）各100μL，每孔均加900個靶細胞，效靶比分別為12.5:1、25:1，設置3個平行復孔；3）TLR-8激動劑組：加入TLR-8激動劑（VTX-2337）預處理后CD4+CD25+調節性T細胞、效應細胞（CD8+CTL）和靶細胞（自體CD34+白血病細胞）各100μl， 每孔均加900個靶細胞，效靶比分別為25:1、 12.5:1，設置3個平行復孔。120g離心2分鐘，于5%CO2，37℃孵育4小時。共孵育結束后，加入5μL 7AAD（100μg/mL）置于冰浴5min，采用流式細胞術分析，測定CD8+CTL的殺傷功能。公式如下：殺傷活性（%）=7AAD/CFSE×100%。

2.8 統計學分析

應用SPSS 25.0進行數據處理，結果均用均數± 標準差表示，多組均數比較在方差齊性時采用方差分析，兩兩比較采用T檢驗，應用FlowJo軟件分析流式結果，Graphpad prism 5軟件作圖，P＜0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 流式細胞術檢測TLR-8 激動劑對調節性T 細胞增殖影響

對照組CD4+CD25+T細胞增殖活性為23.73%±3.36%，TLR-8激動劑組CD4+CD25+T細胞增殖活性為2.95%±1.23%，P＜0.01，差異具有統計學意義，TLR-8激動劑組CD4+CD25+T細胞增殖活性較對照組顯著下降，提示TLR-8激動劑明顯抑制了CD4+CD25+T細胞的增殖活性。如圖1、圖2。

圖1 對照組和TLR-8 激動劑組 CD4+CD25+ regulatory T 增殖活性比較。結果提示TLR-8 激動劑明顯抑制了 CD4+CD25+ regulatory T 的增殖活性，P＜0.01。

圖2 對照組和TLR-8 激動劑組 CD4+CD25+ regulatory T 增殖活性比較

3.2 流式檢測TLR-8 激動劑通過CD4+CD25+調節性T 細胞對CTL 殺傷CD34+白血病細胞作用的影響

效靶比12.5：1組對照組殺傷率為13.81%±1.77%，TLR-8激動劑組殺傷率為46.98±7.98%，P＜0.01，差異具有統計學意義，效靶比25：1組對照組殺傷率為27.15%±5.99%，TLR-8激動劑組殺傷率為50.88±8.83%，P＜0.01，差異具有統計學意義，TLR-8激動劑組CTL殺傷功能較顯著增強，提示TLR-8激動劑明顯抑制了CD4+CD25+T細胞免疫抑制功能，進而提高CTL殺傷功能。如圖 3、圖 4、圖 5、圖 6、圖 7。

圖3 空白組

圖4 效靶比12.5：1 下，對照組和TLR-8 激動劑組CTLs 的殺傷率比較。結果提示TLR-8 激動劑明顯增加了CTLs 的殺傷率，P＜0.05。

圖5 效靶比12.5：1 下，對照組和TLR-8 激動劑組CTLs 的殺傷率比較。

圖6 效靶比25：1 下，對照組和TLR-8 激動劑組CTLs 的殺傷率比較。結果提示TLR-8 激動劑明顯增加了CTLs 的殺傷率，P＜0.05。

圖7 效靶比25：1 下，對照組和TLR-8 激動劑組CTLs 的殺傷率比較。

4 討論

AML占急性白血病的80%，隨后發現幾乎各類 AML 亞型中都存在 CD34+CD38-的LSC，它們約占整個AML細胞群的0.1%-1%，有學者提出針對 LSC 表面特異性標志物的靶向治療可選擇性清除AML細胞及 LSCs，而不損傷正常造血干/祖細胞[5]，為白血病治療提供新的思路，拓寬了白血病治療的途徑。

DC是具有強大功能的APC， TLRs在DC、巨噬細胞、中性粒細胞、黏膜上皮細胞和內皮細胞等均有表達，其中TLR-8結合配體后，通過 MyD88 信號通路活化 TLR-8下游分子，如 IRAK、NF-κB、MAPK 等，引起 Th1細胞因子基因表達[6,9]，促進 Th1 細胞因子的分泌。Peng 等[7]研究發現，TLR-8 通過識別配體觸發TLR8-MyD88-IRAK4 信號活化途徑抑制 Tregs細胞進而抑制腫瘤的發生發展，人們嘗試利用免疫佐劑或通過體外培養方法制備DC 疫苗，用于促進 DC 的成熟，增強機體的免疫反應。大量研究證實無論是不成熟的DC還是成熟的DC均可誘導具有抑制功能的CD4+CD25+調節性T細胞的生成。如果在接種負載腫瘤抗原的DC之前，利用抗-CD25抗體去除CD4+CD25+調節性T細胞，則可有效地增強 DC的抗腫瘤免疫應答[8]。有研究表明TLR-8激動劑可直接阻斷CD4+CD25+調節性T細胞發揮免疫抑制功能，增強CTL 的抗腫瘤免疫功能[7]。

本研究結果發現在TLR-8激動劑干預下，CD4+CD25+調節性T細胞增殖活性明顯下降，在殺傷實驗中，CTL殺傷能力明顯增強。Ye等學者[10]研究證明腫瘤衍生的內源性cAMP是介導腫瘤誘導T細胞衰老的重要介質，并探討了TLR-8 配體 poly -G3 預防腫瘤誘導的T細胞衰老的作用是由于降低腫瘤細胞中的cAMP水平，poly- G3處理后腫瘤細胞中的cAMP水平顯著降低。Dietsch等研究者[11]利用VTX-2337來刺激THP-1細胞和人PBMC后發現可以增強NK細胞活性，從而增加曲妥單抗、利妥昔單抗、西妥昔單抗等調節的ADCC，并通過 TLR-8 信號通路誘導 IL-1β、IL-18 的分泌。TLR-8激動劑通過結合其配體后介導T細胞衰老并增強體內ADDC。本研究中VTX-2337是通過結合其配體，干預CD4+CD25+調節性T細胞增殖和腫瘤抑制能力，從兩個方向增強腫瘤細胞的清除功能，因此認為TLR-8激動劑可作為DC的免疫佐劑，提高體內DC抗腫瘤能力，在今后腫瘤免疫治療方面有臨床應用前景。