利用CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建斑馬魚(yú)tspo 基因純合突變體

王一川，岳蕓蕓，尚靖

（中國(guó)藥科大學(xué)，江蘇 南京）

0 引言

TSPO是位于線粒體外膜上的五次跨膜蛋白，在多種組織中具有廣泛表達(dá)，如外周的肺部、腎臟、骨髓、皮膚和中樞腦膠質(zhì)細(xì)胞等。許多研究指出TSPO的表達(dá)與多種疾病如抑郁癥[1]、腦損傷[2]、阿爾茲海默癥[3,4]、腦部腫瘤[5]等具有極高的相關(guān)性。目前，對(duì)于TSPO蛋白功能的研究主要分為兩類：一類是基于TSPO蛋白在腎上腺等神經(jīng)類固醇合成相關(guān)的組織中表達(dá)量豐富這一特征，推測(cè)TSPO可能參與類固醇激素合成的調(diào)節(jié)。膽固醇由線粒體外側(cè)向內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程一直被認(rèn)為是類固醇激素合成的關(guān)鍵限速步驟。2005年有研究指出TSPO蛋白位于線粒體膜外段具有膽固醇識(shí)別序列CRAC[6]，膽固醇可能通過(guò)結(jié)合CRAC后被TSPO轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)部。同時(shí)有許多研究指出TSPO高選擇性配體如PK11195、Ro54864能夠誘導(dǎo)腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞及睪丸間質(zhì)細(xì)胞中類固醇激素的合成[7,8]。另一類則是基于TSPO蛋白在正常生理狀態(tài)下中樞表達(dá)量較低，而在腦部炎癥狀態(tài)下小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)量迅速上升這一特征，將 TSPO配體應(yīng)用在正電子發(fā)射斷層掃描（positron emission tomography，PET）中，用以診斷腦內(nèi)炎癥發(fā)生[5,9]。除此之外，還有研究表明TSPO也參與了氧化應(yīng)激[10]，線粒體穩(wěn)態(tài)和能量代謝調(diào)節(jié)[11]，其作用包括調(diào)節(jié)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)節(jié)線粒體呼吸鏈中相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而調(diào)節(jié)ATP的產(chǎn)生[12,13]等。

隨著基因敲除技術(shù)的出現(xiàn)，為基因功能的研究提供了直接證據(jù)。如，野生型小鼠在主動(dòng)脈弓縮窄（transverse aortic constriction，TAC）術(shù)誘導(dǎo)心衰后，心臟中TSPO表達(dá)量伴隨著心臟衰竭程度加重而上升，而在心臟組織特異性敲除Tspo可有效減輕術(shù)后小鼠心衰程度，提示TSPO在心臟病理進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[14]。最早的Tspo敲除小鼠模型顯示，缺乏Tspo會(huì)導(dǎo)致小鼠胚胎期致死[15]，這也曾被視作TSPO參與類固醇激素合成調(diào)節(jié)的重要證據(jù)之一。而2014年有研究者通過(guò)Cre/LoxP系統(tǒng)在C57/BL6小鼠上進(jìn)行Tspo敲除[16]，卻發(fā)現(xiàn)敲除小鼠具有正常的生長(zhǎng)發(fā)育和壽命，并且在類固醇激素合成等關(guān)鍵指標(biāo)中與野生型小鼠相比并無(wú)顯著性差異。而斑馬魚(yú)作為研究早期胚胎發(fā)育的優(yōu)勢(shì)模型之一，2009年有研究通過(guò)原位雜交實(shí)驗(yàn)指出在斑馬魚(yú)幼魚(yú)發(fā)育過(guò)程早期，tspo主要表達(dá)在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（intermediate cell mass,ICM）中表達(dá)，可能參與原始紅細(xì)胞的分化[17]，但其在斑馬魚(yú)生物體發(fā)育過(guò)程中的具體功能未作描述。

人類疾病的動(dòng)物模型一直是藥物發(fā)現(xiàn)和機(jī)制探索的重要基石，在疾病動(dòng)物模型中我們才可以更準(zhǔn)確地將基因功能與發(fā)病機(jī)制聯(lián)系在一起。斑馬魚(yú)模型在研究基因功能和病理機(jī)制過(guò)程中具有極為突出的優(yōu)勢(shì)，與大小鼠單次交配產(chǎn)仔數(shù)8～13只相比，性成熟斑馬魚(yú)平均7～10天可交配產(chǎn)卵一次，單次可收獲受精卵70～200枚，可以通過(guò)多種基因工程技術(shù)和藥物處理構(gòu)建可視化疾病模型進(jìn)行大規(guī)模藥物開(kāi)發(fā)研究，例如針對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、代謝疾病或腫瘤等基于表型的藥物篩選等[18]。目前，利用CRISPR/Cas9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9，CRISPR/Cas9)系統(tǒng)能夠在斑馬魚(yú)體內(nèi)實(shí)現(xiàn)基因的高效定點(diǎn)敲除以及敲入修飾，這為建立人類疾病的斑馬魚(yú)模型、探究基因功能或在斑馬魚(yú)中進(jìn)行藥物篩選提供技術(shù)支持。因此，本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)建立可穩(wěn)定遺傳的tspo敲除的斑馬魚(yú)品系，并觀察tspo敲除后斑馬魚(yú)早期發(fā)育情況，為研究tspo基因在斑馬魚(yú)早期發(fā)育中的功能以及相關(guān)疾病的靶點(diǎn)確證提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

pGEM T easy（A1360）購(gòu)自美國(guó)Promega公司；體外轉(zhuǎn)錄試劑盒MAXI script T7 transcription kit（AM1314）購(gòu)自Ambion公司；PCR clean up kit（AP-PCR-250）購(gòu)自 Axygen公司；pYSY-scaffold質(zhì)粒模板購(gòu)自南京堯順禹生物科技公司；GenCrispr NLSCas9-NLS Nuclease（Z03389-50）購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司；Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（P505-d1）、Fast pure plasmid mini kit（DC201-01）、DH5α competent cell（C502-03）、2x Taq master Mix(Dye Plus)（P112-02）和 One Step Mouse Genotyping Kit（PD101-01）購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；斑馬魚(yú)培養(yǎng)系統(tǒng)購(gòu)自上海海圣公司；斑馬魚(yú)顯微注射系統(tǒng)購(gòu)自世界精密儀器商貿(mào)有限公司；野生型AB系成年斑馬魚(yú)，6-7月齡，雌雄各半，由武漢國(guó)家斑馬魚(yú)資源中心提供種魚(yú)，南京睿鷹潤(rùn)澤生物醫(yī)藥科技有限公司斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)室自行繁育。

1.2 sgRNA 靶點(diǎn)序列設(shè)計(jì)與合成

利用在線軟件CCTop（https://crispr.cos.uni-heidelberg.de/）進(jìn)行靶位點(diǎn)的預(yù)測(cè)，斑馬魚(yú)基因組tspo共有2個(gè)轉(zhuǎn)錄本，在兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本共有序列的第二、三個(gè)外顯子上設(shè)計(jì)20bp的sgRNA位點(diǎn)（圖1），選取得分高且脫靶少的位點(diǎn)，并在NCBI網(wǎng)站上（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對(duì)sgRNA位點(diǎn)在斑馬魚(yú)基因組中BLAST。將靶點(diǎn)序列設(shè)計(jì)在正向引物中，sgRNA靶序列以N表示，正向引物通式為5‘-TAATACGACTCACTATAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’，反向引物序列為：5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3’，具體靶位點(diǎn)序列已列出（表1），從南京金斯瑞生物科技有限公司訂購(gòu)以上引物。

圖1 tspo 基因敲除斑馬魚(yú)sgRNA 位點(diǎn)設(shè)計(jì)及敲除流程

表1 測(cè)序及基因型鑒定引物序列

本實(shí)驗(yàn)以pYSY-scaffold質(zhì)粒為模板，通過(guò)高保真酶體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：12.5uL Phanta Max Buffer，9.5uL DEPC水，1.0uL（1ng/uL）pYSY-scaffold質(zhì)粒，1.0 uL上游引物，1.0 uL下游引物。PCR儀程序：95℃ 預(yù)變性 30s；95℃ 變性 15s，58℃ 退火 15s，72℃ 延伸 5s，共 35個(gè)循環(huán)；72℃ 完全延伸 3min，16℃ 終止。將產(chǎn)物用PCR clean up kit（Axygen）純化回收，去除PCR未反應(yīng)完的其他原料以及RNase酶污染，利用正向引物上所添加的T7啟動(dòng)子，按照T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，并將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物利用乙醇沉淀法回收。sgRNA 經(jīng)電泳檢測(cè)及濃度測(cè)定后，分裝并貯存至-80 ℃冰箱。

1.3 顯微注射及敲除活性驗(yàn)證

斑馬魚(yú)飼養(yǎng)按照The Zebrafish Book中的方法進(jìn)行。循環(huán)水溫28.5°C，光照/黑暗按照14/10h間隔，每天上下午各喂食豐年蝦一次。收集胚胎前一晚將雌雄斑馬魚(yú)按照1：1比例放置入繁殖缸，并以隔板隔開(kāi)過(guò)夜。第二天光照開(kāi)啟后抽去隔板，15分鐘后收集一細(xì)胞時(shí)期胚胎，用egg water（斑馬魚(yú)胚胎培養(yǎng)溶液）清洗后準(zhǔn)備注射。將體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA與GenCrispr NLS-Cas9-NLS Nuclease（Z03389-50）共同注射到胚胎，注射體系：體外轉(zhuǎn)錄sgRNA 20ng/uL/個(gè)，Cas9核酸酶40ng/uL，DEPC水補(bǔ)足至5uL，注射后得到G0斑馬魚(yú)，將胚胎置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

注射后24h，收集5個(gè)胚胎并加入10uL One Step Mouse Genotyping Kit裂解液提取基因組，裂解反應(yīng)：55°C 30min，95°C 5min，將裂解產(chǎn)物低溫離心后，上清用作后續(xù)PCR反應(yīng)。在sgRNA靶序列上下游200bp左右位置設(shè)計(jì)測(cè)序引物，測(cè)序引物TSET序列見(jiàn)表2，以提取后的上清為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：1uL 模板，0.5uL上游引物，0.5uL下游引物，8uL DEPC水，10uL 2x Taq master Mix(Dye Plus)，所用 PCR儀程序：95°C 預(yù)變性3min；95°C 變性 30s，58°C 退火 30s，72°C延伸 20s，共 35個(gè)循環(huán)；72°C 徹底延伸3min；16°C終止。將擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物利用PCR clean up kit純化，取純化產(chǎn)物按照說(shuō)明書(shū)操作與pGEM T easy載體連接后轉(zhuǎn)化到DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，過(guò)夜后隨機(jī)選取25個(gè)單克隆加入到10uL LB培養(yǎng)基中，取1uL作模板，以測(cè)序引物TEST進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序同上，DNA電泳驗(yàn)證產(chǎn)物大小，將條帶大小相近的PCR產(chǎn)物等比混樣測(cè)序，條帶大小不同的PCR產(chǎn)物單獨(dú)測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果的序列與野生型序列進(jìn)行對(duì)比，若在sgRNA序列附近出現(xiàn)套峰則說(shuō)明敲除成功，并判斷突變位置和位點(diǎn)活性，將確認(rèn)位點(diǎn)活性有效的同批次G0注射胚胎正常飼育。

1.4 F1 斑馬魚(yú)tspo 敲除品系的篩選

待G0斑馬魚(yú)性成熟，雌雄互相交配得到F1斑馬魚(yú)，將F1斑馬魚(yú)培養(yǎng)至3月齡時(shí)對(duì)87尾F1斑馬魚(yú)剪尾提取基因組，通過(guò)測(cè)序引物TEST進(jìn)行擴(kuò)增后將擴(kuò)增產(chǎn)物直接送測(cè)序公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與野生型序列進(jìn)行對(duì)比，判斷突變類型并保留至少兩種成功敲除品系。

1.5 F2 純合突變斑馬魚(yú)的基因型鑒定

將保留的兩種突變類型-16bp和-4+16bp的F1雜合斑馬魚(yú)（tspo-16/+和tspo-4+16/+，分別命名為tspocpu87和tspocpu88）分別內(nèi)交，分別得到F2斑馬魚(yú)30尾和68尾，待3月齡時(shí)對(duì)F2斑馬魚(yú)剪尾鰭提取基因組，利用PCR鑒定基因型的方法設(shè)計(jì)三條引物，其中一條為共用引物，另外兩條為差異引物，這兩條差異引物的3’端設(shè)計(jì)在發(fā)生突變的區(qū)域，野生型引物只能擴(kuò)增出野生型條帶，突變型引物只能擴(kuò)增出突變型條帶，據(jù)此區(qū)分野生型、雜合子和純合子基因型，具體序列見(jiàn)表2。以剪尾提取基因組為模板進(jìn)行PCR鑒定。PCR 儀程序設(shè)置 : 95℃ 預(yù)變性 3 min；95℃ 變性 30s，60℃退火 30 s，72℃ 延伸 15s，35 個(gè)循環(huán)；72℃ 徹底延伸 3 min，16℃終止，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA電泳，只有單一條帶的為野生型或純合子，具有雙條帶的為雜合子，基因型鑒定出的純合子通過(guò)測(cè)序引物TEST擴(kuò)增后送測(cè)序以驗(yàn)證PCR鑒定結(jié)果無(wú)誤，篩選得純合突變F2斑馬魚(yú)后擴(kuò)群。

1.6 斑馬魚(yú)胚胎心率的觀察

待基因型鑒定篩選所得純合突變斑馬魚(yú)飼養(yǎng)至性成熟，選取同齡野生型斑馬魚(yú)在同一天雌雄交配，在抽去隔板15分鐘內(nèi)收集同一批胚胎，按照正常方式將胚胎置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，斑馬魚(yú)胚胎心臟搏動(dòng)在24hpf左右開(kāi)始出現(xiàn)，至72hpf時(shí)心率趨于穩(wěn)定[19]，在48hpf和72hpf時(shí)在顯微鏡下記錄15s內(nèi)斑馬魚(yú)的心率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 斑馬魚(yú)tspo 敲除G0 顯微注射敲除檢測(cè)

對(duì)于斑馬魚(yú)tspo基因具有的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本，此次位點(diǎn)設(shè)計(jì)在其共有的第二、三個(gè)外顯子上，共設(shè)計(jì)4組sgRNA位點(diǎn)，敲除流程及sgRNA位點(diǎn)示意如圖1，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄獲得sgRNA片段后與Cas9核酸酶混勻后進(jìn)行顯微注射得到G0斑馬魚(yú)。選取注射后24h的胚胎提取基因組，根據(jù)上述方法，通過(guò)TA克隆并混樣測(cè)序的方式進(jìn)行鑒定。通過(guò)對(duì)比測(cè)序結(jié)果可知，sgRNA位點(diǎn)均檢測(cè)到突變（圖2），在隨機(jī)選取的25個(gè)克隆中檢測(cè)到單一位點(diǎn)活性的克隆6個(gè)，雙位點(diǎn)同時(shí)突變引起大片段刪除的2個(gè)（表2），四個(gè)sgRNA共注射突變效率估計(jì)為32%，后續(xù)將此四個(gè)sgRNA進(jìn)行大量注射，獲得G0代斑馬魚(yú)。

表2 sgRNA 序列及在G0 中的敲除效率

2.2 F1 突變類型鑒定

將成年G0斑馬魚(yú)雌雄互相交配，得到F1斑馬魚(yú)后飼養(yǎng)至3月齡剪尾提取基因組送測(cè)序。共鑒定87條F1斑馬魚(yú)，得到四種類型突變斑馬魚(yú)共18條，得到-16bp、-4+16bp、-5+3bp、-1bp四種突變體18條，突變比例20.69%，具體突變數(shù)量及位點(diǎn)見(jiàn)表3。

保留兩種突變類型-16 bp和-4+16 bp，兩種突變類型均會(huì)引起斑馬魚(yú)Tspo蛋白表達(dá)提前終止，斑馬魚(yú)野生型Tspo蛋白序列長(zhǎng)度為162個(gè)氨基酸，-16 bp和-4+16 bp兩種突變類型的Tspo氨基酸序列分別為100個(gè)氨基酸和88個(gè)氨基酸，黃色標(biāo)注所示序列為突變位點(diǎn)處對(duì)應(yīng)的野生型序列，紅色標(biāo)注所示序列為插入或缺失堿基以及突變后Tspo蛋白表達(dá)提前終止后的產(chǎn)物因此以其突變體進(jìn)行建系，自交獲得F2斑馬魚(yú)。

2.3 F2 純合突變體篩選

對(duì)于獲得的兩種突變體自交得到的F2斑馬魚(yú)，待其生長(zhǎng)至3月零時(shí)剪尾鰭提取基因組，在插入或缺失堿基的位置設(shè)計(jì)基因型鑒定引物用于F2代基因型鑒定篩選純合突變斑馬魚(yú)（序列見(jiàn)表2），利用引物PCR擴(kuò)增后，將同一基因組模板的產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行電泳分析，若兩對(duì)鑒定引物都能擴(kuò)增出產(chǎn)物，則此基因組對(duì)應(yīng)的F2斑馬魚(yú)為雜合突變，若只有野生型引物具有擴(kuò)增產(chǎn)物而突變型引物無(wú)產(chǎn)物，則對(duì)應(yīng)的為野生型斑馬魚(yú)，若只有突變型引物擴(kuò)增產(chǎn)物，則認(rèn)為對(duì)應(yīng)的是純合突變斑馬魚(yú)（如圖4）。所鑒定F2突變比例如下（如表4），通過(guò)基因型鑒定，由-16bp突變F1斑馬魚(yú)自交所得F2斑馬魚(yú)共鑒定30尾，得到純合突變6尾，雜合突變19尾，野生型5尾；由-4+16bp突變F1斑馬魚(yú)自交所得F2斑馬魚(yú)共鑒定68尾，純合突變13尾，雜合突變32尾，野生型23尾，通過(guò)PCR鑒定得到的純合突變斑馬魚(yú)另外送測(cè)序驗(yàn)證基因型，以避免假陽(yáng)性出現(xiàn)。

圖2 sgRNA 敲除活性測(cè)序結(jié)果

表3 F1 鑒定突變結(jié)果

圖3 tspocpu87 和tspocpu88 斑馬魚(yú)DNA 序列及蛋白表達(dá)示意圖

圖4 F2 斑馬魚(yú)基因型鑒定結(jié)果

表4 F2 基因型鑒定情況

2.4 斑馬魚(yú)整體tspo 基因敲除對(duì)幼年斑馬魚(yú)心率的影響

將篩選得到的tspocpu87和tspocpu88純合突變斑馬魚(yú)飼養(yǎng)至性成熟，現(xiàn)觀察tspocpu87斑馬魚(yú)所產(chǎn)胚胎在早期發(fā)育過(guò)程心率的變化。收集野生型和tspocpu87斑馬魚(yú)生產(chǎn)的胚胎后，每隔24h在顯微鏡下觀察心率。結(jié)果如圖5顯示，在48hpf時(shí)野生型斑馬魚(yú)和tspo-16/-16斑馬魚(yú)心率分別為110.67±6.93次/分和112.00±6.74次/分，在72hpf時(shí)野生型斑馬魚(yú)和tspo-16/-16斑馬魚(yú)心率分別為164.89±8.43次/分和162.22±9.80次/分，未發(fā)現(xiàn)tspo 基因敲除后對(duì)斑馬魚(yú)早期發(fā)育過(guò)程中心率產(chǎn)生顯著影響。

圖5 tspo 基因敲除后斑馬魚(yú)于48、72hpf 時(shí)心率變化

2.5 討論

TSPO在生物體各器官和組織中廣泛表達(dá)，作為線粒體五次跨膜蛋白，其在類固醇激素合成，PET成像診斷和線粒體相關(guān)功能的研究得到了極大地拓展[20]。TSPO基因在斑馬魚(yú)體內(nèi)的生理功能研究較少，目前研究指出TSPO可能參與斑馬魚(yú)早期發(fā)育時(shí)原始紅細(xì)胞的發(fā)生[17]，TSPO配體FGIN-1-27能夠減少在明暗偏好性實(shí)驗(yàn)中斑馬魚(yú)表現(xiàn)出的抑郁樣行為[21]，TSPO配體PK11195能夠增加斑馬魚(yú)幼魚(yú)對(duì)于葡萄糖的耐受，減少肝臟脂肪變性，調(diào)節(jié)能量代謝[22]。

但TSPO在早期發(fā)育過(guò)程中的功能上存在分歧。利用CRISPR/Cas9技術(shù)在斑馬魚(yú)tspo 基因的第二、三個(gè)外顯子位置設(shè)計(jì)四個(gè)sgRNA進(jìn)行敲除，所設(shè)計(jì)的四個(gè)sgRNA在注射24h后通過(guò)TA克隆后混樣測(cè)序的方式推算總的敲除活性為32%，通過(guò)測(cè)序的方式避免了T7E1酶切檢測(cè)中由于T7酶錯(cuò)誤的識(shí)別了DNA片段中十字交叉，holiday結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致的假陽(yáng)性結(jié)果。在F1斑馬魚(yú)基因型篩選過(guò)程中，通過(guò)直接測(cè)序以及與野生型序列對(duì)比，我們獲得了四種不同的突變類型，并且突變位置在不同的sgRNA位點(diǎn)，突變類型分別為-16bp、-4+16bp、-5+3bp、-1bp，突變比例為20.69%，確定保留突變類型為-16bp，-4+16bp兩種。在雌雄交配得到的F2斑馬魚(yú)中進(jìn)行基因型鑒定時(shí)，我們使基因特異性引物的3端設(shè)計(jì)在堿基缺失或插入的位置，因此純合子或野生型斑馬魚(yú)都只能擴(kuò)增出單一條帶，分別鑒定出-16bp和-4+16bp兩種純合突變6尾和13尾。通過(guò)觀察突變體胚胎早期發(fā)育，我們發(fā)現(xiàn)tspo缺失不會(huì)導(dǎo)致胚胎死亡，并且對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程仲心率沒(méi)有顯著影響。本研究成功構(gòu)建兩種斑馬魚(yú)tspo 敲除突變體tspocpu87和tspocpu88，為進(jìn)一步研究TSPO的生理功能以及靶點(diǎn)確證提供基礎(chǔ)。