水環(huán)境中Ni2+對(duì)鯉魚鰓和肝臟的組織損傷

陳代宇，楊 飛，陳德芳，耿 毅

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，四川溫江 611130；2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川溫江 611130)

鎳(Nickel，Ni)是水環(huán)境中常見的污染物[1]，一部分來自地質(zhì)風(fēng)化的自然資源，一部分來自工業(yè)廢水排放、生活污水排放等人為活動(dòng)[2]。水體Ni污染程度與沿岸污染源的分布密切相關(guān)，在工業(yè)集中地段及城市段的河流污染較嚴(yán)重，資料顯示長(zhǎng)江上游[3]、海河河口[4]、珠江下游[5]和松花江[6]表層沉積物中Ni分別達(dá)到34.52 mg/kg、48.70 mg/kg、54.10 mg/kg和99.00 mg/kg，使周邊地區(qū)稻田水環(huán)境遭到Ni污染的可能性增加。雖然Ni是生物體不可缺少的微量營(yíng)養(yǎng)素[7]，但有研究表明，過量Ni蓄積于生物體內(nèi)也會(huì)具有潛在的致癌性[8]、基因毒性[9]和免疫毒性[10]等毒害作用。過量的Ni在水生生物體內(nèi)富集會(huì)降低水生生物的呼吸作用、離子調(diào)節(jié)和抗氧化能力[11]。水環(huán)境中的Ni主要以鹵化物、硝酸鹽、硫酸鹽等形式溶于水，Ni2+在水環(huán)境中普遍存在，根據(jù)已有的研究報(bào)道，Ni2+對(duì)虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[12]、大黃魚(Pseudosciaenacrocea)幼魚[13]、泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)和大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)[14]的96 h LC50分別為0.33、0.79、3.83、3.84 mmol/L，并且可造成虹鱒[15]、鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)[16]、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[17]的鰓和肝臟組織損傷，而目前關(guān)于Ni2+對(duì)鯉魚組織的急性損傷還未見報(bào)道。

鯉魚是四川省內(nèi)稻田養(yǎng)殖中常見的品種，養(yǎng)殖鯉魚具有成本低、收益大的特點(diǎn)[18]，水體中Ni2+濃度為0.003、0.005、0.008 mmol/L時(shí)，會(huì)影響鯉魚的游泳情況和呼吸頻率，從而使得存活率降低[19]，加劇經(jīng)濟(jì)損失。但養(yǎng)殖水環(huán)境中Ni2+對(duì)鯉魚的急性致死濃度和急性病理?yè)p傷機(jī)理尚不清楚，因此通過急性毒性試驗(yàn)明確Ni2+對(duì)鯉魚的安全濃度是非常必要的。本研究通過Ni2+對(duì)鯉魚的急性毒性試驗(yàn)，明確Ni2+對(duì)鯉魚的安全濃度。并且在急性毒性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，從組織病理學(xué)變化的角度初步研究水環(huán)境中Ni2+對(duì)鯉魚鰓和肝臟的急性損傷，以期為Ni2+對(duì)魚類的急性毒性和致病機(jī)理研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及試劑

600尾健康鯉魚全長(zhǎng) (4.50 ± 0.50) cm，體質(zhì)量(2.57±0.52) g，購(gòu)自四川浦江養(yǎng)殖場(chǎng)。暫養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室(700×400×300) mm3的水族箱中，養(yǎng)殖水體的體積為40 L，水溫(22±1)℃，pH為6.5～7.0，待魚適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境后開始試驗(yàn)，試驗(yàn)前禁食24 h。NiSO4·6H2O為分析純，成都市科龍?jiān)噭┗S產(chǎn)品，在試驗(yàn)前根據(jù)所需的Ni2+濃度進(jìn)行配制。

1.2 急性毒性試驗(yàn)

預(yù)試驗(yàn)確定96 h內(nèi)0%和100%鯉魚死亡的Ni2+濃度為0.55～1.25 mmol/L，設(shè)置1個(gè)對(duì)照組和7個(gè)試驗(yàn)組，Ni2+濃度分別為0、0.55、0.62、0.72、0.83、0.96、1.09、1.25 mmol/L。將240尾魚隨機(jī)分到對(duì)照組和各試驗(yàn)組中，每組30尾，水體體積為8 L，溫度和pH與暫養(yǎng)期間一致。參照王萬(wàn)良等[20]、郭建波[13]的研究方法進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，試驗(yàn)期間每24 h更換1次藥液，進(jìn)行 96 h的臨床癥狀觀察并記錄死亡數(shù)量，根據(jù)各試驗(yàn)組在各時(shí)間點(diǎn)的死亡數(shù)，用寇氏法計(jì)算Ni2+對(duì)鯉魚的96 h LC50[21]；并計(jì)算安全濃度(SC)，SC=96 h LC50× 0.01[2]。

1.3 鰓和肝臟的組織病理學(xué)觀察

基于急性毒性試驗(yàn)的鯉魚死亡情況，設(shè)置1個(gè)對(duì)照組和5個(gè)試驗(yàn)組，Ni2+濃度分別為0.72、0.83、0.96、1.09、1.25 mmol/L，將360尾魚隨機(jī)分到對(duì)照組和試驗(yàn)組中，每組30尾，每組2個(gè)重復(fù)，其他處理同急性毒性試驗(yàn)。對(duì)試驗(yàn)魚進(jìn)行連續(xù)96 h的臨床癥狀觀察，對(duì)每組瀕死魚進(jìn)行剖檢，并收集鰓和肝臟，固定在φ=10%的中性福爾馬林溶液中。參照王國(guó)華等[22]、陳德芳[23]的方法進(jìn)行組織切片和蘇木素-伊紅染色，通過光學(xué)顯微鏡觀察組織病理變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性試驗(yàn)

試驗(yàn)期間，對(duì)照組(0 mmol/L)的鯉魚在整個(gè)試驗(yàn)期間無死亡和任何異常現(xiàn)象。試驗(yàn)組除 0.55 mmol/L組以外，其他組的鯉魚在試驗(yàn)的 48 h內(nèi)，都出現(xiàn)躁動(dòng)、跳躍和鰓蓋活動(dòng)加快的情況，并且濃度越高躁動(dòng)情況越嚴(yán)重，48 h后，鯉魚表現(xiàn)為游動(dòng)緩慢、反應(yīng)呆滯；瀕死鯉魚的體表和鰓覆蓋大量黏液，魚體色變暗，鰓絲充血發(fā)紅，肝臟腫大充血。

在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)，對(duì)照組和0.55 mmol/L組無鯉魚死亡，其余試驗(yàn)組都有鯉魚死亡，死亡量隨Ni2+濃度升高而增多，值得注意的是，1.25 mmol/L組的鯉魚在試驗(yàn)24 h內(nèi)全部死亡(表1)。采用寇氏法算出96 h LC50為0.72 mmol/L，SC為0.007 2 mmol/L，表明Ni2+濃度高于 0.007 2 mmol/L的養(yǎng)殖水體對(duì)鯉魚有急性毒性。

表1 Ni2+對(duì)鯉魚的急性毒性試驗(yàn)Table 1 Acute toxicity experiment of Ni2+ to carp

2.2 組織病理學(xué)研究

鰓組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組(0 mmol/L)鰓的組織結(jié)構(gòu)完整，未見明顯病理變化，鰓小片結(jié)構(gòu)正常，呼吸上皮細(xì)胞緊貼在鰓小片表面，毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)完整，血竇內(nèi)紅細(xì)胞的數(shù)量、形態(tài)正常，柱狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整(圖1-A)。24 h內(nèi)，高濃度試驗(yàn)組 (1.25 mmol/L)的鯉魚全部死亡，鰓組織中大量的鰓小片呼吸上皮細(xì)胞壞死、脫落，毛細(xì)血管破裂，紅細(xì)胞溢出血竇(圖1-B)。48 h內(nèi)觀察到中低濃度試驗(yàn)組(0.72～1.09 mmol/L)鯉魚的鰓結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯變化，主要表現(xiàn)為鰓小片呼吸上皮水腫浮離，鰓小片融合，柱細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞(圖1-C，圖1-D)；72 h后，鰓的組織病理學(xué)變化主要表現(xiàn)為以血管反應(yīng)為主的適應(yīng)性病變，鰓小片內(nèi)紅細(xì)胞充盈，血竇擴(kuò)張，多個(gè)紅細(xì)胞重疊、堆積在血竇內(nèi)(圖1-E，圖1-F)。結(jié)果表明水環(huán)境中Ni2+會(huì)對(duì)鯉魚的鰓造成急性損傷，高濃度試驗(yàn)組(1.25 mmol/L)的鰓組織損傷以鰓小片呼吸上皮細(xì)胞壞死、脫落為主，中低濃度試驗(yàn)組(0.72～1.09 mmol/L)的鰓組織損傷以鰓小片呼吸上皮水腫浮離、上皮細(xì)胞增生為主。

肝臟組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組(0 mmol/L)無明顯病理變化，肝細(xì)胞胞漿均質(zhì)淡染，肝細(xì)胞排布緊密，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞界限清晰，細(xì)胞核呈車輪狀，核仁清晰(圖2-A)。試驗(yàn)期間，高濃度試驗(yàn)組(1.25 mmol/L)的鯉魚24 h內(nèi)全部死亡，肝臟組織血竇淤血，肝細(xì)胞腫大、細(xì)胞膜完整、分界清晰、細(xì)胞核固縮(圖2-B)。48 h內(nèi)觀察到中低濃度試驗(yàn)組(0.72～1.09 mmol/L)的鯉魚肝臟出現(xiàn)明顯的組織病理變化，肝血竇、中央靜脈淤血，肝細(xì)胞界限模糊、胞漿空泡化、細(xì)胞質(zhì)深染，細(xì)胞核無明顯變化，肝臟組織局部區(qū)域細(xì)胞壞死(圖2-C，圖2-D)，72 h后，肝細(xì)胞胞質(zhì)深染，肝臟局部區(qū)域出現(xiàn)空泡融合(圖2-E，圖2-F)。結(jié)果表明水環(huán)境中的Ni2+會(huì)對(duì)鯉魚的肝臟造成急性損傷，而高濃度試驗(yàn)組(1.25 mmol/L)以細(xì)胞核固縮為主，中低濃度試驗(yàn)組(0.72～1.09 mmol/L)以肝細(xì)胞空泡變性為主。

A.對(duì)照組鰓的組織結(jié)構(gòu) Gill tissue structure in the control group；B.1.25 mmol/L試驗(yàn)組鰓組織的病理學(xué)變化 Gill histopathology changes of 1.25 mmol/L group；C.0.72 mmol/L試驗(yàn)組48 h內(nèi)鰓的組織病理學(xué)變化 Gill histopathology changes of 0.72 mmol/L group within 48 h；D.1.09 mmol/L試驗(yàn)組48 h內(nèi)鰓的組織病理學(xué)變化 Gill histopathology changes of 1.09 mmol/L group within 48 h；E.0.72 mmol/L試驗(yàn)組72 h后鰓的組織病理學(xué)變化 Gill histopathology changes of 0.72 mmol/L group after 72 h；F.1.09 mmol/L濃度試驗(yàn)組72 h后鰓的組織病理學(xué)變化 Gill histopathology changes of 1.09 mmol/L group after 72 h；SL.鰓小片 Secondary gill lamella；REC.呼吸上皮細(xì)胞 Respiratory epithelial cells；PC.柱細(xì)胞 Pillar cell；ERY.紅細(xì)胞 Erythrocyte；LF.鰓小片融合 Fusion of the secondary lamellae；EH.上皮細(xì)胞增生 Epithelial hyperplasia；*.鰓呼吸上皮水腫浮離 Edema of the respiratory epithelium

圖1 鰓的組織病理變化(400×)
Fig.1 Histopathological changes of gill

3 討 論

Ni是一種普遍存在于自然界的微量金屬[24]，Ni也是生物體必需的微量元素[7]，但水環(huán)境中的Ni過量富集在水生生物體內(nèi)會(huì)降低生物體的呼吸作用、離子調(diào)節(jié)和抗氧化能力[11]。Todorova等[19]將鯉魚暴露在Ni2+濃度為 0.003、0.005、0.008 mmol/L的養(yǎng)殖水體中，最初鯉魚表現(xiàn)為躁動(dòng)、跳躍、快速游動(dòng)等活動(dòng)狀況，在48 h后躁動(dòng)的魚體出現(xiàn)游動(dòng)緩慢的現(xiàn)象，這些癥狀與本次急性毒性試驗(yàn)的臨床癥狀相似。Chaudhry[25]研究發(fā)現(xiàn)條紋密鱸Colisafasciatus暴露在含有Ni2+的水環(huán)境中，其肝糖原和肌糖原儲(chǔ)存降低，血糖升高，但由于Ni2+對(duì)條紋密鱸的鰓造成了急性損傷，機(jī)體缺氧應(yīng)激，使條紋密鱸在試驗(yàn)24 h后血乳酸水平急劇升高，導(dǎo)致機(jī)體供能不足。本研究發(fā)現(xiàn)Ni2+也導(dǎo)致鯉魚鰓急性損傷，導(dǎo)致鯉魚缺氧應(yīng)激。因此，本研究中48 h后由于機(jī)體缺氧、供能不足使鯉魚游泳緩慢、反應(yīng)呆滯，鯉魚的鰓蓋活動(dòng)加快，瀕死鯉魚的體表和鰓覆蓋大量黏液。Ni2+可以和魚體表黏液結(jié)合形成蛋白復(fù)合物，吸附在鰓和體表上，阻礙鰓和體表與水環(huán)境進(jìn)行氧氣交換，導(dǎo)致魚體缺氧[26]，因此，鯉魚通過加快鰓蓋活動(dòng)從而增加鰓絲與水環(huán)境中氧氣交換的頻率。

A.對(duì)照組肝臟組織結(jié)構(gòu) Liver tissue structure of the control group；B.1.25 mmol/L試驗(yàn)組肝臟組織病理學(xué)變化 Liver histopathology changes of 1.25 mmol/L group；C.0.72 mmol/L試驗(yàn)組48 h內(nèi)肝臟組織病理學(xué)變化 Liver histopathology changes of 0.72 mmol/L group within 48 h；D.1.09 mmol/L試驗(yàn)組48 h內(nèi)鰓肝臟組織病理學(xué)變化 Liver histopathology changes of 1.09 mmol/L group with in 48 h；E.0.72 mmol/L試驗(yàn)組72 h后肝臟組織病理學(xué)變化 Liver histopathology changes of 0.72 mmol/L group after 72h；F.1.09 mmol/L試驗(yàn)組72 h后肝臟組織病理學(xué)變化 Liver histopathology changes of 1.09 mmol/L group after 72 h；PN.細(xì)胞核固縮 Pyknosis； BC.淤血 Blood congestion； VAC.空泡變性 Vacuolation； NEC.壞死 Necrosis；*.空泡融合 Vacuolar fusion

圖2 肝組織病理學(xué)變化(400×)
Fig.2 Histopathologicalchanges of liver

鰓是魚類呼吸、氮代謝廢物的排泄器官，也是維持滲透壓、離子穩(wěn)態(tài)的主要部位[17,27]。鰓直接與水環(huán)境接觸，其組織結(jié)構(gòu)易遭到水環(huán)境中污染物的破壞，從而導(dǎo)致離子穩(wěn)態(tài)和滲透壓失衡[28]。本研究發(fā)現(xiàn)中低濃度試驗(yàn)組(0.72～1.09 mmol/L)鯉魚的鰓小片呼吸上皮水腫浮離、細(xì)胞增生，鰓小片融合，當(dāng)虹鱒[15]、鰱[16]和尼羅羅非魚[17]暴露于含有Ni2+的水環(huán)境中也觀察到相似的鰓組織損傷。已有研究報(bào)道鰓小片呼吸上皮浮離、細(xì)胞增生是魚類對(duì)水中污染物的適應(yīng)性反應(yīng)，這些組織變化增加水環(huán)境污染物與鰓組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)之間的擴(kuò)散距離，在不破壞鰓的正常生理功能的情況下，阻擋污染物進(jìn)入鰓內(nèi)部，防止污染物對(duì)鰓造成損傷[29]。但鰓呼吸上皮細(xì)胞過度水腫、增生會(huì)導(dǎo)致鰓小片融合，阻礙血液與水環(huán)境的氧氣交換，導(dǎo)致機(jī)體供氧不足，甚至導(dǎo)致魚體窒息死亡。本研究結(jié)果表明，高濃度試驗(yàn)組(1.25 mmol/L)鯉魚的鰓急性損傷主要表現(xiàn)為鰓小片呼吸上皮細(xì)胞壞死、脫落，毛細(xì)血管壁破裂，高濃度的Cu2+會(huì)導(dǎo)致斑馬魚Daniorerio鰓出現(xiàn)相似的急性損傷[30]。高濃度的水環(huán)境污染物導(dǎo)致鰓小片呼吸上皮細(xì)胞壞死、脫落，嚴(yán)重影響鰓的正常生理功能，使血液與水環(huán)境的氧氣交換受阻。Ni2+進(jìn)入鰓小片呼吸上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管壁細(xì)胞后，誘導(dǎo)胞內(nèi)活性氧自由基(ROS)增加，使細(xì)胞氧化應(yīng)激，影響細(xì)胞的正常生理功能，誘導(dǎo)細(xì)胞壞死。并且ROS導(dǎo)致細(xì)胞膜磷脂過氧化，使細(xì)胞膜的功能和結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而導(dǎo)致毛細(xì)血管壁細(xì)胞破裂，紅細(xì)胞外流[31]。并且鰓在維持魚體離子平衡、滲透壓平衡上起著至關(guān)重要的作用，但有研究證明魚類暴露在重金屬污染的水環(huán)境中，鰓內(nèi)的Na+/k+-ATP酶的活性受到抑制，導(dǎo)致離子穩(wěn)態(tài)失衡，引起滲透壓改變[17]，進(jìn)一步加快了細(xì)胞破裂的速度。

肝臟是各種新陳代謝途徑的重要器官，肝臟是糖原合成與分解的主要器官，脂質(zhì)沉積的潛在場(chǎng)所，也是體內(nèi)重金屬解毒的主要器官[32-33]。本研究發(fā)現(xiàn)鯉魚暴露在中低濃度(0.72～ 1.09 mmol/L)Ni2+污染的水環(huán)境中，其肝臟的組織結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，Das等[34]用2.0 mg/100 g的NiSO4每隔1 d對(duì)鼠進(jìn)行口服給藥，給藥10次后觀察到鼠肝臟的正常結(jié)構(gòu)遭到破壞，細(xì)胞出現(xiàn)空泡化，這與本研究觀察到的結(jié)果相似。同樣的，Jayaseelan等[35]分別用0.002、0.17和0.17 mmol/L鎳納米顆粒對(duì)莫桑比克羅非魚Oreochromismossambicus進(jìn)行為期14 d的處理，也觀察到莫桑比克羅非魚出現(xiàn)本研究中鯉魚相似的肝臟組織病理學(xué)變化：肝細(xì)胞界限模糊，肝細(xì)胞壞死，胞漿空泡化，細(xì)胞核固縮。據(jù)研究報(bào)道，Ni2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的活性氧自由基(ROS)增加，細(xì)胞內(nèi)的ROS可以誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致細(xì)胞生物膜系統(tǒng)的功能和結(jié)構(gòu)遭到破壞[31,36]，因此，本研究中觀察到鯉魚肝細(xì)胞界限模糊。同時(shí)，Ni2+和ROS與DNA和組蛋白相互作用，導(dǎo)致DNA損傷，并且Ni2+會(huì)導(dǎo)致DNA修復(fù)酶的活性降低，使受損的DNA不能及時(shí)修復(fù)[31]，使肝細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核固縮的現(xiàn)象。據(jù)報(bào)道Hg2+會(huì)導(dǎo)致劍尾魚(Xiphophorushelleri)肝細(xì)胞線粒體腫脹和空泡增加，從而使肝細(xì)胞表現(xiàn)為空泡化[37]。本研究觀察到的鯉魚肝細(xì)胞空泡化可能也是由于Ni2+使鯉魚肝細(xì)胞線粒體腫脹和空泡增加導(dǎo)致，這還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，本研究中高濃度試驗(yàn)組(1.25 mmol/L)的鯉魚在24 h內(nèi)全部急性死亡。通過組織病理變化觀察發(fā)現(xiàn)，鯉魚在急性死亡的情況下其肝細(xì)胞損傷表現(xiàn)為細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整、細(xì)胞核固縮，這些病理變化與細(xì)胞凋亡的細(xì)胞形態(tài)相似，并且Liu等[38]研究證明Ni可以通過PI3K-Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，關(guān)于Ni2+是否會(huì)導(dǎo)致鯉魚肝臟細(xì)胞的凋亡有待進(jìn)一步研究。