不同菜心品種萌發期和苗期耐熱性分析及其鑒定指標篩選

龐強強，周 曼，孫曉東，陳貽誦，蔡興來

(海南省農業科學院 蔬菜研究所/海南省蔬菜生物學重點實驗室，海口 571100)

菜心(BrassicacampestrisL. spp.chinensisvar.utilisTsen et Lee)，又名菜薹，為十字花科蕓薹屬蕓薹種白菜亞種的一個變種，以花薹為主要食用器官，是中國華南地區的特產蔬菜之一[1]。菜心喜溫，其生長適宜溫度為15～25 ℃，30 ℃以上高溫植株生長就會受到阻礙[2]，導致菜薹葉片纖細，品質下降，甚至死亡。海南島地處熱帶北緣，屬熱帶季風氣候，素來有“天然大溫室”的美稱。隨著全球氣候變暖，海南島高溫日數也呈現出明顯增多的態勢[3]，高溫已成為農業生產中面臨的主要問題之一。通過篩選、培育耐熱菜心品種是解決上述問題的必由之路，而合理選擇耐熱性鑒定指標是進行耐熱育種、耐熱機理及高溫調控緩解機制研究的基礎。

作物耐熱性鑒定及耐熱指標篩選需要將不同指標相結合，對各個時期進行綜合評價，以篩選出簡單有效的耐熱性鑒定指標和適宜的綜合評價方法[4]。種子萌發期和苗期是植物生長發育過程中的重要時期但又是最脆弱的時期[5]。多年來，國內外學者在作物萌發期和苗期耐熱性鑒定及耐熱指標篩選方面開展了大量研究工作，同時提出了不同作物在不同條件下的鑒定指標和評價體系[6-7]。在菜心耐熱適應機制研究上，研究者發現高溫會導致菜心種子發芽勢、發芽力及發芽指數降低[8]，幼苗葉片內甜菜堿、可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量及抗氧化酶活性顯著升高[1,9]；郭培國等[10]采用抑制差減雜交(SSH) 技術，構建了一個高溫脅迫下在耐熱品種中特異表達的SSH cDNA 基因文庫，BLAST 分析發現99條ESTs代表81個基因可能與菜心的耐熱性相關。在菜心耐熱性指標篩選研究方面，李光光等[11]通過隸屬函數法得到高溫塑料棚采收期的菜心株高、薹葉數、單株生物總質量可用來評價菜心的耐熱性，并將6個菜心材料分為3類。李榮華等[12]認為生物量和薹質量可作為評價菜心耐熱性強弱的關鍵農藝性狀指標。綜合前人研究結果來看，當前的研究主要集中在高溫脅迫對菜心的農藝性狀指標和生理生態響應方面，而關于菜心萌發期和苗期耐熱性鑒定及其耐熱指標篩選的研究并不常見，至今還未建立一套高效的菜心耐熱性鑒定體系和評價標準。本研究采用模擬高溫脅迫法，通過對菜心不同品種萌發期種子發芽指標和苗期生長及生理指標進行測定，以各單項指標的耐熱系數為衡量單項耐熱能力的指標，采用主成分分析法、隸屬函數法、聚類分析、關聯度分析、逐步回歸分析法對菜心耐熱性進行鑒定和綜合評價，從而篩選出耐熱性強的菜心材料及易測定的與菜心種質耐熱性密切相關的指標，以期為菜心耐熱種質的發掘及新品種選育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試菜心品種20份(表1)，試驗在海南省農業科學院蔬菜研究所永發試驗基地和海南省蔬菜學重點實驗室進行。

表1 參試菜心品種名稱及編號Table 1 Name and number of Chinese flowering cabbage cultivars in test

1.2 試驗設計

1.2.1 模擬高溫脅迫試驗 以珍珠巖為基質進行穴盤育苗，常規栽培管理。當幼苗長至三葉一心時移至25 ℃/18 ℃(晝/夜)，12 h/12 h(晝/夜)，光照覆蓋率80%，相對濕度90%的光照培養箱中預培養3 d，之后進行高溫處理。為明確不同基因型菜心萌發期和苗期高溫脅迫耐性的適宜篩選溫度，進行預備試驗，得出37 ℃/27 ℃能較好地反映不同品種耐熱性的差異。因此，選取37 ℃/27 ℃作為高溫脅迫處理溫度。以 25 ℃/18 ℃條件下正常生長的幼苗為對照，每個處理重復3次。

1.2.2 種子發芽試驗 20個菜心品種分別選取100粒優質、飽滿的種子，去離子水中浸泡2 h后，在潔凈、烘干的培養皿中均勻擺入已干燥的種子，蓋上培養皿，分別放入不同溫度的培養箱中，讓其在黑暗中發芽，保持濾紙濕潤，每個品種均設3次重復。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 發芽試驗測定項目和方法 以胚根的長度超過種子半徑視為發芽，第7天統計發芽勢，第14天統計發芽率，具體計算公式如下：

發芽率(GR)=發芽終期全部正常發芽種子數/供試種子數×100%

(1)

發芽勢(GP)=發芽初期正常發芽的種子數/供試種子數×100%

(2)

活力指數(VI)=發芽指數GI×幼苗生長 勢S

(3)

發芽指數(GI)=∑(Gt/Dt)

(4)

式中，Gt為在t日的發芽數，Dt為其相應的發芽日數。

1.4 數據分析與評價方法

按照公式計算植株耐熱系數(γ)。

γ= 處理組測定值/對照組測定值

(5)

按照公式計算綜合指標隸屬函數值 [u(Xi)]。

u(Xi)=(Xi-Xmin) /(Xmax-Xmin)i=1，2，3，…n

(6)

式中，u(Xi)表示第i個綜合指標的隸屬函數值；Xi表示第i個綜合指標值；Xmin、Xmax分別表示綜合指標的最小值和最大值。

(7)

式中，Wi表示第i個綜合指標在所有綜合指標中重要程度；Pi表示第i個綜合指標的貢獻率。

(8)

式中，D表示不同品種在高溫脅迫下綜合指標評價所得的綜合耐熱性評價值。

采用Microsoft Excel 2003對數據進行統計，利用SPSS 22.0進行方差和顯著性檢測，單因素分析采用Duncan’s法。采用皮爾遜相關系數對各單項指標進行相關性分析，用主成分分析法進行主因子分析，采用組間連接距離聚類法對各品種進行聚類分析，采用灰色關聯度分析法分析各單項指標的耐熱系數與參考序列的關聯度，采用逐步回歸分析法建立最優回歸方程。

2 結果與分析

2.1 不同菜心品種各單項指標的耐熱系數和相關性分析

對初級指標耐熱系數進行相關性分析發現，多數生理指標間存在不同程度的相關性(表3)，其中有的指標間存在顯著的相關性，如活力指數與地上部鮮質量(r=0.297，P<0.05)，可認為活力指數與地上部鮮質量提供的共同信息量為 29.7%。而有的指標間存在極顯著的相關性，如發芽率與活力指數之間相關性顯著(r= 0.721，P<0.01 )，可認為發芽率與活力指數提供的共同信息量為72.1%；發芽率與發芽勢之間相關性顯著(r=0.621，P<0.01)，可認為相發芽率與發芽勢提供的共同信息量為62.1%，其余具有相關性的評價指標間也存在著不同的信息重疊。因此，用某一個鑒定指標來評價不同菜心品種的耐熱性難以得到客觀的結果。為了彌補用單一指標來評價耐熱性的不足，在此基礎上需進一步發掘能充分反映其在高溫脅迫條件下的耐熱性指標。

表2 不同菜心品種各單項指標的耐熱系數變異分析Table 2 Variation analysis of heat resistance coefficient of every individual indicator in different Chinese flowering cabbage cultivars

2.2 不同菜心品種各鑒定指標的主成分分析

利用主成分分析法將21個單項指標換算成3個相互獨立的綜合指標，分別用主成分1、主成分2和主成分3表示(表4)，其貢獻率分別為 66.30%、8.22%和6.36%，累計貢獻率達到 80.88%，說明這3個綜合指標已經包含菜心耐熱性的大部分信息。根據主成分分析原則，同一指標的特征向量的最大絕對值所在的主成分即為其所屬主成分。各綜合指標對應的特征向量為：第1主成分(主成分1)z1=0.775GR+0.777GI+ 0.441VI+0.724GP+0.977FAW+0.911 FUW+0.890DAW+0.879DUW-0.911HDI+ 0.876Chl+0.758RA+0.169RSA-0.838SAR- 0.805HP-0.939RC-0.819MDA+0.881SS+0.933Pro+0.907SOD+0.562CAT+ 0.874POD，其中在地上部鮮質量、相對電導率、脯氨酸質量分數有較高的載荷量；第2主成分(主成分2)z2=0.564GR +0.563GI+0.752VI+ 0.372GP-0.148FAW-0.190FUW- 0.230 DAW-0.134DUW+0.022HDI-0.153Chl- 0.077RA+0.058RSA+0.018SAR+0.138HP+0.128RC+0.247MDA+0.144SS-0.207Pro+0.002SOD-0.255CAT+0.028POD，其中在活力指數、發芽率上均有較高的載荷量；第3主成分(主成分3)z3=-0.021GR-0.020GI-0.178VI+0.037GP-0.011FAW-0.029FUW- 0.285DAW+0.334DUW+ 0.227HDI- 0.170Chl+0.261RA+0.949RSA-0.086SAR-0.035HP+0.093RC+0.117MDA+0.154SS+0.004Pro-0.028SOD+0.027 CAT+0.035 POD，其中在根冠比上有較高的載荷量。

表3 不同菜心品種各單項指標的相關系數矩陣Table 3 Correlation matrix of every individual indicator in different Chinese flowering cabbage cultivars

注： * 和**分別表示P<0.05 和P<0.01 的顯著水平。

Note: * and ** significant level atP<0.05 andP<0.01．

表4 各綜合指標的系數及貢獻率Table 4 Coefficients and proportion of comprehensive indicators

2.3 不同菜心品種耐熱性綜合評價

2.3.1 隸屬函數分析 為進一步明確3個綜合指標對菜心高溫脅迫耐受性的貢獻率，采用隸屬函數分析法進行菜心耐熱性綜合評價(表5)。首先對20個品種的耐熱系數進行標準化，再按公式(6)計算20個品種在3個綜合指標中的隸屬函數值。同一綜合指標下，隸屬函數值越大，表明菜心品種在這一綜合指標上的耐熱性越強，反之則越弱。由表5可知，不同菜心品種的所有綜合指標的隸屬函數值不盡相同。對于同一綜合指標z1而言，品種C3的u(X1)值最大為1，說明C3菜心品種在z1這一綜合指標上表現出的耐熱性最強，而C15的u(X1)值最小為0，說明C15菜心品種在z1這一綜合指標上表現出的耐熱性最弱。對于同一綜合指標z2而言，C14的u(X2)值最大為1，說明C14菜心品種在z2這一綜合指標上表現出的耐高溫性最強，而C17的u(X2)值最小為0，說明C17菜心品種在z2這一綜合指標上表現出的耐高溫性最弱。對于同一綜合指標z3而言，C15的u(X3)值最大為1，說明C15菜心品種在z3這一綜合指標上表現出的耐高溫性最強，而C5的u(X3)值最小為0，說明C5菜心品種在z3這一綜合指標上表現出的耐高溫性最弱。

2.3.2 各綜合指標權重和綜合評價 通過公式(7)計算各綜合指標在主成分貢獻率中的權重，從而得出3個綜合指標權重分別為0.820、0.102、0.079。根據隸屬函數值和權重的計算結果，用公式(8)來量化每一品種的綜合耐熱性能的強弱。本研究中，D值為各品種耐熱性的綜合評價值，D值越大，表明材料的綜合耐熱性越強。由表5可知，通過對各品種的D值進行排序得出，不同菜心材料耐熱性強弱順序為C12>C9>C10>C3>C17>C4>C14>C8>C11>C19>C1>C5>C15>C18>C2>C6>C20>C13>C16>C7。

2.3.3 耐熱性聚類分析 采用組間連接距離聚類法對20個菜心品種的D值進行耐熱性聚類分析，建立聚類樹狀圖。由圖1可知，可將20個菜心品種分為3類，即第Ⅰ類對高溫的耐受性較強，包括品種C3、C17、C4、C9、C10和C12；第Ⅱ類對高溫耐受性較差，包括品種C13、C16、C7和C20；第Ⅲ類對高溫的耐受性一般，包括品種C11、C19、C8、C14、C2、C6、C5、C15、C18和C1。

表5 不同菜心品種的耐熱綜合指標值、權重、隸屬函數值、D值及綜合評價Table 5 Comprehensive indicator values,index weight,membership function values,D values and comprehensive evaluation of heat tolerance in different Chinese flowering cabbage cultivars

2.3.5 逐步回歸分析 為分析21個單項指標與不同菜心品種之間的耐熱性關系，篩選能夠客觀鑒定菜心耐熱性的指標，建立可用于菜心萌發期和苗期耐熱性評價的數學模型，將耐熱性綜合評價值(D值)作為因變量，把各單項指標的耐熱系數作為自變量進行逐步回歸分析，建立最優回歸方程：D=-0.767+0.861HDI+0.551POD+ 0.373MDA+ 0.018SS+0.112GP-0.014HP，該方程決定系數R2=0.995，F=401.96，顯著性水平P= 0.000 1，統計量為2.41。由方程可知，21個單項指標中有6個指標對菜心耐熱性有顯著影響，分別是熱害指數、POD活性、MDA質量摩爾濃度、可溶性糖質量分數、發芽勢、H2O2質量分數。因此，在實際應用中，可有選擇性地測定與D值密切相關的指標并求得耐熱系數，進而利用該方程預測其他菜心品種的耐熱性，從而使鑒定工作簡化。

表6 不同菜心品種各單項指標的灰色關聯度分析Table 6 Grey relational degree analysis of every individual indicators in different Chinese cabbage varieties

圖1 不同菜心品種耐熱性聚類圖Fig.1 Dendrogram of clusters in different cultivars of Chinese flowering cabbage

3 討 論

植物耐熱性是由多基因控制的復雜性狀[21-22]，不同指標對耐熱性的反映并不一致，如果僅用單一的指標很難全面準確地反映各品種的耐熱性強弱，得出結果可能具有較大偏差；而多項指標之間又存在一定的相關性，容易發生信息重疊與交叉[6,23]，本研究結果也證實這一觀點。近年來，國內外學者針對不同作物類型，提出采用多個指標、多種方法相結合的方式對作物進行抗性鑒定，能更加全面地反映出耐逆性強弱，同時也篩選出多種與植物耐逆性相關的生長和生理生化指標[23-25]。本研究選用較為直觀、便捷的21個指標進行測定，并將計算出的各指標耐熱系數作為評價菜心單項耐熱能力大小指標，以此來消除不同基因型菜心間固有的生物學和遺傳學特性差異。然后采用主成分分析將21個指標的耐熱系數轉換為3個獨立的綜合指標，通過隸屬函數分析法得出各菜心品種綜合耐熱能力(D值)，同時結合聚類分析結果，較為客觀地將20個參試品種劃分為耐熱型、中等耐熱型和不耐熱型 3個不同耐熱等級。最后通過回歸分析，得出快速鑒別并預測菜心耐熱能力的最優回歸方程D= -0.767 + 0.861 HDI +0.551 POD + 0.373 MDA + 0.018 SS+ 0.112 GP - 0.014 HP，篩選出6個對菜心耐熱能力具有顯著影響的指標，即熱害指數、POD活性、MDA質量摩爾濃度、可溶性糖質量分數、發芽勢及H2O2質量分數，這與灰色關聯度分析所顯示的各指標重要程度的結果也基本一致。作物耐熱性鑒定的最終結果是要劃分供試種質的耐熱等級，以此來判定其耐熱能力。因此，在相同的高溫脅迫條件下，可通過測定這6個鑒定指標，并利用回歸方程來預測候選品種的耐熱性強弱，該方法已在燕麥[26]、棉花[27]和花生[28]等作物的抗逆性鑒定中得到了應用。

綜上所述，本試驗將參試的20個菜心品種分成耐熱型( 6個) 、中等耐熱型( 10個)和不耐熱型(4個) 3種類型。熱害指數、POD活性、MDA質量摩爾濃度、可溶性糖質量分數、發芽勢及H2O2質量分數可以作為菜心耐熱性鑒定指標。