腦心肌炎病毒感染Hela細胞的內吞途徑

劉 楊，許淑娟，李瓊毅，劉翊忠

(1.西北民族大學 生物醫學研究中心，蘭州 730030；2.西北民族大學 生命科學與工程學院，蘭州 730030)

腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus，EMCV)是一種重要的人畜共患病病原[1]。該病毒于1945年從美國佛羅里達州一只患急性致死性心肌炎的黑猩猩體內首次被發現并分離得到，1985 年確診為豬的致死性病原之一。隨后，多個國家報道有該病的爆發和流行。中國于2005年首次從病死仔豬和流產胎兒中分離到EMCV[2]。EMCV感染的臨床癥狀表現為腦炎、心肌炎或心肌周圍炎[3]。豬是EMCV的自然宿主[4-5]，感染后可導致豬突然死亡和實質器官的病理性損傷，母豬感染后還可造成繁殖障礙，給世界養豬業造成重大的經濟損失[6]。該病目前尚無有效的治療措施，只能從消滅傳染源和切斷傳播途徑方面著手，如撲殺帶毒老鼠和帶毒豬只等。該病毒可通過多種途徑感染動物和人類，但具體的感染機制目前尚不完全清楚[7]。

內吞作用(Endocytosis)是細胞外物質通過質膜的變形運動進入細胞內的過程，也是病毒感染細胞的常見感染途徑，在病毒感染宿主細胞的早期發揮作用。有報道稱細胞內吞可分為兩種類型，一是經典的網格蛋白(Clathrin)參與的內吞，二是非網格蛋白參與的內吞，而非網格蛋白參與的內吞主要包括吞噬作用(Phagocytosis)、小窩蛋白(Caveolin)參與的內吞途徑和巨胞飲途徑(Macropinocytosis)等[8]。吞噬途徑是指高等動物的吞噬細胞攝取和消滅細菌、病毒以及損傷細胞的過程；此途徑中，質膜凹陷或形成偽足將入侵物質包裹并攝入細胞，偽足的伸出主要是由肌動蛋白(Actin)參與的[9]。有研究表明，肌動蛋白參與非吞噬細胞的內吞途徑，主要在病毒感染細胞的早期發揮核心作用，抑制肌動蛋白可降低多種病毒對細胞的感染，如犬冠狀病毒、人冠狀病毒和小反芻獸疫病毒等[10-12]。

為了探究EMCV是否通過內吞途徑以及通過哪種內吞途徑感染細胞，本研究先使用內吞途徑抑制劑作用于Hela細胞，然后用EMCV感染處理的細胞。若病毒感染受到抑制，則使用網格蛋白、巨胞飲途徑、肌動蛋白的特異性抑制劑作用于Hela細胞，然后檢測病毒感染是否受到影響，以此判斷EMCV感染Hela細胞具體通過哪種內吞途徑發揮作用，以期為臨床上防治EMCV及其他經由內吞途徑感染宿主細胞的病毒提供思路。再者，隨著EMCV感染宿主細胞機制的研究不斷深入，有望從抑制內吞途徑的主要功能蛋白方面入手，為預防和治療人與動物的腦心肌炎提供更好的策略。

1 材料與方法

1.1 細胞及毒株

人宮頸癌細胞(Hela)、倉鼠腎細胞(BHK-21)、腦心肌炎病毒(EMCV)由西北民族大學生物醫學研究中心提供。

1.2 主要儀器與試劑

PCR儀購自Biometra公司；酶標儀購自Thermo Fisher公司；生物熒光倒置顯微鏡購自Olympns公司；Proliferation細胞活力檢測試劑盒購自Gromega公司；PVDF膜購自伯樂生命醫學產品公司；ECL顯色試劑盒購自PerkinElmer公司；鼠抗VP1 抗體由南京農業大學動物醫學院白娟副教授惠贈，兔抗Actin抗體購自Abcam公司，紅色熒光標記的山羊抗兔IgG二抗、綠色熒光標記的山羊抗鼠IgG二抗購自Jackson Immuno Research公司；DAPI購自Sigma公司；胎牛血清、DMEM培養基購自蘭州民海生物工程有限公司；DMSO、Wortmannin購自北京索萊寶科技有限公司；Bafilomycin A1、Chlorpromazine、Pitstop、1,1′-Dithiobis-2-naphthalenol(IPA-3)、Cytochalasin D、Jasplakinolide購自Abcam公司；NH4Cl購自Sigma公司。

1.3 特異性抑制劑濃度篩選

按照抑制劑說明書，用DMSO或PBS將抑制劑配制成含胎牛血清的不同濃度工作液[12]。試驗前24 h將處于對數生長期的Hela細胞接種于96孔細胞培養板中，待細胞融合度達80%時分別加入不同濃度的抑制劑工作液，37 ℃恒溫培養箱中孵育24 h。24 h后按照Proliferation細胞活力檢測試劑盒說明書進行細胞活力檢測，試驗重復3次，篩選不影響細胞活力的適合抑制劑濃度。

1.4 EMCV感染Hela細胞的內吞途徑檢測

將對數生長期的Hela細胞接種于6孔細胞培養板，待細胞融合度達80%～90%時，使用適合濃度的內吞途徑特異性抑制劑NH4Cl和Bafilomycin A1工作液作用于Hela細胞1 h，然后用EMCV感染處理的細胞，接毒時病毒與細胞數量之比為0.1∶1(MOI=0.1)，病毒體積=細胞數×0.1/0.7×TCID50[13]，接毒1 h后棄去病毒液，換成含NH4Cl和Bafilomycin A1的細胞維持液，于感染后24 h收集細胞和上清，檢測病毒結構蛋白VP1含量、病毒滴度和病毒拷貝數[13]。

1.5 網格蛋白參與的內吞途徑檢測

參照“1.4”的方法，使用適合濃度的網格蛋白參與的內吞途徑特異性抑制劑Chlorpromazine和Pitstop作用于Hela細胞后接毒，于感染后 24 h收集上清，檢測病毒滴度和病毒拷貝數。

1.6 巨胞飲途徑檢測

參照“1.4”的方法，使用適合濃度的巨胞飲途徑特異性抑制劑IPA-3和Wortmannin作用于Hela細胞后接毒，于感染后24 h收集上清，檢測病毒滴度和病毒拷貝數。

1.7 肌動蛋白參與的內吞途徑檢測

1.7.1 病毒蛋白、病毒滴度和病毒拷貝數檢測 參照“1.4”的方法，使用適合濃度的肌動蛋白特異性抑制劑Cytochalasin D和Jasplakinolide作用于Hela細胞后接毒，于感染后0 h、6 h、12 h、 18 h、24 h時收集上清，于24 h時收集細胞；取 24 h時收集到的細胞和上清檢測病毒結構蛋白VP1含量、病毒滴度和病毒拷貝數，并檢測0 h、 6 h、 12 h、18 h、24 h時上清的病毒滴度，繪制病毒生長曲線。

1.7.2 肌動蛋白與EMCV VP1定位檢測 試驗前24 h，將處于對數生長期的Hela細胞接種于24孔細胞培養板中的爬片上，待細胞融合度達到50%～60%時，接種EMCV，接毒量為0.1 MOI，接毒90 min后棄去病毒液，用1×PBS洗細胞2次，每次5 min，棄去PBS，向每孔加入體積分數為70%的乙醇，置于4 ℃過夜。第二日取出24孔細胞培養板，棄去乙醇，用1×PBS洗2次，棄去PBS，加入鼠源VP1(1∶200稀釋)一抗，37 ℃孵育1 h后棄去一抗，用PBS洗細胞4次，每次5 min，棄去PBS；再加入綠色熒光標記的山羊抗鼠IgG二抗(1∶200稀釋)，37 ℃孵育1 h，棄去二抗，PBS潤洗4次，每次5 min，棄去PBS。然后加入兔源Actin(1∶200稀釋)一抗，37 ℃孵育1 h后棄去一抗，PBS洗細胞4次，每次5 min，棄去PBS；再加入紅色熒光標記的山羊抗兔IgG二抗(1∶200稀釋)，37 ℃孵育1 h，棄去二抗，PBS潤洗4次，每次5 min；然后加入細胞核染料DAPI，孵育10 min，純水洗細胞10 min；然后取出爬片，倒扣于載玻片上，用熒光封固劑固定，靜置10 min后觀察。

1.8 肌動蛋白參與吸附和侵入過程的檢測

試驗開始前24 h將Hela細胞接種于6孔細胞培養板中，待細胞融合度達90%時，使用適合濃度的肌動蛋白特異性抑制劑Cytochalasin D工作液作用于Hela細胞1 h，然后接種EMCV；吸附試驗接毒時病毒與細胞數量之比為3∶1(MOI=3)，病毒體積=細胞數× 3 /0.7 × TCID50[13]，侵入試驗接毒時病毒與細胞數量之比為2∶1(MOI=2)；然后將吸附試驗的接毒細胞培養板置于4 ℃孵育1 h，侵入試驗的接毒細胞培養板置于37 ℃孵育1 h；然后取出吸附試驗和侵入試驗的細胞培養板，棄去其中的病毒液，用無血清DMEM洗細胞 4 次，收集第 4 次洗滌用的無血清DMEM作為背景組病毒；再向其中加入2 mL的無血清DMEM，然后置于-80 ℃超低溫冰箱中反復凍融3次，收集孔中的病毒液和細胞碎片，4 ℃、500 r/min離心10 min，吸取上清即為試驗組病毒。將收集到的背景組病毒和試驗組病毒接種于BHK-21細胞，并分別測定其滴度和拷貝數，試驗組與背景組的病毒滴度和病毒拷貝數之差即為最終的病毒滴度和病毒拷貝數。

2 結果與分析

2.1 特異性抑制劑濃度篩選

用不同濃度的抑制劑作用于Hela細胞，24 h后檢測細胞活力，未加抑制劑的細胞活力為對照，篩選不影響細胞活力的8種抑制劑的適宜工作濃度。結果如圖1所示：內吞途徑抑制劑NH4Cl(20 mmol/L和40 mmol/L)、Bafilomycin A1(10 nmol/L和20 nmol/L)，網格蛋白抑制劑Chlorpromazine(5 μmol/L和10 μmol/L)、Pitstop(5 μmol/L和10 μmol/L)，巨胞飲途徑抑制劑IPA-3(10 μmol/L和20 μmol/L)、Wortmannin(2.5 μmol/L和5 μmol/L)，肌動蛋白抑制劑Cytochalasin D(5 μmol/L和10 μmol/L)、Jasplakinolide(1 μmol/L和2 μmol/L)。

*.差異顯著(P<0.05) Significant diffences(P<0.05); **，*** 差異極顯著(P<0.01，P<0.001) Extremely significant diffences(P<0.01,P<0.001);下同 The same below

圖1 抑制劑濃度篩選
Fig.1 Screening of inhibitor concentration

2.2 EMCV感染Hela細胞內吞途徑檢測

用適宜濃度的內吞途徑抑制劑NH4Cl和Bafilomycin A1分別作用于Hela細胞后接毒，收集感染后24 h的上清檢測病毒滴度和病毒拷貝數，收集細胞檢測VP1含量，以未加抑制劑的細胞接毒作為對照組。如圖 2所示，經20 mmol/L NH4Cl作用后，VP1相對蛋白含量和病毒滴度下降不顯著(P>0.05)，但病毒拷貝數顯著降低 (P<0.05)；經40 mmol/L NH4Cl作用后，VP1相對蛋白含量、病毒滴度和病毒拷貝數顯著下降(P<0.01，P<0.001)。經10 nmol/L Bafilomycin A1作用后，VP1相對蛋白含量、病毒滴度和病毒拷貝數均顯著下降(P<0.05，P<0.01)；經20 nmol/L Bafilomycin A1作用后，VP1相對蛋白含量、病毒滴度和病毒拷貝數下降更加明顯(P<0.001)。從總體趨勢來看，內吞途徑抑制劑NH4Cl和Bafilomycin A1可以抑制EMCV感染Hela細胞。

圖2 內吞途徑抑制劑作用于Hela細胞對EMCV感染細胞的影響Fig.2 The impact of EMCV infect Hela cells dealt with endocytic pathway inhibitor

2.3 EMCV感染Hela細胞網格蛋白依賴型內吞途徑檢測

使用適合濃度網格蛋白內吞途徑抑制劑Chlorpromazine和Pitstop作用于Hela細胞后EMCV攻毒，收集感染后24 h的上清檢測病毒滴度和病毒拷貝數。如圖3所示，經過Chlorpromazine和Pitstop作用，病毒滴度和病毒拷貝數下降不顯著(P>0.05)，提示網格蛋白內吞途徑抑制劑Chlorpromazine和Pitstop不影響EMCV感染Hela細胞。

2.4 EMCV感染Hela細胞巨胞飲途徑檢測

使用適合濃度巨胞飲途徑抑制劑IPA-3和Wortmannin作用于Hela細胞后接種EMCV，收集上清檢測病毒滴度和病毒拷貝數。如圖4所示，經過IPA-3和Wortmannin作用后病毒滴度和病毒拷貝數下降不顯著(P>0.05)，提示巨胞飲途徑抑制劑IPA-3和Wortmannin不影響EMCV感染Hela細胞。

圖3 網格蛋白內吞途徑抑制劑作用于Hela細胞對EMCV感染細胞的影響Fig.3 The impact of EMCV infect Hela cells dealt with Clathrin dependent endocytosis pathway inhibitor

圖4 巨胞飲途徑抑制劑作用于Hela細胞對EMCV感染細胞的影響Fig.4 The impact of EMCV infect Hela cells dealt with macropinocytosis inhibitor

2.5 EMCV感染Hela細胞肌動蛋白依賴型內吞途徑檢測

2.5.1 肌動蛋白抑制劑作用于Hela細胞對EMCV感染細胞的影響 用適宜濃度Cytochalasin D和Jasplakinolide分別作用于Hela細胞后接毒，收集感染后24 h的上清檢測病毒滴度和病毒拷貝數，收集細胞檢測VP1相對蛋白含量，未加抑制劑的細胞接毒作為對照組；并檢測經10 μmol/L Cytochalasin D作用后0 h、6 h、12 h、 18 h、24 h上清的病毒滴度，繪制病毒增殖曲線。如圖5所示，經5 μmol/L Cytochalasin D作用后，VP1相對蛋白含量、病毒滴度和病毒拷貝數下降顯著(P<0.05，P<0.01)；經10 μmol/L Cytochalasin D作用后，VP1相對蛋白含量、病毒滴度和病毒拷貝數均下降更明顯(P<0.01、P< 0.001)。從病毒增殖曲線也可以看出，在病毒復制增殖過程中，10 μmol/L Cytochalasin D作用后病毒滴度一直低于對照組。如圖6所示，經 1 μmol/L Jasplakinolide作用后，VP1相對蛋白含量、病毒滴度和病毒拷貝數無顯著下降(P> 0.05)，經2 μmol/L Jasplakinolide作用后病毒滴度和病毒拷貝數下降顯著(P<0.05)。從總體趨勢可以看出，肌動蛋白抑制劑Cytochalasin D和Jasplakinolide都可以抑制EMCV感染Hela 細胞。

圖5 Cytochalasin D作用于Hela細胞對EMCV感染細胞的影響Fig.5 The impact of EMCV infect Hela cells dealt with Cytochalasin D

2.5.2 肌動蛋白與EMCV VP1蛋白定位檢測 用EMCV感染生長狀態良好的Hela細胞90 min，再用免疫熒光法對EMCV的結構蛋白VP1和Actin進行染色，然后于鏡下觀察EMCV VP1和Actin的定位。如圖7所示，病毒粒子呈現明顯綠色，Actin呈現明顯紅色，細胞核呈現藍色；在Merge圖中可以看出EMCV和Actin在核周圍有明顯的橘黃色共定位區域。

2.6 肌動蛋白參與吸附和侵入過程的檢測

選取對EMCV復制增殖影響較大的肌動蛋白抑制劑Cytochalasin D，配制成適宜濃度并作用于Hela細胞，然后接種EMCV，檢測病毒的吸附和侵入。如圖8所示，經Cytochalasin D作用后，病毒滴度和病毒拷貝數無顯著變化(P> 0.05)；如圖9所示，在侵入試驗中，經5 μmol/L Cytochalasin D 作用后，病毒滴度差異不顯著，但病毒拷貝數差異顯著(P<0.05)，經10 μmol/L Cytochalasin D 作用后，病毒滴度和病毒拷貝數都顯著降低(P<0.05，P<0.01)。提示肌動蛋白抑制劑Cytochalasin D對EMCV的吸附過程無影響，但抑制EMCV的侵入。

圖6 Jasplakinolide作用于Hela細胞對EMCV感染細胞的影響Fig.6 The impact of EMCV infect Hela cells dealt with Jasplakinolide

圖7 EMCV VP1與Hela細胞Actin的共定位檢測Fig.7 Co-localization of EMCV VP1 and Actin

3 討 論

EMCV是一種重要的人畜共患病病原，不但可感染多種動物和人類，給世界養豬業造成重大損失，而且還威脅人類健康。肌動蛋白在多種病毒感染宿主細胞的內吞途徑中發揮重要作用，如犬冠狀病毒、人冠狀病毒和小反芻獸疫病毒等[10-12]。因此，研究內吞途徑在EMCV感染宿主細胞中的作用具有一定的科學價值及意義[14]。

圖8 Cytochalasin D作用于Hela細胞對EMCV吸附的影響Fig.8 The impact of EMCV adsorb Hela cells dealt with Cytochalasin D

圖9 Cytochalasin D作用于Hela細胞對EMCV侵入的影響Fig.9 The impact of EMCV penetrate Hela cells dealt with Cytochalasin D

內吞途徑作為病毒感染宿主細胞的途徑，根據主要功能蛋白和進入途徑不同可以分為許多不同類型；本研究應用可抑制所有內吞途徑的抑制劑以及網格蛋白、大胞飲途徑和肌動蛋白的特異性抑制劑來探究EMCV是否依賴于內吞途徑感染Hela細胞，以及具體依賴于哪種內吞途徑感染Hela細胞。首先筆者篩選了各種抑制劑不影響細胞活力的適合工作濃度，為了使試驗數據更具有說服力，也為了減小試驗的偶然誤差，本研究對每種抑制劑選擇兩個適宜濃度作用于細胞后接毒。胞內病毒蛋白、病毒滴度和病毒拷貝數檢測結果提示，內吞途徑抑制劑NH4Cl和Bafilomycin A1可以抑制EMCV感染細胞，說明EMCV可通過內吞途徑進入Hela細胞。然后用不同內吞途徑抑制劑來探究EMCV具體通過哪種內吞途徑進入Hela細胞。由于網格蛋白依賴型內吞途徑是經典的內吞途徑，本研究首先檢驗網格蛋白依賴型內吞途徑。試驗結果顯示，經網格蛋白抑制劑Chlorpromazine和Pitstop作用后EMCV感染未受影響，說明EMCV不通過網格蛋白參與的內吞途徑感染Hela細胞。在非網格蛋白參與的內吞途徑中，本研究檢測了巨胞飲途徑，結果同樣顯示EMCV感染Hela細胞不通過巨胞飲途徑。最后，檢測肌動蛋白是否發揮作用，胞內病毒蛋白、病毒滴度和病毒拷貝數檢測結果提示經過肌動蛋白抑制劑Cytochalasin D和Jasplakinolide作用后病毒感染受到抑制，最終證明EMCV可通過肌動蛋白參與的內吞途徑感染Hela細胞。本研究結果顯示，Cytochalasin D對病毒感染的抑制效果強于Jasplakinolide，針對這一現象筆者查閱相關文獻，發現Cytochalasin D和Jasplakinolide通過相反的機制抑制肌動蛋白，Cytochalasin D可以抑制肌動蛋白聚合；而Jasplakinolide可以抑制微絲解聚，使大部分肌動蛋白以微絲的形式存在；這兩種藥物作用機制不同，對肌動蛋白的抑制程度也不同，而且兩種抑制劑可以作用于細胞的濃度差異也較大，因此對病毒感染的抑制效果也不同，但試驗結果的整體趨勢一致，都可抑制EMCV感染Hela細胞[15-16]。在接毒后90 min時，用免疫熒光法對EMCV結構蛋白VP1和肌動蛋白進行染色，鏡下可見EMCV和肌動蛋白有明顯共定位，同樣提示肌動蛋白參與EMCV感染Hela細胞的過程。內吞途徑與病毒感染宿主細胞的吸附和侵入過程有關，因此，本研究用肌動蛋白抑制效果較好的特異性抑制劑Cytochalasin D探究肌動蛋白是否在病毒的吸附與侵入過程中發揮作用，結果提示肌動蛋白不參與EMCV的吸附過程，但在侵入過程中發揮作用。綜上所述，EMCV可通過肌動蛋白參與的內吞途徑感染Hela細胞。

本研究初步探索了內吞途徑在EMCV感染宿主細胞中的作用，證明EMCV經肌動蛋白參與的內吞途徑感染Hela細胞。這為臨床上防治EMCV及其他經由肌動蛋白參與的內吞途徑感染宿主細胞的病毒提供一個思路。再者，隨著EMCV感染宿主細胞機制的研究不斷深入，有望從抑制肌動蛋白方面入手，為預防和治療人與動物的腦心肌炎提供更好的策略。