表達中國小麥花葉病毒（CWMV）外殼蛋白基因增強煙草對CWMV的抗病性

楊 錦，靳 鵬，劉 芃，羊 健，王 洋，戴良英，陳劍平

（1.湖南農業(yè)大學 植物保護學院，湖南 長沙410000；2.寧波大學 植物病毒研究所，浙江 寧波315000；3.浙江農林大學 農業(yè)與食品科學學院 浙江省農產品品質改良技術研究重點實驗室，浙江 杭州311300）

中國小麥花葉病毒（Chinese wheat mosaic virus，CWMV）是引起小麥Triticum aestivum黃花葉病的重要病原體，嚴重威脅小麥的生產安全[1]。CWMV病毒直徑約為20 nm，長度為80～360 nm[2]，包含2條正義RNA（ssRNA）鏈，根據大小分別命名為RNA1和RNA2。CWMV-RNA1全長7 147 nt，編碼甲基轉移酶、 RNA聚合酶蛋白（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）和運動蛋白（movement protein，MP）等3個完整蛋白質，分子量分別是153、212和37 kDa[3]。CWMV-RNA2全長3 563 nt，編碼病毒外殼蛋白（coat protein，CP）、N-CP蛋白（cystein rich protein，CRP）、CP-RT蛋白和1個富含半胱氨酸蛋白等4個蛋白質，分子量分別是19、25、84及18～19 kDa。CWMV以根部專性寄生的禾谷多黏菌Polymyxa graminis為介體傳播[4-5]。當帶毒的禾谷多黏菌侵染植株后，病毒會在寄主體內不斷復制使植株發(fā)病；未帶毒的禾谷多黏菌通過侵染帶毒植株后獲得病毒，成為新的病源侵染其他植株[6]，且常與小麥黃花葉病毒（wheat yellow mosaic virus，WYMV）復合侵染[7]；由于禾谷多黏菌的休眠孢子具有極強的抗逆性，小麥黃花葉病毒病的防治難度大大增加[6]，患病小麥出現(xiàn)花葉、黃化、分蘗增生等癥狀[2]。國內外大量實踐證明，培育并推廣抗病品種是防治小麥黃花葉病毒病最為經濟有效的措施。目前，小麥抗病毒研究僅得到少量的抗病毒病相關基因，亟需挖掘新的基因資源。利用病毒基因對植物進行遺傳改良是近年來新出現(xiàn)的病害防治方法，原理包括利用病毒外殼蛋白、病毒復制酶、病毒運動蛋白介導的抗性途徑等來增強植物的抗病性，以病毒外殼蛋白介導的抗病性應用最為廣泛[8]。自ABEL等[9]報道獲得攜帶煙草Nicotiana tabacum花葉病毒（tobacco mosaic virus,TMV）的外殼蛋白轉基因植株后，黃瓜Cucumis sativus花葉病毒（cucumber mosaic virus,CMV）[10]、 馬鈴薯 Solanum tuberosum Y 屬病毒（potato virus Y,PVY）[11]、 玉米Zea mays矮花葉病毒（maize dwarf mosaic virus,MDMV）[12]等重組外殼蛋白的轉基因植株相繼出現(xiàn)。該抗病性的機制目前存在3種假說：一是認為轉基因植物細胞中形成的外殼蛋白一定程度上抑制了病毒外殼蛋白的脫殼，二是認為轉基因植株在RNA水平上通過依賴同源序列的酶降解mRNA從而獲得抗性，三是認為當病毒的核酸進入細胞后，立即被細胞中的自由外殼蛋白重新包裹，從而抑制了病毒的侵染[13-16]。此外，有研究表明：病毒外殼蛋白介導的抗性途徑不僅對該種病毒存在抗性，在某些情況下對該病毒的不同菌株以及近緣病毒也存在抗性[13]。本研究擬利用農桿菌介導的轉基因方法將CWMV的外殼蛋白基因導入煙草，獲得陽性轉基因植株后，通過抗病性鑒定證實轉基因煙草對CWMV的抗病性，以期提高寄主植物的抗病性，并為利用病毒基因培育小麥抗病材料奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物表達載體的構建

根據美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）數據庫中CWMV的外殼蛋白基因序列（登錄號：NP_059483.1）設計上游引物CP-F（5′-CGCGGATCCATGGCCGTGAAATCTGGTTAT-3′，下劃線部分為 BamHⅠ酶切位點）和下游引物 CP-R（5′-ACGCGTCGACACTCGAACCTTCCCACTTAAG-3′，下劃線部分為SalⅠ酶切位點），擴增得到外殼蛋白基因全長。聚合酶鏈式反應（PCR）參數為 94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 60 s，循環(huán) 35次；72℃ 10 min。PCR擴增產物經質量分數1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離。將膠回收產物連接至PCV-GFP載體上，構建含有外殼蛋白基因的表達載體PCV-CP-GFP。

1.2 總RNA的制備

利用RNA提取試劑盒（HiPure Plant RNA Mini Kit）提取煙草葉片總RNA，利用分光光度計檢測RNA的濃度和純度，D（260）/D（280）讀數在1.8～2.1表明提取的RNA符合要求。

1.3 RNA反轉錄與PCR檢測

將RNA定量到1 μg，按照 RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit說明書完成 cDNA的合成。用雙蒸水將得到的cDNA產物稀釋10倍并作為模板，以CP-1F（5′-ATGGCCGTGAAATCTGGTTAT-3′）和CP-2R（5′-CTCGAACCTTCCCACTTAAG-3′）為引物進行PCR檢測。PCR反應體系為：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，35次循環(huán)。

1.4 實時定量PCR與實時定量PCR引物設計

根據NCBI數據庫核苷酸序列信息，通過Prime 5.0軟件，設計檢測小麥的實時定量PCR引物，引物為 qRTMP-F（5′-TGAAGCGGTTGGTGCAAATG-3′）和 qRTMP-R（5′-GCCCGAATCGAGCAGTGATA-3′），由杭州擎科梓熙生物技術有限公司合成。使用SYBR premix ExTaqⅡ試劑盒（TaKaRa）在熒光定量PCR-7900（ABI）上進行實時熒光定量PCR（RT-PCR）反應，反應程序為：95℃預變性10 min；95℃變性15 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，35次循環(huán)。

1.5 煙草葉片總蛋白質的提取

稱取0.2 g處理后的煙草葉片放入2.0 mL離心管中震蕩研磨，加入200 μL蛋白裂解液，劇烈震蕩混勻3 min，冰上靜置5 min，4℃下5 000 r·min-1離心5 min。吸取上清液200 μL至新的1.5 mL離心管并加入48 μL的5×SDS緩沖液，沸水浴中煮沸10 min，冰上放置5 min。量取10 μL經ExpressPlusTMPAGE Gels跑膠檢測（140 V， 50 min）。

1.6 Western Blot印記分析

利用半干轉膜儀，將跑膠后得到的蛋白質轉至硝酸纖維膜（NC膜），并利用封閉液（50 g·L-1脫脂牛奶）封閉1 h。取V[綠色熒光蛋白（GFP）特異性抗體]∶V（封閉緩沖液）=1∶5 000混合，放入NC膜，室溫孵育1 h后用1×PBS洗脫3次，15 min·次-1。將NC膜置于封閉緩沖液中（與HRP標記的兔抗按10 000∶1比例混合）室溫孵育1 h，1×PBS洗3次，15 min·次-1。加入Novex ECL HRP Chemiluminescent Substrate Reagent Kit顯色液，并用Amersham imager 600成像系統(tǒng)成像。

1.7 DNA的提取

利用DNA提取試劑盒（HiPure SF Plant DNA Mini Kit）提取煙草葉片DNA，利用分光光度計檢測DNA濃度和純度，D（260）/D（280）讀數在1.8～2.0表明提取的DNA符合要求。

2 結果與分析

2.1 轉基因苗的獲得

利用農桿菌介導基因轉化法[11]將1.1中構建的表達載體（PCV-CP-GFP）轉至本氏煙中。通過組織培養(yǎng)技術獲得表達外殼蛋白的轉基因煙草（OECP），共獲得10個株系，20株·株系-1，移苗并栽培至4葉期，其中OECP-4和OECP-6株系的煙草沒有存活。隨機挑選存活10株·株系-1轉基因苗，提取總蛋白質進行免疫分析。結果發(fā)現(xiàn)：OECP-1、OECP-3、OECP-7、OECP-9表達量較低，而OECP-10、OECP-8、OECP-5、OECP-2這4個株系表達量較高，條帶大小為43 kDa，與CP-GFP蛋白大小一致（圖1）。為進一步證實得到的轉基因植株為陽性植株，提取樣株DNA進行PCR檢測，結果發(fā)現(xiàn)：OECP-10、OECP-8、OECP-5、OECP-2均擴增出約530 bp的片段，與CWMV外殼蛋白基因大小一致（圖2）。表明外殼蛋白在轉基因煙草中能夠正常表達。

圖1 轉基因煙草的Western-Blot檢測Figure 1 Western-Blot analysisin differenttransgenic tobacco plants

圖2 轉基因煙草的PCR檢測Figure 2 PCR analysis in different transgenic tobacco plants

2.2 外殼蛋白轉基因煙草出現(xiàn)矮化表型

篩選到的OECP陽性植株放置于25℃的恒溫培養(yǎng)室中培養(yǎng)2個月，觀察發(fā)現(xiàn)：與野生型本氏煙草相比，OECP-2和OECP-8的陽性煙草植株出現(xiàn)了矮化表型（表1）。OECP-8與野生型的平均株高比為1.00∶0.65，OECP-2與野生型的平均株高比為1.00∶0.43，表明外殼蛋白干擾了煙草植株的正常生長。

表1 轉基因煙草的株高Table 1 Plant height of transgenic tobaccos

2.3 外殼蛋白轉基因煙草對CWMV的抗病性

對OECP-2及OECP-8接種CWMV并栽植7 d，之后提取系統(tǒng)葉RNA，并檢測其植株中運動蛋白（move protein，MP）基因的表達量。由圖3可知：轉基因植株中CWMV的運動蛋白基因表達量顯著低于對照植株，表明表達外殼蛋白基因提高了煙草對CWMV的抗病性。

3 討論

近年來，外殼蛋白介導的抗病毒途徑是應用最為成熟的提高寄主抗病性的方法之一，獲得的抗病性也更為高效[13]。本研究共獲得了OECP-10、OECP-8、OECP-5和OECP-2等4個高表達外殼蛋白基因的轉基因煙草株系，對OECP-8和OECP-2株系接種CWMV，植株對CWMV的抗病性顯著提高。說明CWMV外殼蛋白介導的抗病毒途徑可被用作培育寄主的抗病材料。

外殼蛋白介導的抗病性分別從蛋白質水平和RNA水平發(fā)揮功能。當病毒入侵進入植物體后，細胞內的外殼蛋白會立刻包裹病毒核酸從而阻止病毒的翻譯與復制或直接引起病毒的脫殼；此外，植物還會通過依賴同源序列的酶降解病毒mRNA[14-16]。將病毒外殼蛋白基因融入植株中從而使轉基因植株獲得抗性已應用于多種病毒與植株互作體系中[9-12]。本研究利用煙草與CWMV互作體系，成功將CWMV的外殼蛋白基因導入至煙草，顯著提高了煙草對CWMV的抗病性，進一步驗證了病毒外殼蛋白基因融入植株后會使轉基因植株獲得抗性。但本研究也發(fā)現(xiàn)轉基因煙草出現(xiàn)矮化現(xiàn)象，說明融入外源基因影響煙草的正常生長，降低了轉基因煙草的品質。與先前研究表明抗病性轉基因植株會出現(xiàn)生長發(fā)育異常，器官變異進而影響品質[17]的結論一致。今后研究不僅要致力于培育具高抗的轉基因植株，還要在提高技術水平時盡量保證其產品的優(yōu)良品質，更好地滿足人類生活所需。

圖3 接種中國小麥花葉病毒后轉基因煙草CWMV運動蛋白表達量檢測Figure 3 qRT-PCR analysisofthe transgenic tobacco plants