香榧癭螨為害對香榧葉片結(jié)構(gòu)及葉綠素質(zhì)量分數(shù)的影響

錢宇汀，薛曉峰，曾燕如，陳文充，葉曉明，喻衛(wèi)武，戴文圣

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州311300；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院 昆蟲學(xué)系，江蘇 南京210095）

香榧Torreya grandis‘Merrillii’是榧樹Torreya grandis經(jīng)人工嫁接繁殖而成的優(yōu)良栽培類型[1]，具有極高的經(jīng)濟價值、生態(tài)價值和文化價值，是集材用、藥用、果用、油用和觀賞于一體的多功能珍貴樹種[2-3]。近幾年香榧產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，使得香榧產(chǎn)區(qū)有了很大的擴展。新老產(chǎn)區(qū)香榧林多為純林，在相對單一的生態(tài)環(huán)境中易成片感染各種病蟲害。香榧癭螨Nalepella abiesis是香榧的主要蟲害之一，其種名最初鑒定為冷杉大嘴癭螨 Rhyncaphytopus abiesis[4]， 2013年經(jīng)重新分類后更名為Nalepella abiesis[5]。 國外尚無該種癭螨的相關(guān)報道。癭螨是一類古老的高度微型化、形態(tài)簡化和多樣化的植食性寄生螨[6]，大多數(shù)種類對寄主植物具有高度專一性[7]。癭螨靠其螯肢演化的口針刺入寄主組織，以吸食細胞里的汁液和營養(yǎng)物質(zhì)為生[8]。癭螨可以為害植物的葉、芽、果實、莖干等部位，大部分癭螨屬于自由生活型，寄生在植物表面，少部分能引起寄主植物產(chǎn)生各種蟲癭、毛氈等癥狀[9]，使寄主植物器官發(fā)生畸形，組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。香榧癭螨屬于寡食性昆蟲，且自由生活在香榧樹體地上部分的器官表面，以葉片為主要寄生場所。目前，關(guān)于香榧癭螨的研究甚少，僅有一些關(guān)于香榧癭螨生物學(xué)特性和發(fā)生規(guī)律[4,10-11]及防治[11]的研究報道，但針對癭螨吸食為害香榧葉片部位卻存在著不同說法[12]。本研究從植物形態(tài)解剖學(xué)的角度探究香榧癭螨為害對香榧葉片結(jié)構(gòu)及葉綠素質(zhì)量分數(shù)的影響，以期對香榧癭螨的為害機理和防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

香榧癭螨采自浙江省嵊州市谷來鎮(zhèn)（29°41′N，120°38′E），該鎮(zhèn)為香榧老產(chǎn)區(qū)。香榧癭螨帶回實驗室后在室內(nèi)用新鮮香榧葉片繼代飼養(yǎng)，并用體式顯微鏡對其進行觀察。香榧苗來自浙江省諸暨市立勤香榧種植基地長勢一致的2+3（2年生實生苗嫁接后再栽培3 a）香榧盆栽苗（盆徑25 cm）。

1.2 試驗方法

1.2.1 癭螨接種 試驗于2018年9-10月在浙江農(nóng)林大學(xué)國家林業(yè)和草原局林木良種繁育基地溫室大棚（30°15′N，119°43′E）內(nèi)進行。香榧葉條形，近對生于枝條的兩側(cè)，上表面光綠色，下表面有2條白色氣孔帶[1]。選擇健康無病蟲害且葉片大小、數(shù)量基本一致的香榧1年生成熟枝條，按30頭·枝條-1的蟲口密度，用0號帶微鉤的昆蟲針輕輕地將香榧癭螨接種到枝條葉表上，以未接種癭螨的盆栽苗為空白對照組。每個處理重復(fù)3次，每重復(fù)5盆苗。每盆苗之間均保持一定的距離，對每個接螨的枝條于基部節(jié)處涂抹凡士林以防止癭螨爬出供試枝條[13]，并保持供試枝條隔離無交叉感染。依次在癭螨侵染的第0天（即健康葉片）、第12天、第25天和第40天，分別剪取2個處理的香榧葉片，將每個重復(fù)的葉片各自混勻。采集的葉片用于形態(tài)解剖學(xué)的觀察和總?cè)~綠素質(zhì)量分數(shù)的測定，使用前先用紙巾擦除葉表的癭螨。

1.2.2 形態(tài)解剖學(xué)觀察 ①葉片組織結(jié)構(gòu)。選取實驗葉片靠中間部位切成1 mm×2 mm大小的塊狀，將塊狀葉置于體積分數(shù)2.5%的戊二醛溶液中4℃條件下固定過夜；然后將樣品用磷酸緩沖液（pH 7.0）漂洗3次，用質(zhì)量分數(shù)1.0%的鋨酸固定1.5 h，再用磷酸緩沖液漂洗3次；后用300、500、700、800、900、950 g·kg-1梯度的乙醇溶液逐級脫水，用Spurr包埋劑與丙酮混合液進行滲透過夜；用半薄切片機（瑞典LKB 11800）切片，經(jīng)亞甲基藍染色后在正置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS BX 60）下觀察、拍照。②葉片氣孔帶結(jié)構(gòu)。樣品雙固定、脫水方法同葉片組織結(jié)構(gòu)，經(jīng)臨界點干燥、鍍膜后在掃描電鏡（日本Hitacbi TM-1000）下觀察、拍照。③葉綠體超微結(jié)構(gòu)。樣品雙固定、脫水、滲透處理方法同葉片組織結(jié)構(gòu)，包埋好的樣品用超薄切片機（日本Leica EM UC7）切片，經(jīng)檸檬酸鉛溶液和乙酸雙氧鈾染液染色后，在透射電鏡（日本JEM-1230）下觀察、拍照。

1.2.3 葉綠素質(zhì)量分數(shù)測定 采用乙醇浸泡法[14]，用紫外-可見分光光度計（日本UV-2600）全光譜掃描測定波長665 nm處的吸光值D（665）和649 nm處的吸光值D（649），并按公式計算鮮葉葉綠素質(zhì)量分數(shù)，葉綠素質(zhì)量分數(shù)（mg·g-1）=0.1×[18.08×D（649）+6.63×D（665）]。數(shù)據(jù)采用 Excel 2007 與 SPSS 17.0 進行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 香榧癭螨生物學(xué)特性觀察

體式顯微鏡下觀察螨害下的香榧葉片，發(fā)現(xiàn)香榧癭螨可以吸食為害香榧植株的葉片上、下表面（圖1）。經(jīng)長期觀察發(fā)現(xiàn)，成螨多集中于香榧葉片上表面吸食（圖1A～B），并且雌成螨基本在香榧葉背2條白色氣孔帶上產(chǎn)卵，卵呈透明狀的橢球形（圖1B～C）。

圖1 體式顯微鏡下觀察香榧癭螨Figure 1 Stereomicroscope observation of N.abiesis

2.2 癭螨為害香榧葉片組織結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化

正置顯微鏡下觀察癭螨為害不同天數(shù)的香榧葉片組織結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)健康葉片上、下表皮均由一層緊密排列的細胞組成，不含葉綠體，表皮外覆著一層較薄的角質(zhì)層；氣孔器分布在下表皮，略內(nèi)陷，由2個保衛(wèi)細胞控制其開閉，周圍密生分叉的角質(zhì)釘（圖2A），這與前人有關(guān)榧樹屬Torreya植物解剖特征的描述[15-16]一致；葉肉組織發(fā)達且明顯分化為柵欄組織和海綿組織，柵欄細胞呈長圓柱狀，垂直于葉表皮，且排列較緊密，內(nèi)含較多的葉綠體，海綿細胞呈不規(guī)則的橢圓形或圓形，排列較為疏松（圖2A）。隨著螨害時間的持續(xù)，柵欄組織和海綿組織細胞形狀發(fā)生改變，但上、下表皮細胞未見有明顯破損（圖2B～D）。從螨害第40天的葉片結(jié)構(gòu)可見，柵欄組織厚度明顯減小，細胞數(shù)量減少，尤其是下表皮上方的柵欄細胞；海綿細胞亦縮水變小，且細胞間隙變大而更為松散；氣孔角質(zhì)釘結(jié)構(gòu)有所破損，保衛(wèi)細胞縮?。▓D 2D）。

2.3 螨害對香榧葉片氣孔結(jié)構(gòu)的影響

掃描電鏡下觀察健康與螨害第40天的香榧葉片氣孔結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)健康葉片的氣孔呈狹長橢圓形（圖3A～B，示半閉合狀態(tài)的氣孔），被乳突狀角質(zhì)釘包圍而內(nèi)陷，而角質(zhì)釘高度密集，呈無規(guī)則分布（圖3A）。癭螨為害后的葉片氣孔有明顯的損傷和萎縮（圖3D）。氣孔周圍的角質(zhì)釘上附著有香榧癭螨的卵（圖3C），卵在樣品制備過程中因漂洗等操作而破裂或脫落。完整的卵呈橢圓形，平均大小為49.87 μm×39.48 μm；相比健康葉片，螨害后的角質(zhì)釘表面附著了更多的絮狀絨毛狀物（圖3D）。

2.4 癭螨為害香榧葉肉細胞超微結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化

透射電鏡下觀察癭螨為害不同天數(shù)香榧葉肉細胞超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)健康葉片的葉肉細胞間有一定的空隙，相鄰細胞壁界限明顯，細胞內(nèi)葉綠體數(shù)量較多，且緊貼細胞壁分布，線粒體也比較豐富（圖4A）。單個葉綠體的基粒片層垛疊緊密，結(jié)構(gòu)清晰良好，體內(nèi)嗜鋨顆粒不多（圖4E）。隨著螨害時間的持續(xù)，葉肉細胞逐漸膨脹變形，細胞間隙變大；葉綠體數(shù)量逐漸減少，體內(nèi)出現(xiàn)膨大的淀粉粒；線粒體數(shù)量亦減少（圖4B～D）。螨害第12天（圖4F），葉綠體內(nèi)嗜鋨顆粒數(shù)量明顯增多，基粒片層排列逐漸散亂，結(jié)構(gòu)不清晰，至螨害第25天變得模糊（圖4G）。螨害第40天，葉肉細胞內(nèi)大部分葉綠體膜被破壞，體內(nèi)有淀粉粒沉積，并脫離細胞壁散亂地分布在細胞質(zhì)中，片層結(jié)構(gòu)瓦解甚至消失（圖4H）。

圖2 癭螨為害香榧葉片組織結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化Figure 2 Dynamic changes in the leaf tissue structure on different days after inoculation with mites

圖3 健康與螨害40 d香榧葉片氣孔的掃描結(jié)構(gòu)的比較Figure 3 A comparison in the leaf stomatal structure between healthy and 40-day mite-hurt leaves under the scanning electron microscope

2.5 癭螨為害香榧葉片葉綠素質(zhì)量分數(shù)的動態(tài)變化

圖4 癭螨為害香榧葉肉細胞超微結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化Figure 4 Dynamic changes in the ultrastructure of a mite-hurt mesophyll cell

相同螨害天數(shù)下，0～12 d處理與對照的葉綠素質(zhì)量分數(shù)無顯著差異，但在接種癭螨25～40 d處理與對照間葉綠素質(zhì)量分數(shù)達差異顯著水平，癭螨處理葉片的葉綠素質(zhì)量分數(shù)下降很快，說明癭螨為害隨著時間的推移影響逐漸增強。癭螨為害期處理與對照香榧葉片葉綠素質(zhì)量分數(shù)動態(tài)發(fā)現(xiàn)，對照與處理香榧葉片葉綠素質(zhì)量分數(shù)均呈下降趨勢，但對照組0～12 d有輕微的下降，12 d后不同時間點間差異不顯著；而螨害處理0～12 d香榧葉片葉綠素質(zhì)量分數(shù)無顯著下降，12 d后不同時間點間葉片葉綠素質(zhì)量分數(shù)下降明顯，差異顯著（P＜0.05），在癭螨接種第25～40天，葉綠素質(zhì)量分數(shù)從3.91 mg·g-1下降至3.3 mg·g-1；螨害第40天與第0天相比，葉綠素質(zhì)量分數(shù)下降了25.34%（圖5）。另外，通過F檢驗發(fā)現(xiàn)：癭螨為害持續(xù)天數(shù)對葉綠素質(zhì)量分數(shù)變化有顯著影響（F=25.331，P＜0.05）。說明螨害導(dǎo)致葉綠素減少，從而影響葉片進行正常的光合作用。

3 討論

逆境脅迫有多種，其中蟲害脅迫是常見的一類生物脅迫[17]。不同脅迫會對植物造成不同程度的為害，同樣螨害會引起植物葉片細胞結(jié)構(gòu)[18]、生理[19]、 生化[20]等方面的 變化，這些變化反映植物體對逆境脅迫的響應(yīng)。香榧葉片被香榧癭螨刺吸式取食后，葉片組織細胞在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化等方面產(chǎn)生了一系列變化。本研究表明：香榧葉片的下表皮上也有柵欄細胞，香榧癭螨主要為害香榧葉片的葉肉組織，癭螨為害后柵欄組織厚度明顯減小，而柵欄組織是大量葉綠體存在的部位，進而影響葉綠素質(zhì)量分數(shù)。結(jié)合體式顯微鏡下的觀察，認為香榧癭螨在香榧葉片上、下表面都有刺吸取食的行為。實驗觀察發(fā)現(xiàn)，成螨更喜歡在香榧葉片上表面取食，這可能跟與上表皮相連的柵欄組織厚且細胞內(nèi)容物多有關(guān)。寄主植物的葉片下表皮是螨蟲躲藏的主要場所，葉片氣孔更是螨蟲口針探入海綿組織的天然孔道[8]，持續(xù)螨害使得氣孔有明顯的損傷和萎縮，嚴重影響了氣孔的正常開閉，從而直接影響葉片的蒸騰作用和氣體交換。由于保衛(wèi)細胞內(nèi)也含有少量葉綠體，推測其也可能是被香榧癭螨刺吸后縮水變小[21]。另外，通過體式顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，香榧癭螨偏好在葉片氣孔帶上集中產(chǎn)卵，一方面葉片乳突狀的結(jié)構(gòu)為卵提供了更好的附著點，另一方面紅豆杉屬Taxus葉片氣孔帶的角質(zhì)乳突具有抵御低溫侵襲的功能[22]，加上植物通過氣孔蒸騰失水，氣孔處所保持的濕度也為卵提供了合適的孵化條件。此外，葉片氣孔密度一直是抗螨性的研究熱點，氣孔密度與植株抗螨性呈負相關(guān)[21,23]，這為后續(xù)選育抗螨性較強的香榧種質(zhì)提供了研究思路。

圖5 癭螨為害香榧葉片葉綠素質(zhì)量分數(shù)的動態(tài)變化Figure 5 Dynamic changes in the leaf chlorophyll content with days after inoculatio with mites

葉綠體是植物體內(nèi)最主要的細胞器之一，它的主要功能是進行光合作用，其結(jié)構(gòu)的完整性與其功能的發(fā)揮緊密關(guān)聯(lián)，而葉綠體對環(huán)境脅迫又比較敏感[24]。超微結(jié)構(gòu)研究表明：葉綠體對香榧癭螨脅迫反應(yīng)非常敏感。螨害后的葉綠體片層結(jié)構(gòu)受損，膜系統(tǒng)被破壞，影響了光合產(chǎn)物的正常輸出，導(dǎo)致葉綠體中有淀粉粒的沉積[18]，無法進一步降解轉(zhuǎn)化。葉綠體內(nèi)嗜鋨顆粒數(shù)量的增加，跟葉綠體的衰老退化有關(guān)[25]，這具有一定的生理學(xué)意義。螨害使葉綠體數(shù)量減少，葉綠素質(zhì)量分數(shù)減少，葉片逐漸失綠，繼而枯萎脫落，直接導(dǎo)致香榧葉片光合能力下降，無法合成更多的養(yǎng)分，進而影響香榧的正常生長。

綜上所述，香榧癭螨吸食破壞了香榧葉片葉肉細胞和氣孔器的結(jié)構(gòu)，使得葉綠素質(zhì)量分數(shù)減少，從而影響了香榧葉片正常的光合作用。