基于全溶體系的毛竹竹材木質素分離方法

吳文娟，閆雪晴，鄒春陽，王博偉，何 賢

（南京林業大學江蘇省林業資源高效加工利用協同創新中心，江蘇南京210037）

木質素是一種廣泛分布于植物細胞壁中無定形的芳香性高聚物，是除纖維素外自然界中儲量位居第2位的可再生資源。隨著木質素化學分解方法研究的進展以及光譜、色譜等分析技術在木質素化學研究中的廣泛應用，對木質素化學結構的認識也越加深刻。但是，人們對木質素結構的認識在很大程度上是基于對分離木質素的研究，而木質素主要分布在植物細胞的微纖絲之間，并且與高聚糖有著復雜的化學或物理鏈接，迄今為止尚未找到一種理想的分離方法，使木質素完全地無變化地從植物原料中分離出來[1-2]，因此，分離方法在很大程度上影響著木質素的結構研究。一直以來都是用球磨木質素（MWL）來分析木質素的化學結構[3-4]，但因為得率低，MWL是否能代表植物原料中全部原本木質素也存有爭議[5]，纖維素酶解木質素（CEL）因為得率高，且結構與MWL相似，被認為可代表植物中的原本木質素[6]。CEL的一個主要缺點為酶水解過程中的酶不能在后期分離純化時完全除去。WU等[7]在此基礎上提出了一種從闊葉木、針葉木中有效分離木質素的新方法：EMAL（enzymatic/aicdlolysis lignins）。該分離方法結合酶處理與溫和酸水解，使木質素-碳水化合物間的化學鏈接能在溫和的化學條件下，選擇性地有效打開，為木質素高效分離提供了保證。相對于傳統的球磨木質素，該分離方法通過球磨、酶水解及溫和酸水解的協同作用，可以明顯提高木質素的得率。但眾所周知，酸處理將導致木質素α-醚鍵的斷裂。LEE等[1]和MESHITSUKA等[8]研究表明：球磨后木質纖維原料木質素在二氧六環-水溶液中的溶出與球磨時間有關，胞間層木質素較易溶出，隨著球磨時間的延長，次生壁木質素的溶出逐漸增多。因此，利用傳統方法分離木質素，縮短球磨時間不僅降低了分離木質素的得率，也使得到的木質素缺乏代表性。木質纖維原料由纖維素、半纖維素和木質素構成，纖維素大部分分子規律性排列形成結晶結構，只有部分分子規律性差，形成無定形區。纖維素酶只能作用于植物原料的非結晶區,對于結晶區并不起作用，如果直接將木質纖維素用于酶解，效果很差。因此,在酶解前必須先改變纖維素的晶體結構，才能促進纖維素的降解，達到提高酶解效率的作用。選用合適溶劑進行溶解再生來改善結晶區的結構可以提高酶解效率[9-10]。WANG等[11]提出的LiCl/DMSO全溶體系，作用于球磨木粉，結果表明：再生前后的木質素結構單元沒有發生變化，而纖維素的結晶區受到一定程度的破壞。本研究以毛竹Phyllostachys edulis竹材為原料，借助LiCl/DMSO溶劑體系溶解再生處理，通過纖維素酶水解分離出非木材木質纖維原料中的木質素，并與傳統方法得到的MWL和CEL進行了比較。

1 材料與方法

1.1 原料

試驗毛竹竹材產自浙江安吉，人工劈成長3～4 cm，寬、厚 2～4 mm的小竹條。上述風干原料用Wiley微型粉碎機粉碎，取40～80目組分，用苯醇（2∶1，V/V）抽提8 h，經真空干燥后，儲存于帶磨砂玻璃塞的廣口瓶中，供分析使用。

1.2 球磨

竹粉的球磨在德國Fritsch微型行星式高能球磨機中進行。稱取2 g真空干燥后的脫脂竹粉裝入容積為45 mL氧化鋯制的罐子，內裝18只內徑1 cm的氧化鋯球，以600 r·min-1進行不同時間的球磨。球磨在冷庫（-20℃）進行，每運行15 min，休停5 min，以避免過熱。磨后竹粉經干燥后，備用。

1.3 LiCl/DMSO溶解和再生

球磨2 h的竹粉以質量分數7.5%溶于8%LiCl/DMSO溶劑體系，室溫下攪拌48 h，在60℃繼續攪拌24 h。LiCl/DMSO處理后，將溶解物置入透析袋，放入裝有去離子水容器中，用新鮮去離子水更換容器中透析出來的水數次，直至用硝酸銀無法檢測出透析液中氯離子（Cl-）。再生的原料經冷凍干燥后，得到再生原料，再生得率為86.0%，高聚糖的得率81.0%。再生原料室溫保存，作酶水解備用。

1.4 木質素的分離

竹材MWL的分離方法參照文獻[3-4]。球磨2 h的竹粉10 g，用96%二氧六環/水（V/V）室溫下提取24 h，離心分離后，殘渣繼續用96%二氧六環/水（V/V）體系提取1次，離心分離殘渣。收集2次離心后的上清液，在30℃下旋轉蒸發濃縮至干，在室溫下真空干燥后，溶于體積分數為90%醋酸溶液中，離心分離，上清液緩緩滴加至10倍體積的水中，沉淀下來的固體殘渣用水離心洗滌3次后真空干燥。干燥后的木質素溶于1,2-二氯乙烷/乙醇（2∶1，V/V）的混合液中，離心后，上清液于大量乙醚中沉淀，沉淀物用乙醚洗3次，五氧化二磷真空烘干箱干燥，得到竹材MWL，得率為5.1%（基于竹材Klason木質素）。

竹材CEL的分離方法參照文獻[6]。取球磨竹粉和再生球磨竹粉各10 g于 500 mL錐形瓶中，加入一定量纖維素酶酶活（以濾紙酶活計）為30 μmol·min-1·mL-1的混合酶液（Novozymes提供），以每克絕干葡聚糖為基準，酶用量均為30 μmol·min-1，補充一定量的pH 4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液，調節酶水解底物質量分數為 5%，將錐形瓶置于恒溫振蕩器（SHA-C）中，在 180 r·min-1，50℃下振蕩72 h。水解后在5 000 r·min-1下離心15 min，分離酶水解液。殘渣用蒸餾水離心洗滌3次后，經冷凍干燥和五氧化二磷真空干燥后，用96%二氧六環/水（V/V）提取，得到粗竹材CEL和再生酶解木質素（RCEL）。經上述純化步驟后，得到竹材CEL和RCEL，得率分別為25.3%和48.2%（基于竹材Klason木質素）。

1.5 木質素的乙酰化反應

木質素的乙酰化參考文獻[12]。稱取300 mg木質素樣品于50 mL三角燒瓶中，加入15 mL吡啶/乙酸酐（1∶1，V/V），蓋緊瓶塞，攪拌，室溫下反應24 h。反應結束后，用無水乙醇將反應體系蒸發至干，至無吡啶氣味。加入1 mL氯仿完全溶解，并滴入100 mL乙醚中沉淀出乙酰化木質素，用乙醚洗滌沉淀多次后，置入40℃真空干燥箱中干燥。乙酰化木質素用于凝膠滲透色譜（GPC）和核磁共振氫譜（1H NMR）的測定。

1.6 分析方法

1.6.1 化學成分測定 木質素含量、灰分的含量按照文獻[13]的方法測定。稱取樣品0.300 0 g，加入3 mL質量分數為 72%硫酸，在18～20℃下水解3 h。期間定時攪拌，然后轉入 100 mL玻璃瓶中，加水將硫酸稀釋至質量分數為 4%，密封后置于滅菌鍋（DSX-280B）內，在 121℃下水解 1.5 h。用已恒質量的G3砂芯漏斗分離殘渣和水解液，收集濾液測定酸溶木質素和高聚糖質量分數。殘渣用熱蒸餾水洗滌至濾液，用質量分數為10%氯化鋇檢測無白色沉淀，在恒溫干燥箱中于 105℃下恒量，稱量后轉入馬弗爐中于575℃灼燒至恒量，測定木質素中的灰分質量分數。計算 Klason木質素質量分數時扣除灰分的質量分數。以質量分數為4%硫酸為參比，用日本島津公司的UV-240紫外-可見分光光度計測定水解液在波長205 nm處的吸光度，計算酸溶木質素的質量分數。

還原糖的測定參照文獻[14]。取水解液5 mL，加入內標1 mL肌醇溶液（質量濃度為1 g·L-1），用飽和氫氧化鋇溶液調節pH至5.5，離心分離除去沉淀，加入20 mg硼氫化鈉于清液中，靜置24 h。加入1 mL醋酸后，旋轉蒸發至漿狀，再加入甲醇繼續蒸發至干，1 mL·次-1，連續3次。將蒸干體系于105℃烘干15 min以確保體系完全無水。加入1 mL乙酸酐后密封，在120℃下反應3 h。用日本島津公司的GC-14b氣相色譜儀分析還原糖。氣相色譜條件如下：毛細管柱TC-17（0.25 mm×30 m）；FID檢測器；柱溫程序，220℃保留20 min。進樣溫度為220℃，檢測溫度為230℃；氣相色譜GC分析得到的單糖均轉換為高聚糖。同時進行2次測定，取其平均值。

1.6.2 硝基苯氧化 木質素的結構變化可以通過硝基苯氧化結果來分析。硝基苯氧化操作參照文獻[15]。取樣品40 mg于10 mL不銹鋼制的罐子里，依次加入硝基苯0.25 mL，2.0 mol·L-1氫氧化鈉4 mL。將上述混合體系密封置于170℃油浴中反應2 h。冷卻至室溫，加入1 mL 0.1 mol·L-1氫氧化鈉配制的內標3-乙氧基-4-羥基苯甲醛（0.2～0.4 g·L-1）。 用二氯甲烷萃取 3次， 15 mL·次-1， 棄油相取水相， 用 4.0 mol·L-1鹽酸調節pH至1.0，依次用二氯甲烷萃取2次，20 mL·次-1，乙醚1次，15 mL。收集有機相共55 mL，用去離子水20 mL洗滌有機相，經無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液蒸發至干，加入100 μL N,O-雙（三甲基硅）乙酰胺衍生化試劑（BSA）于100℃反應10 min。產物用日本島津公司的GC-17A氣相色譜儀進行分析。氣相色譜條件如下：毛細管柱NB-1（0.25 mm×30 m）；FID檢測器；柱溫程序，150℃保留15 min后，以3℃·min-1升溫到180℃，繼而以10℃·min-1升溫到280℃，保留5 min。進樣溫度為250℃，檢測溫度為280℃。同時進行2次測定，取其平均值。

1.6.3 元素分析 用德國Elementar公司的ELⅢ型元素分析儀來檢測樣品中規定碳、氫、氮和氧的質量分數。

1.6.4 熱重分析 采用Henven公司的熱重分析儀進行木質素樣品熱失重分析，實驗溫度為30～900℃，升溫速率為20℃·min-1，高純氮氣保護。

1.6.5 紅外光譜 采用KBr壓片法在日本JASCO IR-615型紅外光譜儀上測定樣品，波長范圍為4 000～400 cm-1。

1.6.6 凝膠滲透色譜（GPC）分析 用美國Waters公司 1515型凝膠滲透色譜分析系統來測定木質素的分子量和分子量分布。GPC分析在Waters 2414折射只是檢測器上進行，采用StyragelHR1， HR3和HR4色譜柱（7.8 mm×300.0 mm），測定質量濃度5～10 g·L-1，用四氫呋喃作為溶劑，溶劑流速在30℃為1.0 mL·min-1。以標準聚苯乙烯（分子量范圍為100～500 000）作為標準樣品制備標準曲線。

1.6.7 X射線衍射 纖維結晶指數分析在日本理學UltimaⅣ組合型多功能水平X射線衍射儀上進行，采用粉末法。測試條件：X光管為CuKα靶（λ=0.154 18 nm），用石墨單色器消除CuKα輻射，管電壓40 kV，管電流40 mA，測量方法采用θ/2θ聯動掃描，索拉狹縫為0.04 rad，接收狹縫0.15 mm，發射和防散射狹縫 1°， 掃描范圍為 2θ=5°～40°， 掃描步長為 0.02°， 掃描速率為 5°·min-1， 記錄 “衍射強度-2θ”曲線。結晶指數可以根據Segal公式[16]進行計算：

其中：ICr為結晶指數，Iamorph為 2θ為18°時無定形區衍射峰的強度，I002為主結晶峰 002的最大衍射強度。

1.6.81H NMR測定 將乙酰化木質素溶于氘代氯仿（CDCl3），在日本JEOL公司的Alpha 500型核磁共振儀上進行測樣。以三甲基硅烷作為內標。

2 結果與分析

2.1 竹材木質素的特性

2.1.1 竹材CEL和RCEL的得率、化學組成 相對于傳統的木質素分離技術，由于部分木質素和碳水化合物間存在著共價鍵鏈接[17]，又有部分的木質素-碳水化合物復合體（LCC）溶于二氧六環與水的溶液中[18-19]，使得從纖維原料中分離得到高純度、高得率木質素受到一定局限。經比較分析，利用LiCl/DMSO溶劑體系對球磨竹粉的溶解再生可高效分離木質素。對竹材來說，球磨2 h再經LiCl/DMSO溶劑體系的溶解再生分離得到的木質素得率可達48.2%，是CEL方法的2倍多，是MWL方法（得率為5.1%）的9倍。球磨時間的縮短，木質素的溶出可借助于LiCl/DMSO溶劑體系對物料的滲透潤脹來改善，使之有更多的木質素裸露出來，通過聚糖的酶解來提高木質素在有機溶劑中的溶出，這樣可以避免因為長時間的球磨帶來木質素結構上的損傷。所以LiCl/DMSO溶劑體系的處理有助于提高竹材木質素的得率。另外，從表1可看出：竹材的RCEL總糖質量分數為9.0 g·kg-1，CEL為 12.0 g·kg-1。RCEL的純度略高于CEL。

由表2可以看出：碳、氫和氧元素質量分數差別不大，竹材CEL和RCEL的氮質量分數均為3 g·kg-1，氮元素在木質素中質量分數均在10 g·kg-1以下，不會影響到其化學結構的分析[20]。

表1 竹材CEL和RCEL的得率和純度Table 1 Isolation yield and sugar content of purified lignin samples from bamboo

表2 竹材CEL和RCEL的元素分析Table 2 Element analysis of CEL and RCEL isolated from bamboo

2.1.2 分子量分析 凝膠滲透色譜（GPC）是一種木質素分子量快速測定的簡單可靠的方法。但是木質素是不均一的高聚物，分析其不均勻性，即多分散性對了解整個木質素分子量的變化有重要影響。由表3可以看出：竹材的CEL和 RCEL的重均分子量（Mn）和數均分子量（Mw）相近，數均分子量約6 000，重均分子量12 000。RCEL的得率高于CEL。LiCl/DMSO溶劑體系的溶解潤脹，一方面破壞了部分與木質素相連的纖維素結晶區，纖維素被酶水解成單糖溶出，木質素則留在底物里；另一方面，通過破壞纖維素結晶區，會將原來彼此包覆的木質素釋放出來。最終都會導致分離木質素得率的增加。從表3看到：RCEL的重均分子量高、分散性大，說明非木材纖維原料的木質素大分子之間仍存在著較大的差異，體現了非木材纖維原料木質素大分子結構的復雜性。竹材RCEL的分散性與CEL一致，都為2.0。

表3 竹材CEL和RCEL分子量Table 3 Average molecular weight and polydispersity index （Mw/Mn） of CEL and RCEL from bamboo

2.1.3 紅外光譜分析 紅外光譜能反映木質素的微細結構，根據木質素紅外光譜特征吸收譜帶測定分析木質素所帶有的功能基，例如羰基、羥基、甲氧基、C—H鍵和C—C鍵等[21]。由圖1可看出：竹材CEL和RCEL紅外光譜特征峰基本一致，表明兩者的官能團組成基本相同，CEL和RCEL在其結構上沒有明顯的差異：表征苯環骨架伸縮振動的1 597、1 512和1 419 cm-1吸收峰均顯示出較強的吸收，這是木質素結構的基本特征峰，說明其苯環骨架結構保存完好。在1 704 cm-1出現明顯吸收峰，這些吸收峰是非共軛羰基、酯基的特征吸收峰；另外，在1 327 cm-1有紫丁香基的吸收，愈創木基單元的伸縮振動在1 234 cm-1也有明顯吸收，表明CEL和RCEL中均含有一定量的愈創木基單元、紫丁香基單元。木質素芳環單元結構在LiCl/DMSO溶解再生過程中沒有明顯破壞。對吸收峰歸屬的劃分結果見表4。

2.1.4 X射線衍射分析 圖2為原料竹材、球磨竹材及溶解后再生竹材的X射線衍射曲線，未經任何處理的原料竹粉（B）結晶度（ICr）為58.4%，再生竹材（RMB）與球磨竹材（MB）ICr分別為26.5%和24.6%。由圖2可以看出：竹材的曲線明顯不同于球磨竹材和再生竹材。結合表5的結晶度可以看出：對于溶解后再生的球磨竹材原料，其得率為86.0%，高聚糖的得率81.0%，即處于無定形區的部分碳水化合物會在LiCl/DMSO處理過程中溶出，因而其結晶度略高于球磨樣品。與40～80目的原料相比，結晶區有了明顯的破壞。對于經過溶解再生后的樣品，一方面可改善聚糖的酶水解，另一方面溶劑體系的深入滲透，會有更多的木質素敞露出來，有利于后續有機溶劑的提取、分離。

表4 竹材CEL和RCEL的紅外光譜圖解析Table 4 Assignment of FTIR spectra of CEL and RCEL isolated from bamboo

圖1 竹材CEL和RCEL的紅外譜圖Figure 1 FT-IR spectra of CEL and RCEL isolated from bamboo

圖2 竹材（B）、球磨竹材（MB）及再生竹材（RMB）的X射線衍射圖Figure 2 X-ray pattern of original bamboo （B）,ball milled bamboo （MB）,and regenerated bamboo with ball milling （RMB）

2.1.5 木質素結構單元 堿性硝基苯氧化一般用于木質素的結構單元分析，未縮合的對羥基苯基（H）、愈創木基（G）和紫丁香基單元（S）在堿性高溫條件下分別氧化為對羥基苯甲醛、香草醛和紫丁香醛。木質素結構中未縮合單元含量越高，則木質素的縮合程度越低。表5顯示了酶解木質素和溶解再生后的酶解木質素的堿性硝基苯氧化結果。從表5可以看出：竹材CEL的得率為2.7%，RCEL為2.5%，CEL的未縮合程度要高于RCEL。另外，硝基苯氧化的結果表明：竹材CEL和RCEL均屬于GSH類型的木質素，含有豐富的紫丁香基單元，其中紫丁香基單元在未縮合單元中的占比達一半。從對羥基苯基、愈創木基和紫丁香基單元的得率、比例及紫丁香基單元的質量分數可說明2種分離出來的木質素的結構單元比例沒有明顯的不同。

表5 竹材CEL和RCEL的硝基苯氧化產物的得率及S/GTable 5 Nitrobenzene oxidation products yields and S/G molar ratio of CEL and RCEL isolated from bamboo

2.1.6 木質素的熱穩定性 木質素是一種復雜、非結晶性的空間立體結構的大分子有機物，以苯基丙烷單元為主體，經各種醚鍵、碳碳鍵等連接而成，且含有豐富的羥基和甲氧基等官能團，結構的復雜性會影響其熱裂解[22]。由圖3可以看出：竹材CEL和RCEL的熱解曲線在100～800℃的熱重曲線大致相同。在200～600℃內，殘余物質量分數由94.4%減少至33.2%，減少了63.9%。超過600℃時，木質素中熱解殘余物中已不存在木質素苯丙烷單元，此時的苯丙烷單元組成的大分子結構發生了徹底的解構[23]。在600～800℃內RCEL殘余物質量分數的減少值為5.0%，CEL為7.0%，此熱解特性的差異主要在于木質素中化學結構的不同。經前述分析，竹材RCEL的縮合程度要高于CEL，從而導致其熱解需要更高的能量。分析結果表明：竹材CEL和RCEL的熱分解過程主要發生在200～600 ℃。

圖3 竹材CEL和RCEL的TG曲線Figure 3 Thermogravimetric analyses of CEL and RCEL of bamboo

2.1.71H NMR分析 由圖4可看出：竹材CEL和RCEL在結構單元方面沒有任何差異，化學位移在6.25×10-6～6.80×10-6,6.80×10-6～7.20×10-6及 7.30×10-6～7.60×10-6分別對應于紫丁香基、愈創木基及對羥基苯基單元，分離出來的CEL和RCEL都屬于GSH型木質素。化學位移處在3.48×10-6～4.00×10-6有較強烈的譜峰吸收，應歸屬于甲氧基上質子。從圖4發現：2種分離木質素CEL和RCEL的各種官能團包括羥基和甲氧基峰形都十分明顯，表現出豐富的官能團特征，表明分離木質素的官能團保持較好。另外，化學位移在 1.60×10-6～2.22×10-6內為芳基側鏈脂肪族醋酸酯上質子，2.22×10-6～2.50×10-6的譜峰歸于芳香族醋酸酯上質子。

圖4 竹材CEL和RCEL的1H NMR譜圖Figure 4 1H NMR spectra of CEL and RCEL of bamboo

3 結論

以竹材為原料，經球磨、LiCl/DMSO溶劑體系溶解、再生處理、酶水解得到了RCEL。與傳統的方法相比，RCEL得率和純度都較高。經表征，此分離方法對木質素大分子結構有較好的保護作用，對碳水化合物有很好的降解作用，RCEL能較好地代表竹材的木質素。

分離得到的竹材木質素為GSH型木質素，縮合程度略高，竹材RCEL中紫丁香基結構單元含量較高，并占到一半。從分子量分布來看，竹材RCEL數均分子量和重均分子量都較高，分離過程中木質素降解較少。熱解特性曲線分析表明：熱失重溫度為200～600℃，600℃后失重趨于穩定。在800℃，竹材RCEL未被分解的質量分數為241 g·kg-1。木質素縮合程度的不同決定了其熱解特性的差異。