稀有鮈鯽熱休克因子1的分子克隆與表達分析

張夕梅，黃 宇，劉 堰

(西南大學生命科學學院淡水魚類資源與生殖發育教育部重點實驗室，重慶 400716)

熱休克因子1(heat shock factor 1,HSF1)是熱休克反應中最重要的調節因子，它與熱休克基因相應的啟動子結合，介導基因轉錄并促進HSPs的表達[1]。水生生物HSF1的重要性在于它不僅受高溫誘導，還受氧化劑、重金屬和病原體的影響。Wang等[2]首次克隆了橙斑石斑魚(Epinepheluscoioides)的HSF1同種型，并研究了熱應激、免疫刺激和病毒感染后的轉錄變化。后續研究克隆了硬骨魚類如斑馬魚(Daniorerio)，虹鱒(Rainbowtrout)和金魚(Carassiusauratus)的HSF1[3-5]。但HSF1在稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)中的研究還未見報道。

稀有鮈鯽作為我國特有的鯉科類，具有體型小，養殖容易，生命周期短，繁殖力強等特點，是毒理學研究的本土模式生物[6]。目前，稀有鮈鯽被用于多種分泌干擾物如多雙酚A、有機磷阻燃劑、孕激素、五氯酚等的毒理學研究。

五氯酚(pentachlorophenol,PCP)是一種典型的不易氧化和水解的環境污染物[7-8]，PCP及其鈉鹽使用范圍廣，美國環境保護署將其列為優先檢測污染物和潛在的致癌物，也是我國優先監測的環境污染物之一[9]。

實驗室前期曾對PCP暴露下稀有鮈鯽肝臟中HSP90及HSP70的表達進行了研究，發現HSP90、HSP70對PCP較為敏感，提示這兩種HSPs能作為PCP的生物標志物[9-10]。后續的研究也證明了HSP70,HSP90能作為環境污染物的標志物[11-13]，然而HSF1作為調節HSP70、HSP90等熱休克蛋白的轉錄因子，對于環境污染物的評估作用研究較少。已有研究指出鎘脅迫后能夠增加香魚(Plecoglossusaltivelis)肝、心和肌肉中HSF1基因表達量，降低脾、腎和鰓中HSF1的表達量，表明HSF1能夠參與香魚鎘脅迫應激反應，作為鎘污染的生物標志物[14]。HSF1除了作為鎘等重金屬的生物標志物外，當對暴露于納米材料的斑馬魚胚胎進行基因組分析后發現，納米材料也會誘導HSF1的表達量，提示HSF1能夠作為納米材料污染物的生物標記物[15]。因此本研究表征了稀有鮈鯽的熱休克因子1(GrHSF1)，并檢測了GrHSF1的組織表達以及溫度和內分泌干擾物PCP暴露對其mRNA表達的影響，為GrHSF1對環境污染物PCP的評估作用奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

稀有鮈鯽種魚購于中國科學院武漢水生生物研究所，在本實驗室飼養繁殖超過8年，光照周期為白晝∶黑夜=12 h∶12 h，水溫控制在23～25 ℃，全部喂養鹽水孵化的豐年蟲，實驗用魚為孵化45 d的幼魚。實驗前以連續曝氣24 h的自來水[DO>5 mg/L，pH:(7.6±1.5)，總硬度為(7.8±0.7)dH，水溫(25±2)℃]馴化喂養2周。

1.2 主要試劑

試劑：五氯酚(PCP，純度99%)，二甲基亞砜(DMSO，色譜純)，17α-乙炔基雌二醇(EE2，純度>98%)購自Sigma;Total RNA 提取試劑(DP419)，Prime Script?RT reagent kit with gDNA Eraser，SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ購自Takara；其他試劑均為國產分析純。PCP和EE2母液以DMSO為共溶劑在蒸餾水中制備，濃度為1 mg/mL，4 ℃保存。

1.3 實驗方法

1.3.1 分子克隆

基于NCBI上稀有鮈鯽相近物種的HSF1氨基酸序列信息，在HSF1保守區域設計兩個簡并引物(HSF1-F，HSF1-R)(表1)，由上海Invitrogen公司合成。PCR產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳并觀察。通過膠回收試劑盒回收核心片段，亞克隆到pMD19-T載體中，并測序?；讷@得的核心片段設計兩對基因特異性引物(HSF1-F1，HSF1-F2，HSF1-R1，HSF1-R2)(表1)。根據SMARTerTM RACE cDNA擴增試劑盒(Clontech，USA)的方案分別合成5′和3′ cDNA模板，選擇巢式PCR反應擴增以延伸5′/3′GrHSF1 cDNA序列，于-20℃保存。

1.3.2 序列分析

通過DNAMAN拼接序列全長，通過ProtParam工具(http://web.expasy.org/protparam/)，計算分子量、理論pI和氨基酸組成；通過ClustalX1.83和SMART軟件對稀有鮈鯽的HSF1序列進行多重比對、蛋白質基序特征預測和域結構分析；通過保守域結構檢索工具(CDART)、保守域數據庫(CDD)以及NCBI檢測了稀有鮈鯽HSF1的保守結構域?；贕rHSF1和公共數據庫中其他已知HSF1的氨基酸序列。使用鄰接法通過MEGA 7.0構建了系統發育樹。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers in this research

核苷酸代碼：Y=C/T;R=A/G;N=A/C/G/T;M=A/C;S=G/C

1.3.3 暴露實驗

基于PCP對稀有鮈鯽七天亞毒性實驗[16]以及實驗室前期研究，設置4個PCP處理組(n=10)濃度分別為8、16、80、160 μg/L，一個DMSO溶劑對照組(n=10)(0.001% DMSO,v/v)，以及一個陽性對照組(n=10)(EE2,50 ng/L)，全部進行7 d的PCP暴露處理；另取五組，一組(n=50)暴露于80 μg/L PCP不同時間(0、0.5、1、3、5、7 d)，另四組(n=10)分別置于不同溫度(4、10、25、37 ℃)的培養箱中7 d，所有暴露體系均在10 L玻璃缸中進行，每個濃度進行兩次重復實驗。采用半靜態水體暴露方法，每天更換一半體積暴露水，再補加暴露試劑至原濃度。每天喂食孵化的豐年蟲兩次。

1.3.4GrHSF1的組織分布及暴露實驗對肝臟HSF1表達的影響檢測

從8條未經處理的健康魚中收集血液、皮膚、鰾、鰭、脾、肝、性腺、鰓、腎、肌肉、腦、心臟和腸，將樣品在液氮中快速冷凍，然后在-80 ℃下保存，通過RT-PCR分析。

處理組的稀有鮈鯽經PCP暴露7 d后，將稀有鮈鯽通過冰浴麻醉，迅速解剖取出肝臟。每個處理組中的4條魚的肝臟分別收集于一個離心管中作為一個樣品用于RT-PCR，每處理組各兩個樣品，每個樣品進行3次重復檢測。

使用β-actin作為內參基因，Real-time PCR的正向和反向引物列于表1。反應條件為95 ℃保持30 s進行預變性，40個循環:95 ℃ 20 s，61 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，最后一個循環結束后繪制溶解曲線，所有樣品進行三次檢測.各基因的相對表達量用2-△△Ct表示，擴增達到熒光閾值時的PCR循環次數，記作Ct值.

1.4 統計方法

使用SPSS統計軟件22.0進行數據統計分析，所有定量數據均表示為平均值±SEM;以GraphPad prism 7.0繪圖，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 稀有鮈鯽HSF1基因的cDNA全長克隆

結果如圖1所示，HSF1基因核心片段長度為480 bp(圖1A)，5′和3′片段長度分別為879 bp(圖1B)和859 bp(圖1C)。運用DNAMAN對核苷酸序列進行拼接得到1條2 144 bp 的全長cDNA，包含一個1 581 bp的開放閱讀框，編碼527個氨基酸；以poly(A)尾截止的296 bp的3′-非編碼區(UTR)和位于起始密碼子(ATG)上游的119 bp的5′-UTR；分子量為58.4 kDa；等電點4.88；不穩定指數為52.2，表明蛋白質不穩定。將其命名為GrHSF1，并將該序列提交到GenBank(Accession No.MK588748)。

圖1 GrHSF1 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Electrophoresis of HSF1 from G.rarus amplification by PCRM：DL2000 DNA 標準品;A：GrHSF1核心片段;B：3′ RACE 擴增片段;C：5′ RACE 擴增片段

2.2 稀有鮈鯽HSF1推導氨基酸序列多重比對及相似率分析

運用ClustalX 1.83序列比對軟件將稀有鮈鯽HSF1基因編碼的氨基酸序列與其它魚類HSF1基因所編碼的氨基酸序列進行比對，發現稀有鮈鯽HSF1基因所編碼的氨基酸與其他魚類所編碼的HSF1氨基酸序列相似度高(圖2)，稀有鮈鯽HSF1基因所編碼的氨基酸與草魚、鱇白魚、斑馬魚、鯽和墨西哥脂鯉所編碼的氨基酸相似性分別為95%、92%、84%、89%和74%.GrHSF1氨基酸序列相對保守，通過NCBI的CDD進行的序列分析顯示，保守區域具有位于殘基17-121位的HSF-DNA結合超家族，位于殘基75-185位的轉移酶超家族及位于殘基247-527位的脊椎動物熱休克轉錄因子。

2.3 稀有鮈鯽HSF1系統進化樹分析

用Clustal X和Mega 7.0的比鄰法建立系統進化樹，用1000組復制抽樣分析，獲得GrHSF1氨基酸序列的系統進化樹(圖3)。系統進化樹包括稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus，MK588748)，草魚(Ctenopharyngodonidella，ALK27859.1)，斑馬魚(Daniorerio，NP_001300665.1)，鯉(Carassiusauratus，AHN60082.1)，虹鱒(Oncorhynchusmykiss，BAD10988.1)，西洋鮭(Salmosalar，XP_01399 8218.1)，食蟹獼猴(Macacafascicularis，XP_015 310862.1)，斑馬擬麗魚(Maylandiazebra，XP_012 778243.1)，慈鯛(Pundamilianyererei，XP_0137 69204.1)，青鳉(Oryziaslatipes，XP_023815376.1)，馬鹿(Cervuselaphushippelaphus，OWK04209.1)，智人(Homosapiens，NP_005517.1)，黑猩猩(Pantroglodytes，NP_001266850.1)，老鼠(Musmusculus，AAH94064.1)，牛(BosTaurus，NP_0010702 77.1)等的HSF1，系統進化樹顯示GrHSF1與草魚的HSF1聚為一支，親緣性較近，之后與其它魚類聚為一支，與黑猩猩、老鼠、智人等哺乳動物的HSF1親緣性較遠。

2.4 GrHSF1在稀有鮈鯽各組織的分布

用RT-PCR技術檢測了稀有鮈鯽體內各組織中GrHSF1的表達狀況，發現GrHSF1在稀有鮈鯽血液、腦、性腺、鰓、心臟、肝臟、脾、肌肉、皮膚、鰾、腸和腎等12個組織中有表達(圖4)，其中在肝臟中表達量最高，在血液、性腺和腦中也有較高的表達，而在其余組織中表達量較少。

2.5 PCP對稀有鮈鯽HSF1表達的影響

稀有鮈鯽幼魚在不同濃度PCP暴露7 d后，檢測各處理組中稀有鮈鯽肝臟GrHSF1 mRNA的表達情況，實驗結果如圖5(A)所示，GrHSF1 mRNA的表達量隨著PCP濃度的升高而增加，呈現出劑量依賴效應；稀有鮈鯽幼魚在80 μg/L PCP下暴露不同的時間后，檢測各個實驗組用魚肝臟中GrHSF1 mRNA的表達情況，實驗結果如圖(5B)所示，GrHSF1 mRNA的表達量隨著時間的推移而增加，呈現出時間依賴效應;而在熱激條件下，GrHSF1 mRNA的表達隨著溫度的升高或降低而降低，高溫對其表達的影響更為明顯(圖5C)。

圖2 稀有鮈鯽HSF1基因預測氨基酸序列的多重比對Fig.2 Multiple sequence alignment of predicted GrHSF1陰影背景為高度保守的一致序列。HSF1的GenBank登錄號如下：GrHSF1(Gobiocypris rarus;MK588748)，CiHSF1(Ctenopharyngodon idella ALK27859.1)，AgHSF1(Anabarilius graham;ROL45973.1)，DrHSF1(Danio rerio;NP_001300665.1)，CaHSF1(Carassius auratus;AHN60082.1)，AmHSF1(Astyanax mexicanus;XP_022518071.1)

3 討論

HSF1是進化上高度保守的轉錄因子，能夠協調應激誘導的轉錄并指導真核生物的多種生理過程。當環境壓力觸發HSF1時，HSF1單體聚合在一起并磷酸化，隨后轉移到核內與熱休克反應DNA元件(HSEs)結合，從而上調HSPs的編碼。

圖3 稀有鮈鯽HSF1系統進化樹分析Fig.3 Phylogenetic analysis of HSF1sequences位于分支點的數字表示置信度，重復次數為1 000次。相似物種HSF1的Genbank登錄號如前所述

圖4 稀有鮈鯽不同組織中HSF1的表達情況Fig.4 Relative HSF1 mRNA expression in different tissue of G.rarus*表示與空白對照組相比P<0.05；**表示P<0.01。圖5同。

圖5 PCP對稀有鮈鯽HSF1的表達狀況分析Fig.5 Effect of PCP on HSF1 mRNA expressions in the liver of G.rarus將稀有鮈鯽暴露于(A)不同濃度的PCP 7天，或(B)80 μg/L PCP不同時間，以及(C)不同溫度7天。

在脊椎動物中發現了四種HSF(HSF1-HSF4)，而在無脊椎動物中只報道了一種HSF[17]。不同物種的HSF1同一亞型之間的序列高度相似，不同亞型之間存在結構和功能上的差異[18]。我們首次通過RACE技術從稀有鮈鯽肝臟中克隆得到HSF1的全長cDNA序列GrHSF1(GenBank登錄號MK588748)。研究指出GrHSF1序列與魚類的相似性較高，而與哺乳動物的相似性較差。從進化角度來看，早期進化過程中，HSF1可能在應激過程中發揮著不同的生理功能，這有助于動物更好的適應環境和生存。GrHSF1的mRNA在稀有鮈鯽的不同組織中均被檢測到，與之前的海參(Apostichopusjaponicas)[19]，比目魚(Haliotisdiversicolor)[20]等水生生物中發現的情況是相似的。這一結果表明HSF1對于維持稀有鮈鯽的基礎代謝和生長具有重要的意義。HSF1在稀有鮈鯽肝臟中表達量最高，在皮膚，肌肉等中表達量較低，因為肝臟的細胞代謝比皮膚、肌肉等的代謝更活躍，因此我們推測，高表達的HSF1在非壓力環境下對于維持細胞蛋白穩定發揮著更為重要的作用，而在壓力環境下能夠使得熱休克反應快速啟動。如在低氧和高溫下，比目魚的HSF1的表達水平被上調[20]。還有的研究將斑馬魚經過鎘前處理后再經過熱處理，其中HSF1和HSF2等轉錄因子在鎘預處理實驗組中，對熱處理更為敏感，在沒有預處理的對照組中，對熱處理不敏感，提示我們在尋找生物標志物時應該考慮生物是否有重金屬污染史[21]。

在本文的研究中，發現GrHSF1在低于或者高于最適溫度時處理七天，其表達量顯著下降與以前的研究結論高溫脅迫會導致HSF1和HSP90表達量顯著上調[20]不一致，與MDBK細胞(Mardin-darby bovine kidnedy 馬-達氏牛腎細胞)熱激0.5 h或1 h后HSP70轉錄水平上調，HSF1轉錄水平下降表達模式一致[22]。對植物的研究中發現，植物進行急性熱處理后HSFs表達上調，在慢性熱處理中表達幾乎不發生改變[23]，對雞胚成纖維細胞的研究表明不同的HSFs對溫度的閾值是不一樣的，重度熱休克處理導致HSF3的總量增加，HSF1的總量下降[24]，提示不同的HSFs對不同的熱處理具有不同的表達模式。除此之外，可能是因為當高溫(37 ℃)處理7天后，HSP70,HSP90等熱休克蛋白表達量增加達到一定豐度后對HSF1具有反饋抑制作用[25]；也可能是因為長時間的高溫處理造成稀有鮈鯽肝臟不可逆的損傷。

通過暴露實驗發現GrHSF1與PCP具有時間/濃度效應，在斑馬魚中，HSF1表達與鋅也具有濃度效應[26]。在對太平洋南美白對蝦(Litopenaeusvannamei)進行硫化物暴露處理時，發現較低濃度(425.5 μg/L)硫化物對HSF1的表達幾乎沒有影響，較高濃度(851 μg/L)硫化物導致HSF1的表達水平顯著提高[27]；在單環刺螠中，硫化物能夠以時間依賴的方式提高HSF1的表達，表明硫化物能夠以時間/濃度依賴的方式調控HSF1的表達水平[28]。越來越多的研究指出，環境污染物能夠在一定程度上調控HSF1，提示我們HSF1能夠作為環境污染物PCP的生物標志物。

總的來說，本文首次從稀有鮈鯽肝臟中克隆得到HSF1基因(GenBank登錄號：MK588748)并研究了PCP和溫度暴露下GrHSF1的表達模式。還需要進一步的研究指出GrHSF1是否能作為其他壓力環境下的生物標志物以及GrHSF1的蛋白水平變化，為GrHSF1作為生物標志物提供更多的理論依據。