中草藥添加劑對魯氏耶爾森菌感染虹鱒血液生化指標的影響

馮淇元，陸紹霞，徐 喆,4，王亞玲1,，李芳源,4，劉紅柏

(1.上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306；2.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，哈爾濱 150070；3.上海海洋大學農業(yè)農村部魚類營養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心，上海 201306；4.南京農業(yè)大學無錫漁業(yè)學院，江蘇無錫 214081)

虹鱒(Oncorhynchusmykiss)為世界性主養(yǎng)冷水魚類，富含不飽和脂肪酸、蛋白質、維生素、礦物質及微量元素等，已成為人類獲得重要營養(yǎng)的膳食之一[1]。虹鱒在養(yǎng)殖過程中面臨病原菌入侵[2]、密度過高[3]、溫度異常[4]、濫用藥物[5]的危害，這對其攝食、代謝、繁殖等有很大影響，甚至引起大規(guī)模的死亡。魯氏耶爾森菌(Yersiniaruckeri)是導致虹鱒患腸炎紅嘴病(enteric redmouth diseases,ERM)的主要致病菌，患病魚具體表現(xiàn)為體表變黑、眼球突出、下頜部點狀出血。該菌對各生長階段的虹鱒魚均可造成影響，尤其在虹鱒苗種階段由于其抵抗力差，造成的細菌性應激損傷更為嚴重[6]。

長期使用抗生素防治魚病會促使藥物殘留于水體[7]，導致細菌耐藥性增強，嚴重影響水產養(yǎng)殖健康發(fā)展[8,9]。中草藥作為水產動物抗應激添加劑的重要來源，具有抗菌、抗應激和提高機體免疫力等作用，楊移斌等[10]研究烏梅、地榆和杞子提取液對魯氏耶爾森菌的最小抑菌濃度，發(fā)現(xiàn)烏梅對魯氏耶爾森菌有良好抑菌效果。Baba等[11]用添加橄欖葉(OleaeuropeaL.)提取物的飼料投喂虹鱒，發(fā)現(xiàn)橄欖葉提取物可有效降低感染魯氏耶爾森菌虹鱒的死亡率，且與對照組相比，在感染魯氏耶爾森菌后脾臟中免疫基因的表達顯著上調。

中草藥的種類繁多，但存在單方使用量大和成本高的局限[12]，復方可根據機體和作用目的不同進行配伍，利用其相互間的協(xié)同或拮抗作用，提高藥物療效或減少不良反應[13,14]。目前，已有中草藥對虹鱒免疫、熱應激方面的研究[15,16]，而復方中草藥對虹鱒抗細菌性應激方面的研究卻未見報道。本實驗通過檢測兩種復方中草藥對魯氏耶爾森菌感染后虹鱒血液生化指標等變化，為進一步研究抗細菌性應激中草藥添加劑提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

健康、非免疫虹鱒(15±1)g購自遼寧省本溪市艾格莫林虹鱒養(yǎng)殖場；實驗用中草藥購自哈爾濱寶豐藥店，研磨粉碎后待用。

1.2 方法

1.2.1 中草藥方劑及藥料的制備

實驗所用復方1和復方2的質量各按照表1進行稱取，將配伍好的中草藥在砂鍋中浸泡30 min，加熱熬煮45 min后過濾倒出，再加清水熬煮30 min，合并兩次藥汁用電爐加熱濃縮藥物至1 g/mL，存放于4 ℃冰箱，根據藥物在飼料中添加量拌入全價基礎飼料。添加劑量的確定是根據各藥常用劑量及配比后的協(xié)同作用加減而來。

表1 實驗用復方配方和飼料中的藥物添加量Tab.1 Chinese herbs compounds of formulation and compounds content in fodder

1.2.2 養(yǎng)殖實驗

實驗分為對照組，復方1組和復方2組，養(yǎng)殖實驗期間均未攻毒，每組三個平行，每個平行40尾魚，水溫(15±1)℃，溶氧10 mg/L以上，虹鱒全價基礎飼料預飼2周。正式實驗期間，每天按魚體質量的3%投喂，對照組投喂不含中草藥的基礎飼料，日投喂3次，連續(xù)投喂28 d。養(yǎng)殖實驗開始前和結束后，對各組魚稱重，用于計算增重率。

W=100%×(Wt-W0)/W0

式中，W為增重率(%)，Wt為終末體質量(g)，W0為初始體質量(g)。

1.2.3 攻毒實驗及存活率統(tǒng)計

參考連浩淼等[17]用改良寇氏法計算72 h內虹鱒半致死菌液濃度為1.9×107CFU/mL。養(yǎng)殖實驗結束后，將對照組、復方1組和復方2組分為不攻毒組和攻毒組。對攻毒組魚用間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(MS-222)快速麻醉后腹腔注射0.1 mL濃度為1.9×107CFU/mL魯氏耶爾森菌，對應轉移至毒理實驗專用玻璃缸內(0.90 m×0.50 m×0.45 m)。此外，對不攻毒組魚腹腔注射0.1 mL無菌蒸餾水。根據張梟等[18]構建的虹鱒病理模型，統(tǒng)計感染后72 h各組的存活率作為虹鱒抗魯氏耶爾森菌感染的指標。

SR=100%×Nf/Ni

式中，SR為存活率(%)，Nf為終末魚尾數，Ni為初始魚尾數。

1.2.4 樣品采集

撈取各組感染前和感染后活魚9尾，于間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(MS-222)溶液中快速麻醉，用2 mL注射器采集尾部靜脈血液至1.5 mL離心管中，4 ℃靜置過夜后，4 ℃、4 000 r/min離心15 min，吸取上清液即為血清。血清保存于-20 ℃冰箱中待用。

1.2.5 血清生化指標分析

采用Beckman公司生產的CYNCHRON CH4 PRO全自動生化分析儀進行血清的檢測。檢測指標包括總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、白蛋白與球蛋白比(ALB/GLO)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、谷草轉氨酶與谷丙轉氨酶比(AST/ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、乳酸脫氫酶(LDH)、總膽紅素(TBIL)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TCH)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、尿酸(UA)、血糖(GLU)。

1.2.6 數據處理

實驗數據采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件中的單因素方差分析(One-way analysis of variance,ANOVA)進行統(tǒng)計，采用鄧肯氏法進行多重比較，P<0.05為顯著性判別標準。數據以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 飼喂不同復方中草藥對虹鱒增重率的變化

由表2可知，投喂28 d后，復方1和復方2組虹鱒的平均終末體質量與對照組相比無顯著性差異，復方1組和復方2組虹鱒增重率與對照組相比無顯著性差異，但復方中草藥組增重率高于對照組，說明兩種復方中草藥對虹鱒增重無不良影響。

表2 飼喂不同復方中草藥后對虹鱒體重的影響Tab.2 The effects of different Chinese herbs compounds on the weight of O.mykiss

注：同一列標有不同字母的數值表示差異顯著(P<0.05)；標相同字母的數值表示差異不顯著(P>0.05)。下同。

2.2 人工感染虹鱒存活率的變化

對各組魚腹腔注射0.1 mL 1.9×107CFU/mL的魯氏耶爾森菌，觀察各組虹鱒72 h內存活情況。由圖1可知，復方中草藥在投喂28 d后，能明顯提高虹鱒對魯氏耶爾森菌的抵抗力。對照組攻毒后，存活率為47.5%，復方1攻毒組與攻毒對照組和復方2組相比，存活率無顯著性差異。其中，復方2攻毒組存活率為57.5%，顯著高于攻毒對照組。

圖1 不同中草藥對感染魯氏耶爾森菌后的虹鱒存活率的影響Fig.1 Effects of different Chinese herbs compounds on the survival rate of O.mykiss infected with Y.ruckeri

2.3 飼喂不同復方中草藥對虹鱒血清生化指標的變化

2.3.1 虹鱒血清中蛋白含量的變化

由表3可知，攻毒后，各組TP、ALB和GLO含量相比攻毒前均有所降低，但復方2組TP、ALB和GLO含量明顯高于攻毒對照組。各組攻毒后白球比例無顯著性差異，但復方2組比值略高于對照組。

2.3.2 虹鱒血清中部分酶活性的變化

由表4可知，復方2組緩解魯氏耶爾森菌引起的應激效果較好。攻毒后，復方2組ALT活性低于對照組，兩組復方AST活性均低于對照組，對照組ALP活性降低了77.11%，復方1組降低了85.93%，復方2組降低了57.09%，復方2組的下降幅度小于對照組，且復方2組ALP活性明顯高于攻毒對照組。攻毒對照組LDH活性升高為原來的1.31倍，復方1組LDH活性雖有所升高，但低于攻毒對照組。復方2組LDH活性相比攻毒前降低了39.77%。

表3 飼喂不同復方后虹鱒血清中總蛋白、白蛋白、球蛋白及白/球蛋白比例的變化Tab.3 The contents of total protein,albumin,and globulin,and the ratio of albumin content to globulin content in the serum of O.mykiss by different Chinese herbs compounds

表4 飼喂不同復方后虹鱒血清中部分酶活性的變化Tab.4 The changes of enzyme activity in serum of O.mykiss fed with different Chinese herbs compounds U/L

2.3.3 虹鱒血清中總膽紅素、尿素氮、肌酐和尿酸含量的變化

由表5可知，復方中草藥組對腎臟具有一定保護效果。攻毒后，兩個復方組TBIL、BUN和CREA含量與對照組相比無顯著差異，UA含量均顯著低于攻毒對照組。

2.3.4 虹鱒血清中甘油三酯、總膽固醇和血糖含量的變化

由表6可知，攻毒后，兩個復方組TG和TCH含量與對照組相比無顯著性差異。但復方1組TG含量低于對照組，復方2組TG含量高于對照組，復方1組TCH含量低于對照組，復方2組TCH含量高于對照組。各組攻毒后血清葡萄糖含量無顯著性差異。

表5 飼喂不同復方后虹鱒血清中總膽紅素、尿素氮、肌酐和尿酸含量的變化Tab.5 The contents of total bilirubin,urea nitrogen,creatinine and uric acid in the serum of O.mykiss by different Chinese herbs compounds

表6 飼喂不同復方后虹鱒血清中甘油三酯、總膽固醇和血糖含量的變化Tab.6 The contents of triglycerides,total cholesterol and blood glucose the serum of O.mykiss by different Chinese herbs compounds mmol/L

3 討論

自然條件下魯氏耶爾森菌通過魚鰓和皮膚從血液擴散到其他組織[19]，而腹腔注射是常用的血源性感染細菌的方式[20]，因此，本實驗選取腹腔注射的方式來繞過體表防御機制。

黃芪能夠改善動物由中毒引起的應激，維持細胞膜及亞細胞結構的完整性，由金銀花、半枝蓮和扁蓄等醇提而成的藥液可通過延長細菌對數生長期的方式抑制其生長繁殖[21]。陶健等[22]采用二倍稀釋法研究了16種中藥單方及5種復方對魯氏耶爾森菌的最小抑菌濃度，發(fā)現(xiàn)黃芩抑菌效果最好，其MIC均為0.028 g/mL。而大黃、黃柏、黃芩復方按5∶3∶2的配比對魯氏耶爾森菌的抑菌效果最佳，其MIC為0.057 g/mL。因此，本實驗選取黃芩、大黃、黃柏等中草藥作為預防細菌性應激損傷的實驗藥物，其抑菌作用機理主要體現(xiàn)在對免疫器官、細胞及體液免疫的調節(jié)和對細胞因子的影響上。其中起調節(jié)機體免疫功能的成分主要有多糖、生物堿、蒽類、揮發(fā)油、有機酸等，主要通過抑制細菌細胞壁合成、破壞細胞膜通透性、干擾蛋白質和核酸合成等方式起到抑殺病菌的作用[23]。此外，中草藥有效成分也可激活網狀內皮細胞及補體，誘生多種細胞因子來調節(jié)魚體免疫力，進而起到防控目的[24]。

3.1 中草藥復方對虹鱒生長和抗魯氏耶爾森菌感染的影響

中草藥添加劑不僅能提高水產動物免疫力，還具有促生長，提高營養(yǎng)價值的作用[25]。本實驗中，投喂28 d中草藥復方后，復方組的增重率與對照組相比無顯著差異，說明飼喂兩種復方添加劑對虹鱒機體增重方面無抑制作用。

復方1組和復方2組在感染魯氏耶爾森菌后存活率均高于攻毒對照組，且復方2組存活率顯著高于攻毒對照組，復方1組存活率次之，攻毒對照組最低。表明兩種復方中草藥飼料添加劑能夠增強魚體感染魯氏耶爾森菌的抗應激能力，且復方2組效果較好。Adel等[26]在虹鱒飼料中補充刺蕁麻(Urticadioica)植物提取物，用魯氏耶爾森氏菌感染后觀察到飼喂不同水平的植物添加劑的實驗組死亡率在20%～50%，且添加3%刺蕁麻的實驗組死亡率最低，具有最高的抗性。Bulfon等[27]在虹鱒飼料中添加人參提取物進行了為期10周的投喂，魯氏耶爾森氏菌侵染實驗表明添加人參提取物的實驗組死亡率更低。本實驗中草藥提高實驗組存活率的結果與這相似。

3.2 中藥復方對虹鱒血清生化指標的影響

3.2.1 復方中草藥對虹鱒血清蛋白含量的影響

血清生化指標反映魚體的健康狀況，營養(yǎng)水平和生理狀態(tài)，魚體在應激環(huán)境中的變化必然會體現(xiàn)在血液中[28]。血液中總蛋白(TP)反映機體對蛋白質的吸收、合成、分解等代謝狀況。血清白蛋白(ALB)可以結合和運輸內源性與外源性物質，具有維持血液滲透壓，清除自由基，抗凝血等生理功能，而球蛋白(GLO)在一定程度上反映機體的免疫功能[29]。此外，肝臟是合成蛋白質的重要器官，肝細胞受損尤其影響ALB含量的降低[30]。紀利芹等[31]用添加β-葡聚糖的飼料飼喂虹鱒后，進行殺鮭氣單胞菌人工感染實驗，發(fā)現(xiàn)各攻毒組較攻毒前TP含量顯著降低。徐曉津等[30]用哈維氏弧菌感染大黃魚，研究發(fā)現(xiàn)病魚組蛋白含量均極顯著低于對照組。這與本實驗研究結果相一致，究其原因可能是被感染魚體自身消耗蛋白質，并且伴隨肝臟受損而蛋白質合成功能減退。本實驗組復方2攻毒后蛋白含量降低幅度小，且ALB含量明顯高于對照組，說明復方2對由魯氏耶爾森菌感染引起的肝臟損傷具有一定的保護作用。這種作用可能是復方2中含有的多糖、有機酸等營養(yǎng)活性物質，促進了細胞增殖和蛋白質的合成，抑制細胞凋亡，從而提高機體免疫和抗應激能力[32]。

3.2.2 復方中草藥對虹鱒血清部分酶活性的影響

谷丙轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)是肝臟中重要的指示酶，正常情況下，血清中轉氨酶活性較低，當機體受到應激損傷或者肝臟等組織發(fā)生病變時，細胞通透性增大，細胞破裂導致胞內酶進入血液，使血清中酶活性升高[33]。夏斌鵬等[33]對虹鱒采取慢性熱應激的研究，發(fā)現(xiàn)實驗組ALT和AST活性隨溫度的升高而升高，這與本實驗結果相似。本實驗復方2組感染后ALT活性低于對照組，這可能是由于復方2組抑制了細胞增殖活性的降低，調節(jié)多種細胞因子來保護肝細胞受損[13]。提示復方2組在病原菌入侵的情況下能夠改善轉氨酶活性異常上升，緩解肝臟受損的效果更好。堿性磷酸酶(ALP)可以加速物質的攝取，直接參與機體代謝過程，調控鈣磷比、參與合成和分泌蛋白質，為ADP磷酸化為ATP提供更多的無機磷酸[34]。另有文獻表明，ALP參與維護腸道微生物的動態(tài)平衡，在被致病菌感染情況下可以清除腸道內毒素，對腸道微生態(tài)環(huán)境具有一定調控作用[35]。本實驗中，復方1組攻毒后ALP活性顯著降低，而復方2組則顯著高于對照組，說明復方2能夠有效促進虹鱒在病原菌入侵情況下進行機體代謝，對腸道健康具有一定保護作用。乳酸脫氫酶(LDH)作為一種參與糖酵解和糖異生的重要酶類，大量存在于腎臟中。LDH釋放過多會轉化為乳酸，乳酸在組織內大量堆積將造成機體pH值下降，對機體營養(yǎng)物質代謝造成影響。本實驗中，復方2組LDH活性顯著低于對照和復方1組，說明復方2對腎臟具有一定的保護作用。

3.2.3 復方中草藥對虹鱒血清中總膽紅素、尿素氮、肌酐和尿酸含量的影響

血清中膽紅素(TBIL)主要由衰老紅細胞破壞后的血紅蛋白衍化而來，可作為評價肝組織損傷的指標之一[36]。血液中尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)和尿酸(UA)含量可作為判斷腎臟功能受損的指標[37]。而甘油三酯(TG)和總膽固醇(TCH)作為生命代謝的必需物質以不同的脂蛋白形式儲存于肝臟等細胞，能夠反映機體攝取和合成蛋白的能力[38]。當魚體受到應激因素影響時，其體內脂肪作為能源物質會被消耗。血糖(GLU)作為一種重要的能源物質，在魚體中處于一種動態(tài)平衡[38]，魚體健康狀況和外界應激因素都會影響魚體GLU的水平。紀利芹等[31]對飼喂β-葡聚糖的虹鱒進行殺鮭氣單胞菌的感染，研究發(fā)現(xiàn)，感染殺鮭氣單胞菌第4 d后，所有感染組血清TG和TCH含量顯著低于初始水平，且各組TG和TCH含量高于對照組，這與本實驗結果相似。本研究攻毒后，復方組除UA含量顯著低于對照組外，TBIL、BUN和CREA含量無顯著差異，復方2組TG和TCH含量感染前后變化幅度最小，說明在細菌感染過程中，復方中草藥組對腎臟功能造成的負擔較小，對腎臟代謝功能的損傷小，且復方2組一定程度減弱機體應激造成的肝臟損傷。之前的研究結果顯示，魚體處于應激環(huán)境時，GLU含量會有所升高。本實驗各組在感染魯氏耶爾森菌后GLU含量均有所降低，各組GLU含量無顯著性差異，這可能是由于機體為抵抗細菌應激而將葡萄糖分解為ATP來提供能量，使得血糖水平降低[39]。