四季蜜龍眼FLOWERING LOCUS T(FT)同源基因克隆及其表達分析

邱宏業，朱建華，丁 峰，潘介春，秦獻泉，徐 寧，李鴻莉，3，李冬波，彭宏祥，侯延杰，張樹偉

(1.廣西農業科學院園藝研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西作物遺傳改良重點開放實驗室，廣西 南寧 530007；3.農業部南寧南亞熱帶果樹科學觀測實驗站，廣西 南寧 530007；4.廣西大學，廣西 南寧 530004)

【研究意義】四季蜜龍眼(Longancv. Sijimi)是廣西農業科學院園藝研究所等單位引種選育、于2008年通過廣西農作物品種審定委員會審定的熱帶生態型龍眼新品種[1]。該品種不需要低溫誘導即能完成成花轉變，且一年可多次開花結果。已有研究對四季蜜龍眼幼葉和芽的SAM、LLFY、SVP、TFL和FLC基因進行克隆及以四季蜜龍眼嫩梢為材料進行轉錄組測序[2-5]，但均未檢測到葉片開花基因FLOWERINGLOCUST(FT)。本研究基于生長調節劑調控四季蜜龍眼夏季成花、秋冬季收果技術，對其成熟葉片中FT基因進行克隆和生物信息學分析，利用熒光定量PCR檢測其成花過程不同時期的表達情況，對進一步探討生長調節劑調控四季蜜龍眼夏季成花的機理具有重要意義。【前人研究進展】成花過程是開花植物生命周期中的一個關鍵時期，主要由經典的光周期途徑、年齡途徑、赤霉素途徑、春化途徑、自主途徑和新研究發現的相關途徑構成復雜成花誘導網絡，如多個成花調控途徑通過一些關鍵整合因子[SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCONSTANS1(SOC1)、FT、和LEAFY(LFY)]形成一個復雜的基因調控網絡對植物開花時間進行精密調控[6-11 ]。FT基因處在光周期途徑、春化途徑、常溫途徑、年齡途徑和赤霉素途徑等多條調控途徑的交叉點上，受到許多具有染色質重組功能基因和轉錄因子如CONSTANS(CO)[12-13]、APETALA2(AP2)[14-15]、SCHLAFMUTZE(SME)[16]、FLOWERINGLOCUSC(FLC)[17]、TEMPRANILLO1(TEM1)和TEMPRANILLO2(TEM2)[18]的調控，其表達最終導致植物從營養生長向生殖生長轉變，使植物成花。植物FT同源基因的超表達可抑制植物營養生長、促進營養芽進入花芽分化，進而使植物提早開花，如將楊樹的開花基因PtFT1和PtFT2分別轉入楊樹自身，以野生型植株作為對照，發現對照植株開花一般需5～10年，而轉基因植株在幾個月內即可開花[19]；將柑橘的CiFT基因導入歐洲梨，轉基因歐洲梨開花時間顯著提早[20]；將蘋果2個FT同源基因MdFT1和MdFT2分別轉入模式植物擬南芥，轉基因擬南芥均提早開花[21]。綜上所述，FT同源基因在植物成花調控過程中發揮了至關重要的作用?！颈狙芯壳腥朦c】目前，關于以多效唑(PP333)和乙烯利處理四季蜜龍眼不同成熟時期葉片開花基因FLOWERINGLOCUST(FT)表達的研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】基于生長調節劑調控四季蜜龍眼夏季成花的技術，對其成熟葉片中FT基因進行克隆和生物信息學分析，利用實時熒光定量PCR檢測其成花過程不同時期的表達情況，探究生長調節劑調控四季蜜龍眼夏季成花過程中成花基因FT的動態變化，為探討生長調節劑調控四季蜜龍眼夏季成花機理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試四季蜜龍眼2010年3月種植于廣西農業科學院里建科研基地，采集樣品時間為2014年5-6月。主要試劑：核酸染料SYBR?Premix E×TaqTM、TaKaRaPrimeScriptTMRT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒、TaKaRa PrimeScriptTMⅡ1st Stand DNA Synthesis Kit試劑盒、PremieSTAR Max Premix酶、DL2000 DNA Marker、RNase Inhibitor、Recombinant DNaseI、RNase Free dH2O及克隆載體pMD18-T劑購自TaKaRa公司；Tris-NaAc-EDTA Buffer(TAE)、Tris-HCl-EDTA buffer(TE)、Diethyl Pyrocarbonate(DEPC)和氨芐青霉素(Amp)均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；超快新型植物RNA提取試劑盒(Quick RNA Isolation Kit)購自北京華越洋生物科技有限公司；DH5α大腸桿菌感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 試驗設計

按照四季蜜龍眼夏季成花技術要求，在四季蜜龍眼二次梢老熟、頂芽未萌動時葉面噴施500.0 mg/L PP333和126.9 mg/L乙烯利混合液1次，7 d后再葉面噴施250.0 mg/L PP333和126.9 mg/L乙烯利混合液1次。單株重復5次。

葉片采集：于第1次噴施PP333和乙烯利混合液前(5月28日)采樣1次(0 d)，處理后1、3、5、8、12、16、20和25 d各采樣1次，共采樣9次。約在上午10：00選取供試植株無病蟲梢，采集從頂部往下數第2～3張復葉的第2和3張小葉。每條無病蟲梢采集1～2張小葉，每株每次約采集15張葉片。所采集葉片用液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.3 四季蜜龍眼FT同源基因克隆

1.3.1 總RNA提取及DNA消化 采用改良的RNA提取試劑盒Quick RNA Isolation Kit提取四季蜜龍眼葉片總RNA，用1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取RNA完整性，用超微量紫外分光光度計檢測所提取RNA 的OD260/OD280純度值和濃度。采用TakaRa公司的DNA酶DNase I處理所提取總RNA樣品中殘留的DNA。

(1)將室溫12 000 r/min、離心10 min改為室溫12 700 r/min、離心10 min。

(2)收集RNA時將洗脫液的體積改為70 μl；將12 000 r/min、離心1 min改為12 700 r/min、離心2 min。

1.3.2 cDNA第一條鏈合成 經檢測合格的RNA樣品參照反轉錄試劑盒TaKaRa PrimeScriptTMⅡ1st Stand DNA Synthesis Kit(用于基因克隆)和TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit With gDNA Eraser(用于熒光定量PCR)說明反轉錄合成cDNA，-80 ℃冰箱保存備用。

1.3.3FT同源基因克隆 根據NCBI數據庫已公布的其他龍眼品種FT同源基因序列，通過Primer 5.0設計包含完整開放閱讀框(ORF)的特異引物，序列如下。FT1-F：5′-CAACCAACAATATTTCACCTGAA-3′,FT1-R：5′-TGGTGTGGGAAACATAGAGA AG-3′,FT2-F：5′-CTTGAATATTTTTGTTTAACACTAC-3′,FT2-R：5′-TTATACGGATTTTGCTAGATAGTTA-3′。

以cDNA為模板，以特異引物FT1-F/FT1-R和FT2-F/FT2-R進行PCR擴增，反應體系25.0 μl：2.5 μl E×TaqBuffer，1.0 μl cDNA，0.5 μl dNTP，引物各1.0 μl，0.16 μl E×TaqDNA酶，18.84 μl RNase free dH2O。擴增程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃ 40 s，55.5 ℃ 40 s，72 ℃ 2 min，進行35個循環；72 ℃延伸10 min，10 ℃停止反應。PCR擴增產物分別進行回收純化連接pMD18-T后，轉至DH5α感受態細胞，進行藍白斑篩選和菌液PCR鑒定，將陽性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，對測序結果進行比對分析。采用同源克隆的方法，利用特異引物對混合cDNA模板進行PCR擴增，經過瓊脂糖凝膠電泳、膠回收、片段連接、轉化大腸桿菌、菌液PCR驗證及陽性克隆去公司測序等步驟，成功獲得2個四季蜜龍眼FT同源基因cDNA全長序列，命名為DlFT1和DlFT2。

1.3.4 生物信息學分析 通過NCBI檢索獲得四季蜜龍眼FT同源基因DlFT1和DlFT2的同源性；利用BioXM 2.6預測基因編碼蛋白；利用ExPaSy提供的在線Protparam軟件(http://web.expasy.org/protparamy)對蛋白一級結構的理化特性進行分析；利用ExPaSy提供的在線SOPMA程序(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/NPSA/npsa_server.html)進行蛋白二級結構預測分析；利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)預測蛋白三級結構；利用MEGA 4.1構建多物種FT同源基因系統進化樹。

1.3.5 實時熒光定量PCR 熒光定量PCR所用儀器為LightCycler?480實時熒光定量PCR儀，核酸染料為SYBR?Premix E×TaqTM，2次生物學重復，3次技術重復。根據克隆測序獲得的四季蜜龍眼FT同源基因cDNA序列，采用Primer 5.0設計定量特異引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以在各組織及條件下穩定表達的龍眼EF1α基因為內參基因[22]。熒光定量PCR引物為：DlFT1-F：5′-AGTGACCCAACCCTGAGAGA-3′;DlFT1-R：5′-ACTGTCTGCCTGCCTTGTT-3′;DlFT2-F：5′-GCTACACTTTGGTTA TGGTGGA-3′;DlFT2-R：5′-ATAGTCTGCCTGCTCGGTTG-3′;DlEFla-F：5′-GATGATTCCCACCAAGCCCAT-3′;DlEFla-R：5′-GGGTCCTTCTTCTCAACACTCT-3′。

2 結果與分析

2.1 序列分析

從圖1～2可看出，四季蜜龍眼FT同源基因DlFT1和DlFT2cDNA的全長序列分別為893和753 bp，對二者的氨基酸序列與基因序列進行分析比對，結果表明，DlFT1和DlFT2基因的ORF均為525 bp，各編碼174個氨基酸，DlFT1基因與DlFT2基因的核苷酸同源性為90.00 %，二者所編碼蛋白存在24個氨基酸殘基差異。

從圖3可看出，利用DNAMAN 軟件將從NCBI中檢索獲得的6個其他物種FT同源基因序列與四季蜜龍眼的2個FT基因序列進行序列比對，結果發現8個序列的同源性為46.69 %；而涂黑區域的同源性為100.00 %。四季蜜龍眼2個FT基因序列的ORF長度與其他FT基因序列的ORF長度均相似，約525 bp，均編碼約174個氨基酸。

圖1 四季蜜龍眼DlFT1和DlFT2基因的氨基酸殘基序列比對

圖2 四季蜜龍眼DlFT1和DlFT2基因核苷酸序列比對分析

2.2 生物信息學分析

對四季蜜龍眼DlFT1合DlFT2蛋白的理化性質(氨基酸數目、分子量、理論等電點、脂肪族氨基酸指數和蛋白質疏水性等)進行預測分析，結果如表1所示。2個蛋白序列的蛋白質疏水性(GRAVY)均為負值，說明四季蜜龍眼的DlFT1和DlFT2蛋白均為親水蛋白。

通過ExPaSy提供的在線SOPMA程序對四季蜜龍眼FT同源基因編碼蛋白進行二級結構分析，得知其蛋白的二級結構主要由α-螺旋、β-折疊、轉角、延伸鏈和無規則卷曲組成。2個FT蛋白二級結構主要以豐富的β-折疊(DlFT1，28.16 %；DlFT2，27.59 %)和無規則卷曲(DlFT1，39.66 %；DlFT2，47.13 %)2種形式存在，其次是α-螺旋(DlFT1，19.54 %；DlFT2，14.37 %)。

a：桃(EU939302)；b：蘋果(AB161112)；c：向日葵(GU985573)；d：水稻(AB052944)；e：擬南芥(AB465586)；f：荔枝(JN214350)；g：龍眼(DlFT1)；h：龍眼(DlFT2)a：Prunus persica(EU939302)；b：Malus x domestica(AB161112)；c：Helianthus annuus(GU985573)；d：Oryza sativa(AB052944)；e：Arabidopsis halleri(AB465586)；f：Litchi chinensis(JN214350)；g：Dimocarpus longan(DlFT1)；h：Dimocarpus longan(DlFT2)

表1 四季蜜龍眼DlFT1和DlFT2蛋白的理化性質分析

利用SMART 網站http://smart.embl-heidelberg.de/預測的蛋白三級結構如圖4～5所示。DlFT1和DlFT2蛋白含有PEBP-euk特殊結構域，每個蛋白均含有7個結構域，但位置略有差異，屬于PEBP基因家族的FT-Like蛋白亞家族。

2.3 FT同源基因的系統發育分析

利用MEGA 4.1構建多種植物FT同源基因編碼蛋白的系統發育進化樹，結果如圖6所示。四季蜜龍眼的FT同源基因首先與無患子科的荔枝(JN214350和JN214351)和龍眼(KF881012.1、KF881011.1和KF881010.1)聚在一類，親緣關系最近；DlFT1基因所編碼的氨基酸序列與龍眼(KF881010.1)所編碼的氨基酸序列完全一致；DlFT2基因所編碼的氨基酸序列與龍眼(KF881012.1)所編碼的氨基酸序列完全一致；DlFT1基因所編碼的氨基酸序列與荔枝(JN214350和JN214351)所編碼的氨基酸序列分別相差24和21個；DlFT2基因所編碼的氨基酸序列與荔枝(JN214350和JN214351)所編碼的氨基酸序列分別相差15和6個；DlFT1和DlFT2與擬南芥(雙子葉植物)親緣關系較近，與水稻(單子葉植物)的親緣關系較遠。綜上所述，FT基因在雙子葉植物和單子葉植物間、不同科屬植物間及同種物種中存在分化，說明重要的開花基因FT在植物進化過程中有所保守，但也在不斷進化。

2.4 實時熒光定量PCR分析結果

采用實時熒光定量PCR分析生長調節劑處理四季蜜龍眼后不同時期成熟葉片的DlFT1和DlFT2基因表達情況，結果如圖7所示。田間觀察四季蜜龍眼成花調控處理后的成花過程：①頂芽萌動時期(3～7 d)，此時期頂芽由未萌動的葉芽狀態逐漸伸長，由僵硬變軟，絲狀小葉伸展；②花序原基出現期(8～12 d)，絲狀小葉腋間出現花序原基(又稱紅點)，逐漸生長為混合花芽；③花穗生長期(12～24 d)，混合花芽繼續生長，絲狀小葉逐漸脫落，花穗主、側軸生長，花蕾形成；④花期(25 d后)，花穗中的小花陸續開放。綜合田間觀察和實時熒光定量PCR分析結果，在生長調節劑處理的0～8 d，即四季蜜龍眼花芽分化的關鍵期，DlFT1基因在成熟葉片中表達量呈波動性變化，總體上呈上升變化趨勢(但在處理12 d時有明顯下降現象)，在處理12 d后，即花器官發育和開花期，DlFT1基因在成熟葉片中的表達量明顯升高(圖7-A)，而DlFT2基因的表達量隨著生長調節劑處理時間的延長(除在處理12 d時有明顯下降現象外)總體上呈上升變化趨勢(圖7-B)。

圖4 DlFT1蛋白保守結構域預測分析

圖5 DlFT2蛋白保守結構域預測分析

圖6 基于植物FT同源基因編碼蛋白氨基酸序列同源性構建的系統發育進化樹

3 討 論

因四季蜜龍眼屬于多酚多糖植物，提取其高質量的RNA較困難。本研究對四季蜜龍眼葉片RNA提取方法進行適當的優化改進，提取獲得的RNA純度高、條帶清晰、完整性好，OD260/OD280值在1.90左右，OD260/OD230值在2.10左右，且穩定性較好，可滿足后續分子生物學研究的要求。

A：DlFT1基因的表達情況；B：DlFT2基因的表達情況A：Relative expression levels of DlFT1 gene assayed with RT-qPCR；B：Relative expression levels of DlFT2 gene assayed with RT-qPCR

由于FT同源基因在植物成花調控中具有整合因子的作用，即多個成花調控途徑均匯聚于此，使得FT基因的分離克隆及功能研究得到迅速發展，且近年來對FT基因的研究更深入，相繼成功克隆獲得葡萄(Carmonaet al.，2007)[23]、大豆(胡瑞波，2009)[24]、薔薇科植物(左陽，2010)[25]、荔枝(Ding et al.，2015)[26]等物種的FT基因，但有關龍眼FT基因的研究僅見Heller等[22]克隆出龍眼的3個FT基因。

本研究克隆四季蜜龍眼DlFT1和DlFT2基因的cDNA編碼區與GenBank數據庫中的龍眼FT基因KF881010.1和KF881012.1具有99.00 %的同源性。其中，DlFT1和DlFT2基因的ORF均為525 bp，各編碼174個氨基酸，DlFT1與DlFT2基因的核苷酸高度同源，同源性達90.00 %，二者的氨基酸序列存在24個氨基酸殘基差異，但其編碼蛋白的二級和三級結構相似。由此推測編碼DlFT1和DlFT2基因在功能上有所保守的同時，也在向不同的方向進化。Banfieid等[27]研究認為，FT基因不同物種間位于第70和74位的D-P-D-X-P基序、第86位的組氨酸殘基、第115和118位的G-X-H-R基序具有顯著的序列同源性區域。本研究獲得FT基因編碼的蛋白含有上述高度保守區域結構，推測四季蜜龍眼FT同源基因和其他物種的FT同源基因高度保守，且在蛋白空間結構及結構域上高度相似，即不同物種的FT同源基因功能具有相似性。

本研究還發現，在植物生長調節劑處理四季蜜龍眼葉片的0～8 d，其DlFT1基因的表達量總體上呈波動性上升變化趨勢，而DlFT2基因的表達量隨著處理時間的延長呈總體上呈上升變化趨勢，在處理8 d時四季蜜龍眼已出現花序原基；在植物生長調節劑處理12 d時二者的表達量明顯下降，可能與噴施第2次PP333和乙烯利混合液有關；DlFT1和DlFT2基因的相對表達量在植物生長調節劑處理后3～8 d(頂芽萌動期和花序原基出現期)較處理后8～25 d(花器官發育及開花階段)有明顯上升趨勢，分別在處理的20和25 d(初花期)達最大值，推測DlFT1和DlFT2基因在PP333和乙烯利誘導四季蜜龍眼成花轉變過程中發揮了關鍵作用，且DlFT2基因起主導作用，但2個基因的功能也可能有所不同。為進一步探索DlFT1和DlFT2基因在PP333和乙烯利誘導四季蜜龍眼成花轉變過程中的作用，還需構建DlFT1和DlFT2基因的超表達載體，并轉入擬南芥中進行功能驗證。

四季蜜龍眼成花調控除與其生長特性有關外，還受營養物質、光照、水分及溫度等外界環境的影響，但這些影響與重要開花基因間的關聯尚待進一步探究。

4 結 論

四季蜜龍眼FT同源基因DlFT1和DlFT2均屬于PEBP基因家族的FT-Like蛋白亞家族，在PP333和乙烯利誘導四季蜜龍眼成花轉變過程中發揮關鍵作用，且DlFT2起主導作用。