慢病毒載體介導穩定表達Cpf1的細胞系的構建及其基因編輯效率驗證

覃鴻妮，謝鈺珍，陳 罡，密苗苗，彭賽男, 張 勇*

(1.蘇州工業園區服務外包職業學院，江蘇 蘇州 215123；2.金唯智生物科技有限公司，江蘇 蘇州 215123；3.斯澳生物科技(蘇州)有限公司，江蘇 蘇州 215123)

【研究意義】慢病毒載體是一種強大、靈活的載體工具，可以在體外和體內將基因轉移至分裂細胞和非分裂細胞。慢病毒載體因為其獨有的特點，在近年引發了不同領域的關注，這些載體被大量的應用在基礎生物學研究和人類基因治療等領域[1-7]。【前人研究進展】CRISPR短回文重復序列的研究始于1987年[8-9]；2013年，張峰等首次在哺乳動物基因組中使用CRISPR-Cas9系統并成功的達到了基因編輯的效果，這使CRISPR系統成為了遺傳研究領域的一項革命性技術[10]。2015年，張峰研究組又發現了2種可在人體細胞中實現目的片段的插入和缺失的蛋白即AsCpf1和LbCpf1[11]。目前，研究者們發現CRISPR系統在動物品種改良及生物醫學領域具有極大的潛力[12]。【本研究的切入點】本研究探索利用慢病毒能有效的將CRISPR-Cpf1系統中LbCpf1和AsCpf1蛋白整合到293 T和HT 1080細胞基因組中，通過抗性篩選以及熒光標記篩選得到穩定表達LbCpf1和AsCpf1蛋白的細胞系，對該細胞系進DNA、RNA水平鑒定，并通過DNA特異性和T7E1酶切驗證基因敲除效率。【擬解決的關鍵問題】希望能夠通過該技術在人的腎細胞或腫瘤細胞中實現致病基因的敲除，從而對基因治療的效果起到一定的幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

DH5α 感受態細胞購于康為世紀生物科技有限公司(中國)，Top10感受態細胞由金維智生物科技有限公司保存。293T 細胞、293FT 細胞及HT 1080細胞，psPAX2、pMD2.G和Cas9 in pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro均由金維智生物科技有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 重組慢病毒載體的構建和包裝 根據AsCpf1、LbCpf1基因編碼序列基因編碼序列各設計2對引物，通過PCR方法擴增出片段LbCpf1-1A，LbCpf1-1B，AsCpf1-1A和AsCpf1-1B。擴增條件為：96 ℃，預變性3 min；95 ℃，變性25 s，Tm為61 ℃ 25 s，↓0.2 ℃/C，退火25 s，72 ℃延伸1 min 20 s；擴增循環數為30；72 ℃再延伸2 min，取適量PCR產物進行跑膠檢測回收。將回收產物用BamH I(FD)和NotI(FD)酶切后連接至CMV-GFP-P2A-Puro(BamH I/NotI)載體，轉化至top 10/top 10 F感受態細胞，提取質粒進行酶切和測序鑒定(表1)。

培養至第三代的6皿293FT細胞生長密度達到70 %時可進行三質粒病毒包裝(轉染)實驗，在此之前曾經做過轉染試劑PEI與Fugen轉染效率的對比，結果可得PEI轉染效率高于Fugen,構建的重組質粒與PSPAX2、PMD2G 3種質粒之比為1∶2∶0.4；總質粒與轉染試劑之比為1∶3。室溫靜止15 min后，將培養皿中的培養液換為新的10 % FBS DMEM，混勻后的溶液孵育15 min，后將培養皿從培養箱中取出，逐滴加入已靜置完的混合液各500 μl，輕輕晃動致混勻，培養48 h后收集包含病毒的細胞上清，顯微鏡下觀察熒光亮度。

1.2.2 慢病毒轉導和細胞篩選 將293T細胞放置顯微鏡下觀察，細胞總體數量75 %以上，進行6孔板分裝操作，培養細胞至第三或第四代時，將其傳至6孔板中。用Cas9病毒進行2種梯度20 μl與40 μl感染，期間加入聚凝胺提高Cas9病毒感染293T細胞的效率，培養數小時后，在熒光顯微鏡下觀察病毒感染情況。效果較好繼續進行96孔板分裝實驗，將1孔生長120 h后細胞胞放置顯微鏡下觀察，在顯微鏡下數清楚每16格中細胞的數量。按照1∶5的比例，總共96孔所需293T細胞液5 mL，總共分裝4個96孔板所需細胞液20 μl，其余培養基為40 mL，并加入120 μl嘌呤，分成4管混勻。96孔板容量為500 μl，將細胞液與培養基(20 % FBS)，嘌呤混勻，進行分裝置96孔板中。放入5 % CO2，37 ℃培養箱培養數天后從96孔板擴大培養至24孔板、6孔板、T25瓶甚至10 cm培養皿。

表1 引物序列

圖1 Lbcpf1片段PCR擴增電泳圖

圖2 Lbcpf1、AsCpf1片段 PCR擴增電泳圖

1.2.3 單克隆細胞的基因組及反轉錄鑒定 將挑選出的Cpf1-239T單克隆細胞提取基因組，并用其產物進行DNA特異性擴增，驗證Cpf1基因是否成功整合進239T細胞中。將挑選出的Cpf1-239T單克隆細胞用哺乳動物RNA抽提試劑盒提取RNA后進行RNA反轉錄實驗，反轉錄為cDNA后用PCR擴增CAS9基因，擴增條件為：98 ℃，預變性5 min；98 ℃，變性30 s，Tm為60 ℃，退火30 s，72 ℃延伸30 s；擴增循環數為30；72 ℃再延伸2 min；取適量PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 sgRNA轉染單克隆細胞驗證基因編輯效率 以三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白(ATP-binding cassette, ABC)超家族中的一個成員ABCG1基因為目的基因，在蛋白質編碼區(CDS區)第2個外顯子設計sgRNA并交由金唯智生物科技有限公司合成。將成功驗證的單克隆細胞分裝至6孔板中培養，并將設計的sgRNA轉染于單克隆細胞中，每孔轉入4 μg質粒sgRNA，轉染數天后在熒光顯微鏡下觀察細胞紅光效率情況，并提取基因組，用其產物與引物ABCG1-Exon2 Fn/Rn進行擴增驗證，取適量PCR產物進行7E I酶切，37 ℃，30 min后瓊脂糖凝膠電泳檢測。

Lane 1～4：均為載體酶切產物；M為5 kb ladder

2 結果與分析

2.1 重組慢病毒載體的構建

LbCpf1-1A的理論值為1.9 Kb，由圖1可知，4條擴增產物條帶大小均在1.5～2 Kb左右與其理論值基本一致，可判斷目的基因擴增成功；圖2中LbCpf1-1B、AsCpf1-1A和AsCpf1-1B的擴增產物條帶大小均在1.5～2 Kb左右，與其理論值1.9 和2.1 Kb基本一致，可判斷目的基因擴增成功。利用BamH I/NotI酶酶切目的載體CMV-GFP-P2A-Puro，由圖3可知，圖中酶切產物條帶大小在9 Kb左右與理論值9 Kb一致，可判斷質粒構建成功。將涂布37 ℃過夜培養的平板挑白斑進行PCR菌檢反應，并將菌檢正確菌液送測后發現測序正確。

2.2 慢病毒轉導和細胞篩選

2.2.1 慢病毒包裝熒光檢測 圖4 a為陰性對照即無構建的慢病毒質粒包裝轉染圖，圖b為Cpf1-pLent慢病毒三質粒包裝轉染293 FT細胞48 h后熒光圖，由圖可知，陰性對照無熒光，可判斷慢病毒包裝實驗成功。

圖4 Cpf1-pLent轉染對比圖

圖5 Cpf1-pLent病毒滴度檢測圖

A：AsCpf1-293T細胞熒光圖；B：AsCpf1-HT 1080細胞熒光圖；C：LbCpf1-293T細胞熒光圖；D：LbCpf1-HT1080細胞熒光圖

2.2.2 病毒滴度檢測圖 圖5為慢病毒對HT 1080細胞進行的梯度感染實驗，根據圖中細胞熒光的亮度可初步判斷病毒的滴度在106TU/mL之上，病毒滴度較高。

2.2.3 單克隆細胞系篩選 ①6孔板細胞病毒感染。圖6為用AsCpf1-pLent、Lbcpf1-pLent病毒感染培養120 h之后的6孔板細胞，由圖可知細胞生長良好，AsCpf1-pLent、LbCpf1-pLent病毒感染的293 T細胞感染效率較高，后面對這2種細胞進行了進一步的加藥單克隆細胞篩選。②96孔單克隆細胞。圖7為LbCpf1、AsCpf1病毒感染后的6孔板細胞加藥(Puro)分的96孔板單克隆細胞，由圖7可知，此次初篩的單克隆細胞較為單一，轉染效率較高，為了進一步確定其是否為單細胞及其轉染效率，后面對其進行了一系列的驗證。

2.2.4 AsCpf1-pLent、LbCpf1-pLent基因組驗證 用特異性引物對AsCpf1-pLent、LbCpf1-pLent基因進行擴增，由圖8可知，AsCpf1-pLent、LbCpf1-pLent基因能被特異性引物擴增且條帶與目的條帶一致，這初步表明AsCpf1-pLent、LbCpf1-pLent基因成功被細胞表達。

A：sCpf1-293T-7D白光圖；B：AsCpf1-293T-7D熒光圖；C：AsCpf1-HT1080 02-3B白光圖；D：AsCpf1-HT1080 02-3B熒光圖；E：LbCpf1-293T-01-7G白光圖；F：LbCpf1-293T-01-7G熒光圖；G：LbCpf1-HT1080-01-3B白光圖；H：LbCpf1-HT1080-01-3B熒光圖

Lane 1、Lane 2：以LbCpf1-293 T-01-7G細胞DNA和原質粒LbCpf1-pLent為模板用LbCpf1-2F/2R引物擴增的檢測條帶；Lane 3、Lane 4、Lane 5：以AsCpf1-HT1080 02-3B細胞DNA和AsCpf1-293 T-7D細胞DNA及原質粒AsCpf1為模板用AsCpf1-2F/2R引物擴增的檢測條帶；Lane 6：以H2O(對照)為模板用任意F/R引物擴增的檢測條帶

2.2.5 AsCpf1-pLent、LbCpf1-pLent基因反轉錄驗證 用反轉錄的方式進一步驗證AsCpf1、LbCpf1基因有無被表達，由圖9可知，AsCpf1-pLent、LbCpf1-pLent cDNA能被特異性引物擴增且條帶為300 bp左右與目的條帶一致，這表明AsCpf1-pLent、LbCpf1-pLent基因在細胞內發生編輯即含AsCpf1、LbCpf1基因的293 T和HT 1080單克隆細胞系構建成功。

2.2.6 T7E I酶切驗證 利用ABCG1-Exon2 F/R作為引物擴增所抽提的Cpf1-sgRNA細胞的基因組，此時無法正確結合部分會凸起，T7E I酶切便可看出明顯掉帶，判斷出其整合最好的單克隆系。由圖10可見，AsCpf1-293 T-7D和AsCpf1-HT1080 02-3B在T7E I的酶切后掉下的條帶清晰，LbCpf1-293 T-01-7G無明顯掉帶，所以整個實驗中篩選出的AsCpf1-293 T-7D和AsCpf1-HT1080 02-3B是最優單克隆細胞系。

Lane 1、Lane 2：以LbCpf1-293T-01-7G細胞cDNA和293 T(對照)cDNA為模板用LbCpf1-2F/2R引物擴增的檢測條帶；Lane 3、Lane 4：分別以AsCpf1-HT1080 02-3B細胞cDNA和HT1080(對照)cDNA為模板用AsCpf1-2F/2R引物擴增的檢測條帶

Lane1：AsCpf1-293 T-7D產物+H2O；Lane2：AsCpf1-293 T-7D產物+T7E1酶；Lane3：AsCpf1-HT1080 02-3B產物+H2O；Lane4：AsCpf1-HT1080 02-3B產物+T7E1酶；Lane5：LbCpf1-293 T-01-7G產物+H2O；Lane6：LbCpf1-293 T-01-7G產物+7E1酶；Lane M：Marker DS5000

3 討論與結論

慢病毒是目前常用的構建穩轉細胞系的一種方法，比起用質粒直接轉染細胞，操作較為復雜，但是慢病毒能將外源基因有效穩定整合到細胞染色體中，所以該方法效率高，而且篩選出的單克隆基本沒有假陽性[13-17]。本研究正是利用慢病毒能夠實現外源基因高表達的特點，首先構建含Cpf1基因和具有Puro抗性的慢病毒載體，通過慢病毒包裝(三質粒系統)的方式轉染293 FT細胞，48 h后，通過收集、濃縮和純化細胞上清得到高低度的病毒，再用病毒感染293 T和HT 1080細胞，通過嘌呤抗性和熒光標記篩選得到Cpf1穩轉細胞系，構建了含Cpf1基因的穩轉細胞系。該細胞系理論上可直接用于任意目的基因的敲除，研究人員只需根據細胞靶位點設計sgRNA轉染至Cpf1穩轉細胞系中，效應蛋白便會識別sgRNA位點并進行切割從而達到細胞系目的基因敲除的目的。本文還對構建好的Cpf1穩轉細胞系的功能進行了驗證，靶基因選擇了三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白(ATP-binding cassette, ABC)超家族的1個成員ABCG1基因，用設計好的針對ABCG1基因的sgRNA轉染單克隆細胞，通過DNA特異性和T7E1酶切驗證基因敲除效率，表明慢病毒載體介導穩定表達Cpf1的293T和HT 1080細胞系各1個。