克雷伯氏菌果膠酸裂解酶基因K-PGL的獲取與序列分析

孔衛青，楊金宏

(安康學院 陜西省蠶桑重點實驗室, 陜西 安康 725000)

【研究意義】果膠是廣泛存在于植物細胞間隙和初生壁中的一組多糖，是植物細胞組織間的粘合劑。構成果膠的基本單元是不同酯化度的D-半乳糖醛酸，以(α-1,4糖苷鍵相連接作為主鏈，以木糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖等連接在其主鏈上作為支鏈[1]。果膠與病源微生物對植物的侵染[2]，花粉管萌發、花粉胞壁擴張和果實的成熟[3]，植物枝葉飼用價值的提高等方面關系密切[4]。果膠酶是一類分解果膠物質的酶的總稱，廣泛應用于紡織、食品、飼料、造紙、含果膠工業廢水處理及生物技術等行業，是研究的熱點[5]。果膠酸裂解酶(Pectate Lyase，PL)又稱多聚半乳糖醛酸酶，是果膠酶的一種，通過裂解低甲酯或脫甲基的同型聚半乳糖醛羧之間的(α-1,4糖苷鍵，降解細胞壁中果膠物質[6]?！厩叭搜芯窟M展】果膠酸裂解酶可由植物、真菌、細菌和部分昆蟲產生[7]，在洗衣和紡織品處理等需要中性或堿性條件下的工藝中有良好效果[8]?？死撞暇鷮偈莵碜阅c桿菌科的一種革蘭氏陰性桿菌，該菌廣泛分布于自然界，不同的克雷伯氏菌能夠分泌不同的胞外酶，如纖維素酶、蛋白酶、卵磷脂酶、果膠酸裂解酶等[9-12]，其中部分具有重要的利用價值，如KlebsiellaplanticaL03[13]、KlebsiellaoxytocaYN201309[14]、Klebsiellavariicla[15]，分布于植株根部，是一種根系聯合固氮微生物資源；Klebsiellasp. Y1果膠酸裂解酶的低溫活性在紡織工業具有重要應用[16]?！颈狙芯壳腥朦c】根據NCBI登錄的克雷伯氏菌屬基因組分析，僅部分菌株具有果膠酸裂解酶基因，其獲得和缺失的原因尚不明確，而且未見對克雷伯氏菌屬果膠酸裂解酶基因的生物信息學研究的報道?！緮M解決的關鍵問題】克雷伯氏菌AKB01具有胞外果膠酸裂解酶活性，本研究獲得了其果膠酸裂解酶基因，并分析其結構特征、氨基酸組成，菌屬之間的系統發育關系，為進一步果膠酸裂解酶的生物學功能及其利用研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌種的培養

克雷伯氏菌AKB01從新鮮蠶沙中分離，保存于安康學院陜西省蠶桑重點實驗室分子生物學實驗分室。挑取單菌落，接種于發酵培養基(葡萄糖1.0 %，酵母膏0.5 %，pH 8.6)，30 ℃，160 r/min，培養過夜，備用。

1.2 菌株基因組的提取與果膠酸裂解酶基因的擴增

利用細菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技北京有限公司，DP302)提取培養的克雷伯氏菌的基因組DNA，根據NCBI已登錄的克雷伯氏菌屬基因組注釋的果膠酸裂解酶基因的序列，設計2條兼并引物PLF和PLR(表1)，擴增果膠酸裂解酶基因的核心保守序列。PCR擴增反應條件為：變性95 ℃ 5 min；30 個循環：94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min；終延伸72 ℃ 10 min。

1.3 果膠酸裂解酶基因全長序列的獲取

根據果膠酸裂解酶基因已知序列設計1對N端擴增引物5BF和5BR(表1)，對N端序列進行擴增；設計2條C端擴增引物3BSP1和3BSP2(表1)，與TaKaRa染色體步移試劑盒中的AP1引物進行巢式PCR，擴增基因的C端序列。

表1 文中使用引物序列

1.4 序列結構與特征分析

Bioedit v7.2.5對序列進行拼接[17]，SignalP 5.0預測信號肽及切割位點 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)。在線Protparam軟件(https://web.expasy.org/protparam/)預測蛋白分子量和等電點，NCBI在線CDD預測基因結構域(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)，SOPMA軟件預測蛋白質二級結構(https://npsa-prabi.ibcp.fr)。

1.5 進化分析

NCBI下載腸桿菌科不同克雷伯氏菌屬的果膠酸裂解酶序列，Clustal X 1.83軟件對下載序列進行多序列比對[18]，MEGA X軟件的極大似然法(Maximum Likelihood)構建系統進化樹，自展法(boot-strap)重復檢驗1000次，分析系統發育樹拓撲結構的可靠性[19]。

2 結果與分析

2.1 果膠酸裂解酶基因的擴增及序列測定

以提取的克雷伯氏菌的總DNA為模板，PLF 和PLR 引物進行PCR擴增，得到長約800 bp 的條帶(圖1A)，進一步測序得到果膠酸裂解酶基因783 bp的核心序列。利用N端序列擴增引物5BF和5BR進行PCR擴增(圖1B)，PCR擴增產物測序獲得果膠酸裂解酶基因N端590 bp的序列。利用設計的2條C端擴增引物和染色體步移試劑盒的AP1引物進行2次PCR擴增(圖1C)，擴增產物測序得到C端序列1315 bp。

2.2 果膠酸裂解酶基因全長序列拼接與序列分析

拼接所得3條序列，得到克雷伯氏菌的序列2395 bp(GenBank登錄號：MH939201)，其中果膠酸裂解酶基因開放閱讀框1710 bp，編碼569個氨基酸(圖2)。SignalP 5.0預測編碼蛋白含I型信號肽，切割位點位于第22和23位氨基酸殘基之間，為典型的A-X-A結構(AGA-QE)，切割效率0.864，是分泌蛋白，命名為K-PGL。NCBI在線CDD分析K-PGL基因編碼氨基酸的結構域，發現自16～569位氨基酸為PGL家族特有的保守結構域，屬于內切聚半乳糖醛酸裂解酶家族基因[20]。

圖1 果膠酸裂解酶基因核心(A)、N端(B)和C端(C)序列的PCR擴增

箭頭處為信號肽切割位點The black arrow showed the signal cleavage site

2.3 K-PGL蛋白的氨基酸組成與疏水性分析

Protparam預測K-PGL編碼蛋白的分子質量為63.37 KDa，理論等電點7.17，分子式C2853H4385N773O844S11。氨基酸組成分析結果顯示，K-PGL蛋白由19種氨基酸組成，以Leu所占比例最高，為11.6 %；含153個極性不帶電氨基酸(N25，Q27，D28，T32，Y30，M11)，142個帶電荷氨基酸(酸性氨基酸D40，E26，堿性氨基酸K38，R28，H10)。序列中不含半胱氨酸Cys，預測不穩定系數21.39，推測該蛋白是穩定存在蛋白(穩定系數<40時穩定)[21]。

氨基酸疏水性分析(圖3)顯示，K-PGL含有274個疏水氨基酸(A62，L66，F25，I16，W10，V21，G51，P23，預測該蛋白脂肪系數為77.80 %，總平均疏水指數(grand average of hydropathicity gravy)為-0.449，是親水性蛋白。

2.4 K-PGL蛋白二級結構分析

SOPMA軟件分析K-PGL編碼蛋白的二級結構，顯示其中含有38.49 %的α螺旋(α-helix)，11.78 %的β折疊(extended strand)，5.98 %的β-轉角(beta turn)和43.76 %的無規則卷曲(random coil)(圖4)，比例與其他果膠酸裂解酶基因基本一致[22]。

圖3 K-PGL蛋白的疏水性預測

α螺旋，β折疊，β-轉角和無規則卷曲分別由線段長度由長到短(上)和線段灰度由灰到黑(下)表示The α-helix, extended strand, β-turn and random coil are indicated by the length of line segment from long to short (up), and the line grayscale from gray to black (down), respectively

2.5 基因的系統發育分析

從 NCBI網站下載腸桿菌科耶爾森氏菌屬(Yersinia)、果膠桿菌屬(Pectobacterium)、克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬(Enterobacter)、鹽單胞菌屬(Halomonas)、Kosakonia屬、拉烏爾菌屬(Raoultella)等的K-PGL基因序列，利用MEGA X軟件的極大似然法(Maximum Likelihood)構建系統進化樹，結果運行的logL=-5441.26，除了克雷伯氏菌屬內的兩個菌種的支持率為65，其它分支都大于70，結果較為可靠，能夠反映腸桿菌科內不同菌屬的發育關系。本研究獲得的K-PGL基因與產酸克雷伯氏菌的同源基因的親緣關系最近，所有來源于同一個菌屬的K-PGL基因大都聚在一起，7個屬的K-PGL基因聚合為3個獨立的分支。其中克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬、Kosakonia屬聚為一大支，耶爾森氏菌屬和果膠桿菌屬聚為一支，鹽單胞菌屬和拉烏爾菌屬單獨聚為一支位于基。

3 討 論

果膠酸裂解酶來源廣泛，根據底物和作用方式不同分為內切聚半乳糖醛酸裂解酶、外切聚半乳糖醛酸裂解酶、內切聚甲基半乳糖醛酸裂解酶、外切聚甲基半乳糖醛酸裂解酶4種[20]。本研究克隆了克雷伯氏菌的果膠酸裂解酶基因K-PGL，編碼蛋白的N 端含有信號肽序列，不具有跨膜結構域，同時內部有PGL家族特有的保守結構域，符合內切聚半乳糖醛酸裂解酶家族特征。該基因系統進化樹分析發現，克雷伯氏菌與腸桿菌屬最為接近，Kosakonia屬是從腸桿菌屬劃分出來的新屬[23]，它們共同處在一個分枝，進化關系最近。這與基于16SrDNA和rpoB基因[24]或全基因組序列[25]的研究結果一致，但本研究自展支持值更高，確定K-PGL為內切聚半乳糖醛酸裂解酶家族新成員，該基因較為保守，可以用與種屬進化分析。

圖5 K-PGL基因的系統發育分析

不同來源的果膠酶生化性質差異較為明顯，按活性最適pH分為酸性果膠酶和堿性果膠酶。酸性果膠酶多由真菌產生[26]，黑曲霉、煙曲霉和瑞氏木霉等酸性氨基酸的比例均高于其堿性氨基酸含量，可能與其耐酸性質有一定關系，而且耐酸的程度與其酸性氨基酸的比例有關[27]。堿性果膠酶多由細菌中的桿菌屬和假單胞菌屬產生，放線菌和真菌產堿性果膠酶也有報道。本研究果膠酸裂解酶基因K-PGL具有142個帶電荷的氨基酸，堿性氨基酸76個，多于酸性氨基酸66個，堿性氨基酸的含量高可能是其耐堿性的原因。

K-PGL預測不穩定系數21.39，遠小于40，推測該蛋白是穩定存在的蛋白[21]。半胱氨酸Cys能夠改變蛋白質分子之間和蛋白質分子內部的二硫鍵，與蛋白質的穩定性和正確折疊具有重要關系[28]。本研究發現克雷伯氏菌屬果膠酸裂解酶基因序列中不含有Cys是一個保守存在的現象(目前NCBI公布的100余條序列中，僅僅發現有1條序列含有1個Cys)，對于其Cys缺失的進化機制及其穩定性的生物學意義，有待于進一步研究。

4 結 論

本研究獲得了克雷伯氏菌AKB01的果膠酸裂解酶基因全長序列，基因編碼569個氨基酸，編碼蛋白具有信號肽。與部分克雷伯氏菌屬序列一樣，不含有Cys，為進一步果膠酸裂解酶的生物學功能及其利用研究提供參考。