種球包衣劑防治魔芋軟腐病試驗研究

楊群輝，何 翔，楊佩文，畢云青，張 慶，曾 波，任思宇，施竹鳳，楊明英，謝美華

(1.云南省農業科學院農業環境資源研究所，云南 昆明 650205；2.云南農業大學植物保護學院，云南 昆明 650201；3.云南省化工研究院，云南 昆明 650228；4.楚雄師范學院化學與生命科學學院，云南 楚雄 675000)

【研究意義】魔芋軟腐病是由胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐亞種(Erwiniacarotovorasubsp.carotovora, Ecc)引起的一種發生較普遍、影響較嚴重的細菌性病害，整個生育期內均易感病，造成損失可達20 %～50 %，嚴重時到80 %以上，魔芋軟腐病的大面積發生，已成為限制魔芋產業發展的重要因素[1-4]。【前人研究進展】魔芋軟腐病的防治已有大量的研究報道，在化學防治、生物防治、農業防治等方面均取得了突破性的進展[5-6]。目前，種球包衣劑的使用已成為根莖類病害防治和促進植物生長的一種新技術方法，但其在魔芋上用于病害防治和促進植株生長的研究報道還較少。夏良榮等[7]選用不同分級規格種芋進行包衣播種，并于魔芋出苗時調查出苗率及植株長勢，于軟腐病發生高峰期調查植株發病率，收獲時測定魔芋的產量和經濟效益，結果表明使用包衣劑能顯著增加植株的出苗率，降低軟腐病的發病率，增產增收。李闊等[8]采用4種黏性較好的土樣作為載體，并按照試驗配比添加一定量的魔芋拌種劑、農林用保水劑、黏合劑、石灰、鋸末等輔料，考察包衣技術對魔芋抗摔能力、光滑程度、各項生理指標及植株出苗率出苗時間的影響，結果表明包衣劑對魔芋的正常生長和代謝能力均有促進作用。近年來，實時熒光定量PCR技術廣泛用于檢測土壤中的植物病原菌，定量測定病原物的結構和數量，探索土壤微生物群落結構的動態變化，為病害的防治提供了理論和數據支撐。程承等[9]選用煙草青枯菌特異性引物，并通過RT-qPCR技術對土壤中的青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)進行定量檢測，結果發現RT-qPCR檢測技術的靈敏度要顯著優于常規PCR檢測技術。周大祥等[10]利用疊氮溴乙錠與RT-qPCR結合，建立了獼猴桃潰瘍病菌快速檢測的技術體系，在一定程度上有效避免了PCR檢測技術造成假陽性的結果。【本研究切入點】魔芋軟腐病的初侵染源為染病種芋和帶菌土壤，發病時常從地下塊莖開始，由于土壤環境的復雜性及不可預見性，使得化學和生物藥劑的防病功能迅速減弱。種芋處理是魔芋生產中軟腐病防治最重要的環節，并逐漸成為軟腐病防治研究的必要措施與研究熱點。【擬解決的關鍵問題】為此，本研究選用一種魔芋專用種球包衣劑，并設置6個不同試驗處理，在魔芋播前對其種球進行預處理，魔芋播前對其種球進行預處理，定期考察使用種球包衣劑對魔芋出苗率、生長性狀、軟腐病發病率、植株死亡率及產量的影響，并利用RT-qPCR技術，對種植土壤中的魔芋軟腐病菌進行定量檢測，探究使用種球包衣劑對軟腐病菌的抑制效果，進而為魔芋產業的綠色健康發展及魔芋軟腐病的田間防治提供理論依據和數據支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗地點

本研究試驗地位于云南省麗江市古城區七河鄉西哨村，前茬種植大麥，上一年度種植魔芋。種植地塊土壤類型為磚紅壤，有機質為27.9 g/kg，pH值為6.04，土壤電導率為0.24 us/cm，有效氮為309 mg/kg，有效磷為78 mg/kg，有效鉀為146 mg/kg。

1.2 供試藥劑

種球包衣劑。原料組分：CuSO4·5H2O、(NH4)2HPO4、ZnSO4·H2O、Fe2O3、仿生脂氧合酶、改性淀粉、滑石粉。制備方法如下：取CuSO4·5H2O 70 g和(NH4)2HPO470g混勻，密封20 h后再加入ZnSO4·H2O 60 g、Fe2O380 g、仿生脂氧合酶0.2 g、改性淀粉220 g、滑石粉2800 g混勻，粉碎后過篩(120目)，然后再加入滑石粉8600 g混勻，制備成魔芋專用種球包衣劑。

77 %氫氧化銅可濕性粉劑(浙江瑞利生物科技有限公司生產)。

1.3 試驗設計及試驗地處理

試驗共設置6個處理，每處理3次重復。處理1：液型魔芋種球包衣劑兌水，配制成100倍液，浸泡種球10 min，晾干備用；處理2：魔芋種球浸水后晾置5 min，并用固型魔芋種球包衣劑包裹均勻后備用；處理3：液型魔芋種球包衣劑兌水稀釋成100倍100 kg液體，加入77 %氫氧化銅可濕性粉劑167 g混勻，浸泡種球10 min，晾干備用；處理4：魔芋種球浸水后晾置5 min，用固型魔芋種球包衣劑100 kg和77 %氫氧化銅可濕性粉劑167 g包裹均勻后備用；處理5：77 %氫氧化銅可濕性粉劑稀釋為600倍液，浸泡種球30 min，晾干備用；處理6：魔芋種球不做任何處理(CK)。

播種時，試驗地施用底肥2400 kg/hm2，底肥為腐植酸有機無機復混肥(N∶P∶K=10∶10∶15)。試驗采用隨機區組排列，3次重復，小區面積2.4 m×10 m=24 m2，高墑(墑面寬0.8 m)雙行塘播，株行距30 cm×40 cm，每小區200株，種芋40～60 g。魔芋播種后第35天用20 %噻菌銅500倍液葉面噴施預防病害，間隔15 d同藥同濃度再噴施1次。

魔芋種球經各處理后，分別播種于相應小區內，并于45 d后調查各小區種苗的出苗率。魔芋播種后45 d調查各小區的出苗率。

1.4 調查記錄

于魔芋播種45 d時調查各處理植株出苗情況，第45、75和105天時調查各處理軟腐病發病率及植株死亡率。收獲時測定各小區魔芋產量。

1.5 魔芋軟腐病菌種群數量分析

1.5.1 土壤總DNA的提取 于魔芋收獲時采用5點取樣法分別收集各處理種球周圍的土壤樣本，裝入無菌保鮮袋并放置于4 ℃條件下保存，帶回實驗室備用。采用OMEGA 土壤DNA 提取試劑盒提取土壤微生物總DNA，提取方法參照操作說明。每個處理土樣3次重復，提取的DNA溶液經Nanodrop超微量分光光度計和0.8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA的質量、濃度和片段長度，-20 ℃保存備用。

以稀釋后的DNA為模板，選用515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)擴增細菌16SrRNA基因V4 區，使用Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高保真酶進行PCR擴增。擴增產物用2 %瓊脂糖凝膠進行檢測；根據PCR產物濃度進行等濃度混樣，充分混勻后使用2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物，使用GeneJET試劑盒回收產物[11]。

1.5.2 特異性引物優化 魔芋軟腐病菌特異性引物為F3(5′-ATGCAACGCGAAGATCCTTAGGTAC-3′)和R3 (5′-CATTGAAGCACGTGTCTAGCCCTAC-3′)[12]，由上海生工生物工程股份有限公司合成，根據引物合成單上顯示的退火溫度±2 ℃范圍確定適宜的退火溫度。PCR擴增體系：Mix 12.5 μl，DNA 1 μl，引物各1 μl并混合，加ddH2O至25 μl。PCR 反應程序為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性18 s；58～62 ℃退火30 s；72 ℃延伸90 s；35個循環；最后72 ℃延伸10 min，16 ℃保存備用。反應結束后，取5 μl反應產物，經1.5 %瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統中觀察。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳純化回收后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序結果經Blast 搜索(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)后與GenBank數據庫中相關種屬的基因序列進行比對分析。

1.5.3 熒光定量PCR檢測 采用Takara SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(CodeNo.RR820)進行PCR擴增。熒光定量PCR 擴增體系：SYBR.Premix.Ex.Taq.TMIImix 12.5 μl，DNA 2 μl，引物各0.75 μl并混合，加ddH2O至25 μl。反應程序為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃條件下退火、延伸30 s，35個循環，收集熒光數據，4 ℃保存。采用含有目的基因的重組質粒建立標準曲線，測定提取質粒DNA的濃度，根據計算公式將質粒DNA的濃度換算成拷貝數，設置107、106、105、104、103、102CFU/mL 6個濃度梯度制作標準曲線，標準曲線要求R2>0.99。被測樣品中病原菌含量根據儀器檢測結果、抽提DNA 所用的樣品質量、抽提獲得的DNA 總量、配制qPCR 反應體系所用的模板量換算為每克土壤樣品含有的病原菌含量，單位為copy number/g[13]。計算公式為：基因拷貝數=(6.02×1023copies/mol×質粒濃度g/μl)/MW g/mol，MW為雙鏈DNA 的平均分子量，MW=堿基數×660/堿基。

1.6 數據分析處理

調查數據均采用Duncan新復極差法檢驗各處理間差異顯著性，數據結果利用DPS 7.05統計軟件計算分析，圖用Sigma Plot 12.5繪制。

2 結果與分析

2.1 種球包衣劑對魔芋出苗率、株高的影響

6個處理魔芋種球的平均出苗率分別為92.00 %、96.00 %、93.20 %、97.50 %、90.50 %和87.00 %，各處理種球的出苗率差異較明顯。分別于魔芋播種45、75和105 d全區隨機取樣調查魔芋株高，結果如表1所示，第45天時各處理間株高差異不顯著(P>0.05)，第75和105天時各處理間株高差異顯著(P<0.05)，3個時期均表現為處理4>處理2 >處理3 >處理1>處理5>處理6(CK)。試驗結果表明，使用種球包衣劑能有效提高魔芋的出苗率和改善植株的生長性狀。魔芋收獲時測定各小區產量，6個處理魔芋產量分別為57.10、65.70、60.40、68.53、55.30和49.00 kg/24m2，各處理魔芋的產量差異較明顯，表現為處理4>處理2 >處理3 >處理1>處理5>處理6(CK)；與處理6(CK)相比，使用種球包衣劑能顯著提高魔芋的產量(P<0.05)。

表1 不同時期魔芋的出苗率、株高及產量

注：數據為平均值±標準誤差。同一列中不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: The data are mean ± SD. Different small letters in the same column mean significant differences (P<0.05).

同一灰度柱狀圖上的小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

2.2 種球包衣劑對魔芋軟腐病發病率和植株死亡率的影響

分別于魔芋播種45、75和105 d全區調查軟腐病的發病率，結果如圖1所示。試驗結果表明，與空白對照相比，使用種球包衣劑能顯著降低試驗田魔芋軟腐病的發病率(P<0.05)，防病效果表現為處理4>處理2 >處理3 >處理1>處理5>處理6(CK)；與液型包衣劑相比，固型包衣劑防治魔芋軟腐病的效果要更顯著(P<0.05)。播種45 d后的調查數據可知，魔芋種球經播前防病處理和不處理的發病率差異較顯著(P<0.01)，空白對照的發病率是11.67 %，播前防病處理過的魔芋植株同期發病率分別為4.17 %、2.17 %、4.50 %、1.83 %、4.67 %，各處理間差異顯著(P<0.05)；播種75 d后處理1、處理2、處理3、處理4、處理5和處理6(CK)魔芋軟腐病發病率分別為7.50 %、4.00 %、7.00 %、3.33 %、11.33 %和16.67 %，各處理間差異顯著(P<0.05)；播種105 d后各處理魔芋軟腐病發病率分別為10.67 %、8.67 %、9.33 %、7.83 %、14.50 %和19.33 %，各處理間差異顯著(P<0.05)。

分別于魔芋播種第45、75和105天全區調查植株死亡率，結果如圖2所示。試驗結果表明，使用種球包衣劑能顯著降低試驗田魔芋軟腐病的死亡率(P<0.05)，防病效果表現為處理4>處理2 >處理3 >處理1>處理5>處理6(CK)；與液型包衣劑相比，固型包衣劑更能有效降低魔芋種苗的死亡率。播種45 d后的調查數據可知，各處理魔芋的死亡率分別為3.17 %、2.00 %、2.67 %、1.83 %、3.33 %和8.33 %，各處理間差異顯著(P<0.05)；播種75 d后處理1、處理2、處理3、處理4、處理5和處理6(CK)魔芋的死亡率分別為4.50 %、2.50 %、5.00 %、2.33 %、6.50 %和10.67 %，各處理間差異極顯著(P<0.01)；播種105 d后各處理魔芋的死亡率分別為7.83 %、5.33 %、8.17 %、4.17 %、8.67 %和15.33 %，各處理間差異顯著(P<0.05)。

圖2 不同調查時期魔芋植株的死亡率

2.3 魔芋軟腐病菌RT-qPCR擴增及標準曲線的建立

基于RT-qPCR技術，在6個處理土壤樣本中分別檢測魔芋軟腐病菌胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐亞種的PCR產物，各處理基因拷貝數分別為187、124、164、109、228和257 bp(圖3)。使用魔芋軟腐病菌懸浮液作模板，可在濃度為1×103CFU/mL樣品中檢測到熒光信號，而RT-qPCR在5×104CFU/mL樣品中發現熒光信號，表明RT-qPCR技術的檢測靈敏度要高于PCR凝膠電泳的檢測靈敏度。

選用特異性引物F3/R3對魔芋軟腐病菌DNA的10倍梯度稀釋液(5×102～5×107CFU/mL)進行RT-qPCR擴增，來驗證RT-qPCR測定的準確性和精密度。擴增結束后，以魔芋軟腐病菌DNA濃度為X軸，以Ct值為Y軸建立回歸曲線，獲得魔芋軟腐病菌基因組DNA標準曲線。如圖4所示，Ct值與魔芋軟腐病菌DNA濃度呈負相關，標準曲線方程：y=-3.0657x+33.013，決定系數R2為0.9916。結果表明：使用魔芋種球包衣劑能有效抑制魔芋軟腐病菌的繁殖和擴散，減少土壤中病原菌的有效含量。

圖3 RTq-PCR電泳圖譜

圖4 魔芋軟腐病菌基因組RT-qPCR標準曲線

3 討 論

銅作為農作物的一種微量元素，同時其化合物又是一類重要的殺菌劑，在農業生產中的用途較廣[14]。目前，銅制劑類殺菌劑是全球公認高效低毒、環境友好、不易產生抗藥性的多作用位點殺菌劑，由于其附著能力較強，藥效持久，可長時間阻止病原菌侵入植株體內，因而對細菌性病害和真菌性病害都有較好的防治效果[15-17]。本研究中，選用自行研制的種球包衣劑，其主要成分為CuSO4·5H2O、(NH4)2HPO4、ZnSO4·H2O、Fe2O3、改性淀粉和滑石粉，CuSO4·5H2O、(NH4)2HPO4和ZnSO4·H2O存在于同一環境中，會發生化學反應，生成兩種藍色、穩定的含銅化合物Cu[(NH4)2PO4]2、Cu(NH4)2PO4，Fe2O3作為一種染色劑，其在種球包衣劑內起到警戒色的作用，改性淀粉作為粘著劑，滑石粉作為填充劑。魔芋種球包衣劑的使用，能有效殺滅種芋上的病原菌，同時也能在一定程度上阻礙土壤中病菌對魔芋幼苗的侵染，起到較好的控病保苗作用。防治魔芋早期軟腐病原菌的侵染是確保其穩定增收的重要節點, 魔芋種球包衣劑在魔芋產業中可作為一項常規使用技術。

本研究采用液型種球包衣劑、固型種球包衣劑和77 %氫氧化銅可濕性粉劑，分別在魔芋播種前對種球進行預處理，定期觀察魔芋出苗率、生長性狀、軟腐病發病率、植株的死亡率及產量，結果表明使用種球包衣劑魔芋的出苗率、生長性狀和產量均有顯著變化，表明種球包衣劑具有促進發芽生長和增產豐收的作用；魔芋軟腐病的發病率及植株的死亡率均表現：固型種球包衣劑+77 %氫氧化銅可濕性粉劑>固型種球包衣劑>液型種球包衣劑+77 %氫氧化銅可濕性粉劑>液型種球包衣劑>77 %氫氧化銅可濕性粉劑>CK。種球包衣處理對魔芋苗期生長和軟腐病的前期防控具有顯著作用，且不同的播前處理方式，對魔芋苗期軟腐病的防治效果均不同，固型包衣劑在魔芋塊莖上的附著量較大，因而其藥效持續時間更長；液型包衣劑在魔芋塊莖上形成較薄的保護層，與固型包衣劑相比，其藥效持續時間短且保護作用相對較弱；使用77 %氫氧化銅可濕性粉劑處理魔芋種球，只對種球表面附著的病原菌有效，且作用單一。此外，使用魔芋種球包衣劑，除防病外還能為植株提供P、K等多種微量元素，對魔芋的苗期生長提供了良好條件。從6個處理魔芋軟腐病發病率調查結果可知，包衣技術和傳統殺菌處理對初期軟腐病防控效果較好，但隨時間延長其防控效果減弱。因此，在魔芋生長的中、后期尚需要加強田間管理，應用化學農藥或生物農藥對魔芋軟腐病進行有效防控，才能最終達到豐產穩產的目的。本研究采用RT-qPCR技術對不同處理土壤中的魔芋軟腐病菌進行定量檢測，探究使用種球包衣劑對軟腐病菌的抑制效果。同一田間管理模式下，與空白對照相比，使用種球包衣劑能顯著減少土壤中魔芋軟腐病菌的數量，起到抑制病害發生蔓延的作用。

4 結 論

魔芋播種前使用種球包衣劑，能有效減少耕作土壤中魔芋軟腐病菌的數量，并顯著降低魔芋軟腐病的發病率和植株的死亡率。