HPLC測(cè)定氯蟲苯甲酰胺在煙草和土壤中的殘留與消解動(dòng)態(tài)

黃 麗，鄧毅書，浦恩堂，代雪芳，李文希，王 靜，劉朝敏，張雪燕

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所，云南 昆明 650205，3. 昭陽(yáng)區(qū)植保植檢站，云南 昭陽(yáng)區(qū) 657000)

【研究意義】農(nóng)用化學(xué)品的大量使用導(dǎo)致農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境不斷惡化，人民對(duì)環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品安全的關(guān)注不斷增加。農(nóng)藥殘留是否合格是煙草安全的重要指標(biāo)，也是影響煙草行業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力的重要因素。開展農(nóng)藥田間施藥試驗(yàn)，研究農(nóng)藥在煙草和土壤中的殘留動(dòng)態(tài)對(duì)保護(hù)環(huán)境和安全用藥、保障煙草品質(zhì)具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】氯蟲苯甲酰胺是美國(guó)杜邦公司從鄰氨基苯甲類化合物里開發(fā)的具有新型結(jié)構(gòu)的(雙酰胺/吡唑類)S高效廣譜殺蟲劑, 其主要作用機(jī)理是通過激活昆蟲的蘭尼堿受體，釋放平滑肌和橫紋肌細(xì)胞內(nèi)貯存的鈣離子，引起肌肉調(diào)節(jié)衰弱、麻痹，使害蟲死亡[1]。氯蟲苯甲酰胺對(duì)鱗翅目、鞘翅目葉甲科、雙翅目潛蠅科、煙粉虱等多種害蟲防治效果顯著，廣泛應(yīng)用于煙草、水稻和果蔬的害蟲防治[2-3]。氯蟲苯甲酰胺的分析方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[4-7]、液相色譜-質(zhì)譜法或串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS或UPLC-MS/MS)[8-14]等，主要涉及的作物有水稻、大豆、鐵皮石斛、蔬菜等。其中，楊玉霞[15]對(duì)氯蟲苯甲酰胺在果蔗及其土壤中殘留分析方法進(jìn)行了探討；秦冬梅[16]對(duì)土壤和番茄中氯蟲苯甲酰胺的殘留檢測(cè)與消解動(dòng)態(tài)進(jìn)行了研究。目前，國(guó)內(nèi)尚未見氯蟲苯甲酰胺在煙草中的殘留分析方法和消解動(dòng)態(tài)研究的公開報(bào)道。【本研究切入點(diǎn)】基于液相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)成本高昂的限制，開發(fā)常規(guī)的分析檢測(cè)方法是一個(gè)很好的選擇，但是，如何解決煙草這種復(fù)雜基質(zhì)的樣品凈化是問題的關(guān)鍵。【擬解決的關(guān)鍵問題】采用乙腈提取、正己烷液-液分配、硅膠柱和氨基柱固相萃取凈化解決煙草基質(zhì)復(fù)雜樣品難凈化的問題，建立高效液相色譜法測(cè)定煙草和土壤中氯蟲苯甲酰胺殘留量的分析方法。該方法靈敏度、準(zhǔn)確度和精確度都符合農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)的要求，方法具有一定的新穎性。在此方法的基礎(chǔ)上，對(duì)氯蟲苯甲酰胺在煙草和土壤中的消解規(guī)律及最終殘留進(jìn)行系統(tǒng)研究，為氯蟲苯甲酰胺的合理使用及其安全性評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)、藥劑及作物

田間試驗(yàn)于2017年分別在云南宣威、山東青島兩地進(jìn)行，試驗(yàn)農(nóng)藥為5 %氯蟲苯甲酰胺懸浮劑，試驗(yàn)的煙草品種為當(dāng)?shù)赝茝V品種。

1.2 田間實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 實(shí)驗(yàn)概況 按農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則(NY/T 788-2004)[17]的要求進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，小區(qū)面積30 m2，重復(fù)3次，設(shè)空白對(duì)照，使用推薦劑量為殘留試驗(yàn)的低劑量，1.5倍推薦劑量為殘留試驗(yàn)的高劑量，殘留試驗(yàn)高劑量的3倍作為煙草植株消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)的施藥劑量，殘留試驗(yàn)高劑量的5倍作為土壤消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)的施藥劑量。

1.2.2 殘留消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn) 采用一次施藥多次采樣方法，煙草植株：噴霧施藥，按 185.63 g a.i./hm2施藥。土壤：煙草植株實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的同時(shí)，在距煙草植株試驗(yàn)地3 m質(zhì)地相同的空地，噴施按309.38 g a.i./hm2施藥，施藥后2 h、1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d、21 d、30 d、45 d隨機(jī)采樣。

1.2.3 最終殘留試驗(yàn) 設(shè)41.25和61.875 g a.i./hm22個(gè)施藥劑量。每個(gè)劑量分別施藥1和2次，施藥間隔期為7 d，于末次施藥5、7、14 d后隨機(jī)采樣。

1.3 實(shí)驗(yàn)室樣品制備

最終殘留煙草樣本需制成成品干煙葉。將田間采集的煙草鮮葉樣本按不同處理分別編竿并掛貼標(biāo)簽，按照當(dāng)?shù)厣a(chǎn)商品煙葉烘烤規(guī)程在烤房中烘烤，烘烤后的成品煙葉趁干用樣品磨磨碎，過40目篩混合均勻。

1.4 分析和檢測(cè)方法

1.4.1 儀器與試劑 儀器：Agilent-1200液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)、離心機(jī)(上海安亭科學(xué)公司)、小型旋渦混勻儀(北京踏錦公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)。

試劑：氯蟲苯甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)品純度99.9 %，Dr公司提供；乙腈、甲苯、甲醇、丙酮均為色譜純，磷酸為優(yōu)級(jí)純，氯化鈉為分析純、屈臣氏蒸餾水；硅膠(粒度0.18～0.22 mm)，130 ℃烘烤 5 h，干燥器中保存，使用時(shí)加1.5 %的水失活；氨基小柱規(guī)格為1000 mg/6mL。

1.4.2 提取 干煙葉：稱取樣品3.0 g于50 mL帶蓋離心管中，準(zhǔn)確加入乙腈30 mL，渦旋提取20 min，以3000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min。取上層清液10 mL于50 mL帶蓋離心管中，加10 mL的飽和NaCl溶液、20 mL正己烷，劇烈振蕩1 min，離心。舍去上層正己烷，中層乙腈轉(zhuǎn)移至150 mL的濃縮瓶中，再加10 mL乙腈至50 mL的離心管中萃取1次，合并乙腈層，45 ℃水浴旋蒸吹干，加2～3 mL丙酮∶正己烷(1∶9，v/v)混合液溶解殘留物，先過硅膠柱凈化，再過氨基小柱凈化。

煙草植株(鮮)和土壤：稱取植株樣品3.0 g(土壤5.0 g)于50 mL帶蓋離心管中，先加2 mL水，再準(zhǔn)確加入30 mL(土壤25 mL)乙腈，渦旋提取20 min，加NaCl 2 g劇烈振蕩1 min，以3000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，取上層清液10 mL于150 mL濃縮瓶中，45 ℃水浴旋蒸吹干，加2～3 mL乙腈∶甲苯(1∶9，v/v)混合液溶解殘留物，待氨基小柱凈化。

1.4.3 凈化 硅膠柱凈化：1 g自制硅膠小柱，丙酮濕法裝柱，用5 mL丙酮∶正己烷(1∶9，v/v)預(yù)淋，將上述干煙葉樣品提取液轉(zhuǎn)入柱中，用10 mL丙酮:正己烷(1∶9，v/v)混合液分三次清洗濃縮瓶，依次倒入柱中，繼續(xù)用此液10 mL淋洗，流出液棄去，改用20mL丙酮∶正己烷(2∶8，v/v)混合液淋洗，收集此部分洗脫液于150 mL濃縮瓶中，于45 ℃水浴旋蒸吹干，加2～3 mL乙腈∶甲苯(1∶9，v/v)混合液溶解殘留物，待氨基小柱凈化。

氨基柱凈化：氨基小柱依次用10 mL甲醇、5 mL乙腈∶甲苯(1∶9，v/v)預(yù)淋，將上述樣品提取凈化液轉(zhuǎn)入柱中，用10 mL乙腈∶甲苯(1∶9，v/v)混合液分3次清洗濃縮瓶，依次倒入柱中，流出液棄去，改用20 mL乙腈∶甲苯(35∶65，v/v)混合液淋洗，收集此部分洗脫液150 mL濃縮瓶中，45 ℃水浴旋蒸吹干，甲醇定容1 mL，過0.45 μm濾膜，待液相色譜測(cè)定。

1.4.4 液相色譜檢測(cè)條件 檢測(cè)儀器：Agilent 1200液相色譜儀 配DAD檢測(cè)器，色譜柱：CAPCELL PAK C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相∶甲醇/0.05 %磷酸溶液(60∶40，v/v)，流速1 mL/min；柱溫：30 ℃；吸收波長(zhǎng)：254 nm，進(jìn)樣量：10 μl。

1.4.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線 準(zhǔn)確稱取氯蟲苯甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)品0.0100 g，甲醇溶解定容至10 mL，濃度為1000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，然后用甲醇逐級(jí)稀釋成濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)液，按1.4.4儀器條件測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度(x)對(duì)峰面積(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)未知樣品進(jìn)行定量計(jì)算。

1.4.6 添加回收率實(shí)驗(yàn) 在未施藥的空白煙草和土壤樣本中分別添加氯蟲苯甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，干煙葉和植株添加濃度均為0.1、1和10 mg/kg，土壤為0.05、0.5和5 mg/kg，每個(gè)水平重復(fù)5次，按所建立的方法提取、凈化和檢測(cè)，計(jì)算添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 凈化方法的確定

干煙葉中含有大量的油脂、色素、煙堿及其它較為復(fù)雜的脂溶性物質(zhì)，樣品前處理難度較蔬菜和水果大得多，處理步驟也復(fù)雜得多。選用乙腈為提取溶劑，利用乙腈、正己烷和水互不相溶的特性以及氯蟲苯甲酰胺在3種溶劑中溶解度的差異進(jìn)行液-液分配萃取。氯蟲苯甲酰胺幾乎不溶于正己烷(溶解度<0.0001 g/L)，微溶于水(溶解度0.001 g/L)，在乙腈中的溶解度為0.711 g/L[2]。在液-液分配時(shí)，正己烷帶走了大部分脂溶性雜質(zhì)，一部分水溶性雜質(zhì)留在了水中，氯蟲苯甲酰胺通過2次萃取被保留在乙腈中，再通過隨后的硅膠柱和氨基柱固相萃取，讓氯蟲苯甲酰胺和剩余的雜質(zhì)進(jìn)一步分離，取得了較為滿意的凈化效果，詳見圖1～4。

2.2 氯蟲苯甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍

采用峰面積外標(biāo)法定量。在0.05～10 μg/mL范圍內(nèi)，農(nóng)藥的質(zhì)量濃度與峰面積有良好的線性關(guān)系，測(cè)定結(jié)果見表1,其線性回歸方程：y=16.456x+0.69，相關(guān)系數(shù)r2=0.9997，詳見圖5。

圖1 氯蟲苯甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)品色譜

圖2 干煙葉空白對(duì)照色譜

圖3 干煙葉添加(10 mg/kg)色譜

圖4 干煙葉實(shí)測(cè)色譜

圖5 氯蟲苯甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 氯蟲苯甲酰胺的回收率和定量限

煙草和土壤中氯蟲苯甲酰胺的回收率見表1。干煙葉和煙草植株在0.1、1、10 mg/kg的添加濃度下，其回收率分別為85.7 %～92.8 %和84.5 %～90.3 %，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.6 %～7 %和3.7 %～7.6 %；土壤在0.05、0.5、5 mg/kg的添加濃度下，其回收率為80.8 %～92.4 %，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.4 %～6.9 %，準(zhǔn)確度和精密度均符合農(nóng)藥殘留分析的要求。氯蟲苯甲酰胺在干煙葉和植株中的定量限為0.1 mg/kg，在土壤中的定量限為0.05 mg/kg。

2.4 殘留消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)

一年兩地?zé)煵葜仓晗鈩?dòng)態(tài)試驗(yàn)結(jié)果見表2。氯蟲苯甲酰胺在煙草植株和土壤中的殘留量均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，其消解過程符合動(dòng)力學(xué)一級(jí)降解模型。云南煙草植株中氯蟲苯甲酰胺的消解方程為C=3.5199e-0.058t，相關(guān)系數(shù)R=0.9649，半衰期為12 d；山東煙草植株的消解方程為C=8.5151e-0.052t，相關(guān)系數(shù)R=0.9807，半衰期為13.3 d。

氯蟲苯甲酰胺在土壤中的消解比煙草植株慢得多，云南和山東到45 d時(shí)消解率分別達(dá)77 %和66 %，半衰期分別為24.8和27.7 d，但仍然屬于易降解農(nóng)藥(T1/2<30 d)[1]。

2.5 最終殘留量

5 %氯蟲苯甲酰胺懸浮劑以其推薦劑量41.25 g a.i/hm2和1.5倍推薦劑量61.875 g a.i/m2分別噴霧處理1和2次，施藥間隔為7 d。末次施藥后5、7、14 d采集煙葉和土壤樣品進(jìn)行分析檢測(cè)，由表4可知：氯蟲苯甲酰胺在干煙葉和土壤中的最終殘留量隨著施藥次數(shù)的增加而升高，隨著施藥濃度的增大而升高，隨著采收期的延長(zhǎng)而降低。山東青島末次施藥后14 d，干煙葉中氯蟲苯甲酰胺的最高殘留量為7.7 mg/kg,土壤中的最高殘留量0.087 mg/kg；云南宣威末次施藥后14 d，干煙葉中的最高殘留量為7.1 mg/kg，土壤中的最高殘留為0.19 mg/kg。

3 討 論

采用乙腈對(duì)本底基質(zhì)較為復(fù)雜的煙草樣品進(jìn)行渦旋振蕩提取，利用正己烷、乙腈和水互不相容的特性對(duì)氯蟲苯甲酰胺進(jìn)行液-液分配萃取，首先除去大部分脂溶性和水溶性雜質(zhì)，再通過固相萃取將極性較大的雜質(zhì)保留在硅膠柱上，洗脫下來的氯蟲苯甲酰胺和剩余的部分雜質(zhì)通過氨基小柱凈化進(jìn)一步分離，從而滿足液相色譜DAD檢測(cè)的需要。該方法凈化過程中采用的液-液分配萃取全部是在50 mL的離心管中進(jìn)行，相對(duì)于傳統(tǒng)的分液漏斗液-液分配，大大減少了有機(jī)溶劑的用量，減少了資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。該方法用高效液相色譜二級(jí)管陣列檢測(cè)器檢測(cè)，相對(duì)于質(zhì)譜檢測(cè)器，樣品檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性較好，更重要的是液相色譜DAD檢測(cè)成本相對(duì)廉價(jià)，易在更多的實(shí)驗(yàn)室里實(shí)現(xiàn)，因此，該檢測(cè)方法具有更好的推廣基礎(chǔ)。

表1 氯蟲苯甲酰胺在干煙葉、煙草植株(鮮)和土壤中的添加回收率(n=5)

表2 氯蟲苯甲酰胺在煙草植株和土壤中的消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)結(jié)果

表3 氯蟲苯甲酰胺在煙草和土壤中的最終殘留量

注：ND 表示農(nóng)藥殘留量低于方法的定量限0.05 mg/kg。

Note ：ND indicates that pesticide residues are lower than the quantitative limit of 0.05 mg/kg.

通過2017年云南、山東兩地殘留試驗(yàn)結(jié)果，兩地?zé)煵莺屯寥乐新认x苯甲酰胺的殘留動(dòng)態(tài)基本一致，表現(xiàn)為隨著施藥劑量的增高和施藥次數(shù)的增多，其在煙草和土壤中的殘留量也相對(duì)增高。施藥后隨著時(shí)間的推移，氯蟲苯甲酰胺在環(huán)境中逐漸降解。根據(jù)化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則[18]，氯蟲苯甲酰胺在土壤中降解的半衰期范圍為24.8和27.7 d，小于30 d，屬于易降解農(nóng)藥。

目前尚未見到中國(guó)規(guī)定的氯蟲苯甲酰胺在煙草上的最大殘留限量(MRL)標(biāo)準(zhǔn)，國(guó)際煙草科學(xué)研究合作中心在2013年7月發(fā)布的CORESTA GUIDE No1 農(nóng)藥殘留限量指南[19]中規(guī)定氯蟲苯甲酰胺在煙草中的最大殘留限量(GRLs)標(biāo)準(zhǔn)為10 mg/kg。根據(jù)2017年在云南、山東規(guī)范GAP殘留試驗(yàn)結(jié)果，5 %氯蟲苯甲酰胺懸浮劑以有效成分含量41.25和61.875 g a.i./hm2在煙青蟲發(fā)生期分別噴霧施藥1和2次，末次施藥后5、7、14 d分別采集煙葉樣品分析檢測(cè)，干煙葉中氯蟲苯甲酰胺的平均殘留量分別為3.4～12、1.3～11和2.1～7.7 mg/kg。據(jù)此推斷，該施藥模式下14 d后采集的煙葉烘烤制成的成品煙是安全的。

4 結(jié) 論

(1)建立了液相色譜法檢測(cè)氯蟲苯甲酰胺殘留量的分析方法，該方法操作相對(duì)簡(jiǎn)便，精密度、準(zhǔn)確度和靈敏度均符合農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)的要求，適用于煙草和土壤中氯蟲苯甲酰胺殘留測(cè)定。

(2)氯蟲苯甲酰胺在煙草植株和土壤中的消解動(dòng)態(tài)均符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，消解速度先快后平緩，消解率隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增加，在煙草植株和土壤中的半衰期分別為12～13.3和24.8～27.7 d，屬易降解農(nóng)藥。

(3)在使用5 %氯蟲苯甲酰胺懸浮劑防治煙草蟲害時(shí)，建議按推薦劑量41.25 g a.i./hm2，最多施藥2次，安全采收間隔期為14 d。