抗鉛真菌的篩選、鑒定及其對Pb2+的吸附特性

趙琪琪，李海紅*，安鳳秋,2

(1.西安工程大學環境與化學工程學院，陜西 西安 710048； 2.西北農林科技大學資源環境學院，陜西 楊凌 712100)

【研究意義】重金屬因不能被生物降解，可在土壤中積累，并且通過食物鏈可對人體造成危害，因此重金屬污染已經引起廣大學者的廣泛關注。Pb廣泛應用于金屬冶煉、建筑行業及蓄電池、印刷業、染料、油漆等工業[1-2]，大量廢水廢氣排入土壤中，使土壤受Pb污染面積越來越大。因此，Pb污染土壤的修復顯得尤為重要。目前，對重金屬污染土壤的傳統修復技術有物理化學處理等技術，但缺點是能耗高、投資大、操作較困難、同時易產生二次污染[3-4]?！厩叭搜芯窟M展】近年來，迅速興起的生物修復技術，主要是利用微生物的生化反應來穩定或清除環境中的有害物質，這些能夠吸附土壤中Pb2+的微生物多為真菌和細菌，如真菌秀珍菇(Pleurotuspulmonarius)[5]、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)[6]、曲霉(Aspergilus)、青霉(Penicillium)[7]、鐮刀菌屬(Fusarium)[8]、芽孢桿菌(Bacillus)[9]、Rhizopusarrhizus[10]、Enterobactersp.JI[11]、Norcardiaamarae[12]、Phanerochaetechrysosporium[13]Cochlioboluslunatus[14]等，但這些微生物對Pb2+的耐受能力均不太高，大部分小于400 mg·L-1，對于重金屬Pb污染比較嚴重的環境進行生物修復，上述這些菌株就存在明顯不足，因此篩選馴化出能夠在較高濃度Pb污染環境中存活的菌株，對治理Pb污染的環境進行生物修復尤為重要。【本研究的切入點】本實驗從重金屬污染的土樣中篩選馴化出一株耐Pb菌株，對其進行了Pb2+去除和吸附特性研究?！緮M解決的關鍵問題】以期為鉛污染土壤的微生物修復提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 土樣來源 土壤樣品采集于陜西省楊凌區西北農林科技大學國家黃土肥力與肥料效益監測基地。0～20 cm的地表土，采樣法采用“之”字型，設置5個點，將5個點采取的土樣混合為1分樣品，然后從中稱取200 g裝入已經滅菌的自封袋中，將自封袋放置在冰盒中快速運回實驗室，用研缽研碎，100目篩過樣，放置在4 ℃冰箱中保存備用。

1.1.2 試劑 Pb(NO3)2:配制成Pb2+濃度為0.5 mg·L-1的貯備液。

1.1.3 培養基 PDA培養基(%)：去皮馬鈴薯20，葡萄糖1.5，蛋白胨0.3，KH2PO40.3，MgSO40.2，瓊脂 2，pH 7.0。

1.2 菌株的篩選和馴化

取10 g土樣溶于100 mL無菌水中，25 ℃、160 r/min振蕩培養12 h，靜置20 min，將1 mL上清液梯度稀釋至10-3、10-4、10-5，然后用注射器取1 mL培養液轉接到含Pb2+濃度為200、300、400和500 mg·L-1的Pb2+培養基平板上，每個樣設置3個重復，28 ℃培養72 h，然后觀察菌株的生長情況。根據菌落的形態不同，用平板劃線法挑取單菌落進行分離純化培養，反復多次進行分離純化培養，劃線直到獲得純菌株[15]。對于初篩得到的菌株，通過增加Pb2+濃度梯度，進行復篩培養，選取耐鉛活性較強的菌株，進行馴化傳代培養。

1.3 菌株的鑒定

1.3.1 菌株的形態特征觀察 對篩選出的真菌菌株進行菌落表面、邊緣、顏色及其形態特征等方面的觀察[15]。

1.3.2 菌株的分子生物鑒定 采用酶法提取菌株的DNA，依據真菌ITS rRNA基因中最保守的序列設計并合成引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)/ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)，通過PCR技術進行擴增。PCR運行程序為：在94 ℃預變性5 min后，同等溫度下變性45 s，然后在58 ℃條件下退火45 s，72 ℃延伸1 min 30 s，31個循環；在4 ℃條件下冷藏保存[16]。在北京六合華大基因科技有限公司進行ITS rRNA測序，將所得序列與NCBI數據庫中已有的序列進行BLAST分析，分析該菌株的同源性，通過MEGA 6.0 軟件生成系統發育樹[16-18]。

1.4 菌株的生長特性研究

對篩選出的真菌菌株用滅菌的打孔器取直徑為1.2 cm的菌餅，接種在PDA固體培養基上，25 ℃下恒溫培養7 d，設置3個重復，采用十字交叉法測量不同培養時間下菌落的直徑，并計算平均生長速率[19-20]。

平均生長速率V(cm·d-1)=(φ菌落直徑平均值-φ菌餅直徑)/培養時間(t)以pH值、培養溫度及培養時間作為影響該菌株生長的主要因素，分別將pH值設置為6、7、8、9；溫度設置為20、25、30和35 ℃；培養時間設置為1、2、3、4、5、6和7 d，設計單因素試驗確立待測菌株的最優培養條件，研究該菌株的生長特性。

1.5 菌株的最大抗性水平研究

菌株所能耐受的最大Pb2+濃度即為該菌株的最大抗性水平(MRL)，為了確定待測菌株對重金屬Pb2+的最大抗性水平(MRL)，將該菌株劃線接種于含不同濃度Pb2+(1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000)mg·L-1的固體PDA培養基上，25 ℃下培養4 d，觀察其生長情況。每個處理設3個平行，將菌株接種在不含Pb2+的培養基作為空白對照。

1.6 菌株對Pb2+的去除吸附效果

1.6.1 菌株在不同Pb2+濃度下的生長曲線 對于不同生長時間菌體的干質量，可采用搖瓶培養測定的方法來繪制其生長曲線[17]。配制 Pb2+濃度分別為(0、1000、1500、2000、2500、3000)mg·L-1的PDA液體培養基，向每個搖瓶加入1 mL菌株種子液，每個濃度梯度設置3個重復，在25 ℃、160 r·min-1下恒溫振蕩培養4 d。每8 h取1次樣，用離心法測定其細胞干重，即先稱量離心管的重量，然后在離心管中放入待測培養液，8000 r·min-1下離心5 min，80 ℃真空干燥后稱菌體干重[18]。

1.6.2 菌株對Pb2+的去除研究 配制含Pb2+濃度為(1000、2000、3000)mg·L-1的液體培養基，然后在100 mL培養基中接種1 mL的菌株種子液，以不加菌的鉛溶液作為對照，160 r·min-1，25 ℃下恒溫振蕩培養4 d。8000 r/min離心5 min除去菌體，取上清液，加入硝酸加熱消解、稀釋，使用NexION350電感耦合等離子體質譜儀測定溶液中Pb2+濃度[20]。每個樣品設置3個重復。Pb2+去除率(P)按照公式(1)進行計算[18-20]。

圖1 菌株PbW的菌落及菌絲形態特征

P= (C1-C0)/C1×100 %

(1)

式中，C1——原培養液中Pb2+濃度(mg·L-1)，C0——菌體生長后培養液中Pb2+濃度(mg·L-1)。

1.6.3 菌株對Pb2+的吸附 取滅菌消毒的離心管1支，移取20 mL新鮮菌體種子液于其中，在8000 r·min-1離心條件下離心5 min，棄上清液，用去離子水沖洗菌體3次，并收集菌體，用濾紙將水蘸干，然后將菌體分別加入到含Pb2+濃度為(1000、2000、3000)mg·L-1的溶液中，用玻璃珠充分將加入的菌體打散使之與溶液混勻，置于恒溫振蕩器上25 ℃以160 r·min-1的轉速震蕩24 h，后過濾，取上清液加入硝酸消解，稀釋后用NexION350電感耦合等離子體質譜儀測定溶液中Pb2+濃度。將實驗所用濾紙標號，烘干，稱重，然后過濾出菌絲體，將帶有菌絲體的濾紙放入80 ℃的烘箱里，烘干至恒重后取出，放在分析天平上稱量重量，減去濾紙重量，即可算出菌體干重[19]。本試驗吸附率和吸附量分別按公式(2)和(3)進行計算[18-20]。

Q= (C-Ct)/C×100 %

(2)

q= (C-Ct)×V/m

(3)

M:Marker DL2000 plus 從下至上依次為：5000、3000、2000、1000、750、500、250、100 bp

式中，Q——吸附率，C——吸附前溶液中Pb2+濃度(mg·L-1)，Ct——吸附t時刻后溶液中Pb2+濃度(mg·L-1)，q——吸附量(mg·g-1)，V——反應液體積(L)，m——反應液中菌體烘干后的質量(g)。

2 結果與分析

2.1 菌株的基本形態特征

如圖1-a所示，菌落呈圓餅狀生長，菌落直徑8～9 cm，菌落稍隆起，蔓延生長，質地絨狀兼絮狀，菌絲體灰白色，表面無滲出液，無可溶性色素，反面接近灰黑色。如圖1-b所示，光學顯微鏡下顯示菌株營養菌絲壁突起分生孢子結構大量產生，分生孢子近于灰色，顯示其分生孢子梗發生于基質，孢梗莖(165.4～258.3) μm×(2.7～5.0) μm，梨形單輪生，分生孢子通常呈現橢圓形，(2.2～2.9) μm×(1.9～2.8) μm，少量的橢球形或近扁球形，分生孢子鏈較緊密。

2.2 菌株的分子生物學鑒定

經過PCR擴增，PbW菌株的ITS rRNA基因長度約為960 bp，PCR擴增產物如圖2所示。本實驗菌株(PbW)的系統發育樹如圖3所示：對ITS rRNA所測序列與NCBI的序列進行BLAST比對及構建進化樹，菌株PbW與莖點霉屬(Phoma)具有較高的相似性，其中菌株PbW與Phomasp.(KU293587.1)的相似性為99 %，且在進化上的距離相對較近，處于同一分支。結合菌株形態特征確定菌株PbW為莖點霉屬。

圖3 菌株PbW的系統發育樹

結果以平均數±標準差(n±s)表示

2.3 菌株的生長特性研究

2.3.1 溫度對耐鉛菌株生長的影響 如圖4所示：菌株PbW在不同溫度下呈曲線生長。在20～25 ℃范圍內，生長速率隨溫度的升高而增大，25 ℃時菌株PbW生長速率達到最大值；在25～35 ℃范圍內，菌株生長速率隨溫度升高而減弱，30 ℃以上菌株生長極其緩慢，35 ℃時菌株生長速率為0。因此菌株PbW的最適溫度為25 ℃。

2.3.2 時間對耐鉛菌株生長的影響 從圖4可以看出，菌株PbW在不同時間下的生長狀況為：0～1 d菌株基本上沒有生長，處于停滯期；1～2 d，菌株加速生長，處于加速期；2～4 d，菌株生長速率增至最大，菌株呈幾何級數增加，處于對數期；4～5 d，菌株生長速率稍有減弱，但菌株生物量仍處于上升狀態，處于減速期；5～6 d，菌株生長速率減緩，基本上處于靜止期，靜止期新生的菌株數和死亡的菌株數相當，菌株總數達到最大值；6～7 d，菌株生長顯著降低，死亡率增加，此時菌株群體進入衰亡期。因此菌株PbW的最適培養時間為4～5 d。

結果以平均數±標準差(n±s)表示

2.3.3 pH對耐鉛菌株生長的影響 PDA在強酸(≤5)強堿(≥10)條件下不能凝固，故培養基的pH值設定范圍在6～9。如圖5所示：菌株PbW在不同pH的影響下呈曲線式生長，可以看出菌株在pH=7時生長速率最大，pH=6時生長速率較大，pH=8和pH=9時生長速率降低，因此菌株PbW的最適生長pH為7。

A: CK; B: 1000 mg·L-1; C: 1500 mg·L-1; D: 2000 mg·L-1; E: 2500 mg·L-1; F: 3000 mg·L-1 ; G: 3500 mg·L-1; H: 4000 mg·L-1; I: 4500 mg·L-1;J: 5000 mg·L-1; K: 5500 mg·L-1; L: 6000 mg·L-1

2.4 菌株的最大抗性水平研究

通過最大抗性水平(MRL)檢測，菌株PbW耐Pb2+能力可達到6000 mg·L-1，由圖6可知，當固體培養基中Pb2+的含量為0時，菌株生長速度最快。隨著Pb2+濃度的增加，菌株生長逐漸受到抑制，菌株生長減慢，其菌體量變少，這可能與重金屬鉛對微生物的毒害作用有關。Pb2+在1000～2000 mg·L-1，菌株正常生長，形態基本沒有發生變化，呈暗灰色，且與不添加重金屬Pb2+的對照形態及菌株生物量相似。說明菌株在Pb2+為1000～2000 mg·L-1范圍內，生長基本上不受Pb2+的影響；Pb2+在2500～4000 mg·L-1，菌株生物量減少，菌絲周圍開始泛白；Pb2+在4500～6000 mg·L-1，菌株生物量急劇減少，并隨著Pb2+濃度的升高，菌絲顏色逐漸變淺，漸漸從灰色變為白色。當Pb2+濃度達到6000 mg·L-1時，菌株由之前的暗灰色變成了白色，菌株生物量極少，基本不再生長，耐Pb2+能力達到極限。表明分離的菌株PbW具有較強的耐受鉛能力。

2.5 菌株對Pb2+去除吸附效果研究

2.5.1 菌株在不同Pb2+濃度下的生長曲線 由圖7可知，培養基中Pb2+的濃度為零時，菌體生長最好。當逐漸增大培養基中Pb2+質量濃度時，菌株的生長能力減弱，細胞干重也在不斷減少，在培養液中的Pb2+濃度在1000～1500 mg·L-1時，細胞干重有所減少，說明低濃度的Pb2+對菌體生長有一定的抑制作用。當培養液中的Pb2+濃度大于2000 mg·L-1時，菌株生長較緩慢，細胞干重顯著減少。但在一定的Pb2+濃度范圍內，該菌株依然能生長，表明該菌株具有一定的耐鉛能力。

2.5.2 菌株對Pb2+的去除 如圖8所示：當Pb2+濃度為1000 mg·L-1時，去除率為95.67 %；Pb2+濃度為1000～2000 mg·L-1時，菌株對Pb2+均有較好的去除效果。當Pb2+濃度達為2000 mg·L-1時，去除率最大，達到98.42 %，隨著Pb2+濃度的升高，菌株對Pb2+的去除率呈下降趨勢，但仍高達90 %。當Pb2+濃度為3000 mg·L-1時，去除率有所下降，這可能與菌株吸附到達飽和有關。

結果以平均數±標準差(n±s)表示

2.5.3 菌株對Pb2+的吸附 如表1所示：菌株對鉛有吸附作用，且吸附平衡較快。在Pb2+濃度為1000 mg·L-1時，其吸附率為51.65 %；Pb2+濃度為1000～2000 mg·L-1時，吸附率隨著Pb2+濃度增大而升高；當Pb2+濃度為2000 mg·L-1時，吸附率為56.28 %，吸附率達到最大；當Pb2+濃度大于2000 mg·L-1時，吸附率隨著Pb2+濃度增大而降低，當Pb2+濃度為3000 mg·L-1時，吸附率為33.39 %。隨著Pb2+濃度升高，菌株對Pb2+的吸附率下降，但吸附率依然大于30 %。這一結果與Norcardia amarae對Pb2+的吸附特性相似[12]。

2.5.4 菌株對Pb2+去除率與吸附率的比較 如圖9所示，菌株對Pb2+的吸附率與去除率不同，其中去除率明顯高于吸附率。這與鐮刀菌屬[17]類似，但沒有鐮刀菌屬對Pb2+吸附率(92.6 %)與去除率(99.8 %)的差別大，推測可能與菌種不同有關。菌株對Pb2+的去除率與吸附率存在不同，可能是因為菌株對Pb2+的去除是菌株吸附作用和轉化作用所致[18]。

3 討論與結論

研究表明，菌株PbW經鑒定為莖點霉屬(Phomasp.)。它們對鉛的耐受質量濃度分別高達6000 mg·L-1。PbW最適pH值為7，最適溫度為25 ℃，最佳培養時間為4～5 d；試驗研究結果表明，PbW在pH值為6～9基本都能生長，當pH>7時，隨著pH值的升高，生長速率減弱。pH對微生物的生命活動有很大的影響。pH會影響細胞質膜對離子和養料的吸收、影響酶的活性、改變環境中養料的可給性或有害物質的毒性。因此，深入探究獲得其生長適宜的pH 值對微生物創造一個良好的生長環境至關重要，也對真菌在實際治理重金屬污染方面起著重要作用[17-21]。PbW在20～30 ℃，由于溫度適宜，菌株生長情況基本上無差別。當溫度高于35 ℃時，菌株PbW的生長速率為零，表明高溫會影響菌株PbW的生長。研究發現微生物的生長與溫度密切相關，超過微生物生長的最高溫度可引起微生物細胞內的蛋白質凝固，使酶變性失活，代謝停滯死亡。當環境溫度低于微生物生長的下限時，可造成微生物細胞內的酶的活性降低，新陳代謝活動緩慢，呈休眠狀態。因此，在適宜的溫度，它下們能夠正常生長，在適應的溫度界限以外，過高或過低的溫度會抑制微生物的生長，嚴重時會導致它們死亡[17-21]。

圖8 菌株對Pb2+的去除效果研究

表1 菌株對Pb2+的吸附效果研究

圖9 菌株PbW對Pb2+去除率與吸附率的比較

在初始Pb2+濃度為1000～3000 mg·L-1時，采用菌株PbW的活體細胞對Pb2+進行去除實驗，同時采用菌株PbW的離心生物質對Pb2+進行吸附實驗[18]，在鉛質量濃度一定時，隨著生長時間的延長，菌株PbW對鉛的去除率及吸附率表現出先增大后減小的趨勢，這與其他學者的研究[22-24]一致。在鉛質量濃度為2000 mg·L-1時，菌株對鉛的去除率及吸附率達到最大，分別為56.28 %和98.42 %。結果表明，菌株PbW對Pb2+的去除率高于吸附率，說明菌體對Pb2+的去除不僅與菌體的細胞壁和各個官能團有關，可能也與菌株PbW自身的一些代謝產物有關[18]，真菌的代謝作用能產生多種低分子量的有機物來絡合、吸附Pb2+，從而達到去除、回收Pb2+的目的[18]。

菌株PbW對Pb2+的最大飽和吸附量達到了61.87 mg·L-1，這明顯高于文獻[18]所報道的青霉菌最大鉛吸附量(59.88 mg·L-1)。菌株PbW對Pb2+具有高效的吸附力這一特性，在重金屬鉛污染研究方面具有潛在的實用性。但土壤是一個非常復雜的環境體系，一般而言，會存在多種重金屬污染，所以利用單一的真菌或微生物來修復土壤重金屬的效率較低，因此，研發高效的、耐重金屬離子濃度高的微生物菌劑來聯合降解土壤重金屬以及深入解析重金屬污染土壤修復的作用機制，還有待今后進一步的試驗和研究。