魚鱗多肽亞鐵螯合物的制備及結構表征

覃 宇，鞠守勇,2*

(1.武漢職業技術學院生物工程學院，湖北 武漢 430074；2. 華中農業大學微生物學國家重點實驗室，湖北 武漢 430070)

【研究意義】湖北號稱“千湖之省”，境內淡水資源豐富，漁業生產能力較為發達。草魚作為湖北省最大的普通淡水魚養殖品種，在加工過程中產生大量的魚鱗，可以作為水產品加工的下腳料，提取膠原蛋白、明膠、羥基磷灰石和脂肪酸等[1]。由于魚鱗中含有豐富的膠原蛋白，此方面的研究越來越受到關注。特別是魚鱗酶解物中的活性多肽，可以應用于多個領域[2]，例如，多肽與不同金屬離子絡合可以作為多種金屬元素補充劑[3]。【前人研究進展】目前，微量元素與多肽形成的螯合物研究以鐵元素居多，這是因為多肽(氨基酸)螯合鐵具有優良的補鐵功效。美國、日本等已有微量元素螯合物應用于飼料工業，取得了顯著效果[4]。另外，通過大量動物實驗表明，相對于第一代無機鐵和第二代有機鐵，第三代氨基酸(多肽)鐵螯合物補鐵效果優于同水平的硫酸亞鐵，其在動物體內的利用率翻倍[5]。【本研究切入點】近年來，文獻關于氨基酸多肽鐵螯合物的報道主要集中在豆類多肽和蛋白多肽與鐵的螯合上，如大豆多肽螯合亞鐵[6]、鷹嘴豆蛋白肽螯合鐵[7]、米蛋白多肽螯合鐵[8]、魚和魚皮蛋白肽螯合鐵[9-10]、β淀粉多肽螯合鐵[11]、帶魚蛋白多肽螯合亞鐵[12]等，而有關魚鱗多肽亞鐵螯合物的報道卻不多見。【擬解決的關鍵問題】本實驗以草魚魚鱗多肽和氯化亞鐵為原料，用抗氧化劑抑制亞鐵離子的氧化，通過單因素實驗和正交實驗優化螯合物的合成工藝，用紫外光譜、紅外光譜、電鏡掃描、元素分析等手段對螯合物的組成及結構進行了分析和表征，證明了魚鱗多肽亞鐵螯合物的形成，為魚鱗廢棄物的高值化利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魚鱗多肽 分子量2500～1500 Dal，24.8 %； 500～1500 Dal，30.9 %；190～500 Dal，11.8 %；純度>96.0 %，錸德食品股份有限公司；混合氨基酸標準液2.5 mmol/mL(Wako公司)；四水合氯化亞鐵、抗壞血酸、亞硫酸氫鈉、鹽酸羥胺、硫酸亞鐵銨、醋酸鈉、鄰菲羅啉、無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉(國藥試劑有限公司)，均為分析純。

85-2型恒溫磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司；Cence湘儀L600離心機 湖南湘儀儀器有限公司；YRE-501型旋轉蒸發儀 鞏義市予華儀器有限責任公司；EL204電子天平 FE320酸度計 梅特勒-托利多儀器有限公司；Vario EL Ⅲ型元素分析儀 德國元素分析系統公司；TAS-990AGF原子吸收光譜儀 北京普析通用儀器有限公司；Nexus 470型傅里葉變換紅外光譜儀 美國尼高力儀器公司；UV-1800型雙光束紫外可見分光光度計 日本島津儀器公司；D/max-2500PC型全自動粉末X-射線衍射儀 日本株式會社理學公司；JSM-6390LV型掃描電鏡 日本電子株式會社。

1.2 實驗方法

1.2.1 魚鱗多肽亞鐵螯合物的制備 將1.0 g魚鱗多肽粉末用30 mL水溶解，40 ℃攪拌得到澄清液，加入一定量抗氧化劑，用10.0 %的NaOH或HCl溶液調節溶液的pH，在一定溫度下反應一定時間，5000 r/min離心10 min后，上清液用無水乙醇沉淀，并用適量甲醇洗滌數次。-50 ℃真空冷凍干燥48 h，得到魚鱗多肽亞鐵螯合物。

1.2.2 抗氧化劑類型的選擇 合成中為防止二價鐵的氧化，需加入抗氧化劑加以保護，使魚鱗多肽亞鐵螯合反應順利進行。在燒杯中加入1.0 g魚鱗多肽、1.0 g氯化亞鐵，再分別加入等量(各0.15 g)的鹽酸羥胺、抗壞血酸、亞硫酸氫鈉3種抗氧化劑，調節pH至5左右，40 ℃下螯合反應約1 h。然后將反應液以5000 r/min離心10 min，傾出上清液，管中剩下的沉淀于烘箱中干燥后稱重，比較各沉淀質量，對比上述3種抗氧化劑的抗氧化效果。

1.2.3 抗氧化劑用量的選擇 根據1.2.2中試驗結果，選擇抗壞血酸為抗氧化劑，分別稱取0.025、0.050、0.100、0.150、0.200 g抗壞血酸，再在燒杯中加入1.0 g魚鱗多肽、1.0 g氯化亞鐵，調節pH至5左右，40 ℃下螯合反應約1 h。然后將反應液以5000 r/min離心10 min，移去上清液，將離心管中的沉淀干燥后稱重，通過比較各反應的沉淀質量來比較不同用量抗氧化劑的抗氧化效果。

1.2.4 單因素實驗 固定條件為溫度40 ℃、時間30 min、pH 5、魚鱗多肽與亞鐵鹽的質量比1∶1。為分析各單因素對螯合率的影響，每次實驗均改變其中一個條件，固定其它條件。各因素水平梯度分別為：pH(3、4、5、6、7)、魚鱗多肽與亞鐵鹽的質量比(1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1)、反應時間(20、30、40、50、60 min)、反應溫度(10、20、30、40、50 ℃)。每個水平重復試驗2次，結果取平均值。

1.2.5 正交實驗 以上述單因素實驗為基礎，分別選取4個因素(pH、多肽與亞鐵鹽的質量比、反應時間、反應溫度)的各3個適宜水平(表1)，按L9(34)進行正交試驗，優化合成工藝，確定最佳螯合條件，正交實驗因素和水平見表1。

1.2.6 亞鐵離子標準曲線的制作 用硫酸亞鐵銨配制濃度分別為8、16、24、32、40 μg/mL的鐵離子標準溶液，以1.5 g/L鄰菲羅啉溶液2 mL為顯色劑，依次加入1.0 mol/L乙酸鈉溶液5 mL和100 g/L鹽酸羥胺溶液各1 mL，以試劑空白為參比，測定波長為510 nm。繪制標準曲線時以亞鐵離子濃度C (μg/mL)作橫坐標，吸光度A作縱坐標，回歸方程為A= 0.1258C+ 0.0443 (R=0.9995)。

1.2.7 亞鐵螯合率的計算 準確稱取干燥的魚鱗多肽亞鐵螯合物粉末0.05 g左右(精確到0.0001 g)，加入約1～2 mL濃鹽酸，待樣品完全溶解后，用蒸餾水定容至100 mL容量瓶中。從中準確移取5.00 mL于50 mL 容量瓶中，依次加入鹽酸羥胺溶液(100 g/L)1 mL，乙酸鈉溶液(1.0 mol/L)5 mL，1.5 g/L的鄰菲羅啉溶液2 mL，定容，搖勻，在510 nm處測定樣品溶液的吸光度，并通過標準曲線計算螯合物中亞鐵離子含量。

式中，C為標準曲線查出樣品溶液對應的亞鐵離子含量(mg)，m為螯合物粉末質量(kg)，v1為樣品試液移取體積(mL)，v0為樣品試液定容體積(mL)。

亞鐵離子螯合率的計算：

式中，m1表示與多肽螯合的亞鐵量(mg)；m0為反應體系中加入的亞鐵總量(mg)。

1.2.8 魚鱗多肽和魚鱗多肽亞鐵螯合物的結構表征 原料魚鱗多肽及其螯合物中的C、H、N采用元素分析儀測定，Fe采用原子吸收光譜儀測定；二者的紫外光譜在190～400 nm的波段下用紫外分光光度計進行光譜掃描。紅外光譜采用傅里葉變換紅外光譜儀在4000～400 cm-1區間內掃描； X-射線衍射采用全自動粉末X-射線衍射儀分析，工作參數為：電壓40 kV，電流100 mA，掃描速度：5 °/min，掃描范圍：5～90°，步進：0.02°。電鏡圖采用電鏡掃描儀獲得，放大倍數為500倍，掃描條件：高壓15 KV，束流6.9×10-2mA，工作距離16.2 mm[6,13-15]。

1.2.9 數據整理和統計分析 試驗數據根據Excel 2010進行整理，采用Origin 2017制圖，方差分析利用SPSS 19.0作統計處理。

2 結果與分析

2.1 抗氧化劑類型對螯合反應中亞鐵離子的保護效果比較

鐵元素在人體內的吸收主要以亞鐵形式存在，而亞鐵離子在水中穩定性差，易被氧化為三價鐵離子，進而生成不溶于水的鐵氫氧化物沉淀。由圖1可知，抗壞血酸做抗氧化劑時，產生的沉淀質量最小。因此，抗壞血酸在3種抗氧化劑中的抗氧化效果最好。從圖2可知，當質量比為0.150∶1時，沉淀的生成量最小，故選擇抗壞血酸的用量為氯化亞鐵質量的0.150倍。

2.2 魚鱗多肽亞鐵螯合物的制備工藝

2.2.1 pH對魚鱗多肽亞鐵螯合反應的影響 從圖3可以看出，pH值增加，螯合率升高，反應體系中亞鐵離子螯合率達到最高(70.3 %)時對應的pH值為5，而pH值增加到6時螯合率又開始降低，為43.9 %。因為此時OH-濃度增加，體系中大量的亞鐵離子以氫氧化物沉淀的形式存在，則與多肽螯合的幾率大大降低，導致螯合率下降。由于在金屬離子與多肽形成螯合物的反應中，pH值是重要影響因素之一。在pH值低的酸性條件下，過多的氫離子與供電子基團結合，導致螯合率下降。而pH值高的堿性環境中，過多的氫氧根離子會與金屬離子形成氫氧化物的沉淀。因此根據亞鐵離子的螯合率，可知最適合pH值為5。

圖1 抗氧化劑對沉淀生成的抑制效果

圖2 抗壞血酸與氯化亞鐵的質量比對螯合反應的影響

圖3 pH對螯合率的影響

2.2.2 多肽與亞鐵鹽的質量比對魚鱗多肽亞鐵螯合反應的影響 從圖4可明顯看出，螯合率的變化隨著魚鱗多肽與亞鐵鹽的質量比先顯著上升，再緩慢下降，具體表現為在其質量比從1∶2上升到1∶1時，螯合率由50.6 %增加到79.3 %，質量比繼續增加，螯合率則下降為52.4 %，說明當質量比為1∶1時，鐵螯合率最高，所以最適合的魚鱗多肽與亞鐵鹽的質量比為1∶1。

2.2.3 反應時間對魚鱗多肽亞鐵螯合反應的影響 一般來說，金屬離子與多肽的螯合反應是快反應，時間對反應的影響較小。由圖5可以看出，反應時間從20 min增加到60 min，螯合率在30 min左右達到最高，但總體變化趨勢不大。故從時間成本考慮，選擇30 min作為反應的最佳時間。

2.2.4 反應溫度對魚鱗多肽亞鐵螯合反應的影響 如圖6所示，隨著反應溫度增加，鐵螯合率先逐漸上升，再略微下降，在40 ℃時最高。說明溫度過低，會降低多肽與亞鐵離子結合的活力，而溫度過高，導致亞鐵離子被氧化，同樣降低螯合率。因此，選擇40 ℃作為螯合反應的最適宜溫度。

圖4 多肽與亞鐵鹽的質量比對螯合率的影響

圖5 反應時間對螯合率的影響

2.3 魚鱗多肽亞鐵螯合物合成工藝條件的優化及方差分析

從表2可知，影響螯合反應中亞鐵離子螯合率的4個因素順序依次為A、C、B、D,最優組合為A3B2C2D2。利用SPSS19.0軟件對螯合率進行方差分析(表3)。由表2～3可知，pH值、魚鱗多肽與亞鐵鹽的質量比、反應時間、反應溫度都會影響螯合率，且均達到差異極顯著水平(P<0.01)。由于RA>RC>RB>RD，所以pH值對螯合率影響最大。由k值可知最優水平為A3B2C2D2，即多肽與亞鐵鹽的質量比時2∶1，pH 5，反應時間為40 min，反應溫度為30 ℃。

在設定的因素水平內，得出螯合率最高的優化組為在此工藝條件下進行驗證試驗，3次平行試驗的螯合率平均值為(83.4±0.52) %， 均高于其它正交試驗結果。

2.4 魚鱗多肽和魚鱗多肽亞鐵螯合物的結構表征分析結果

2.4.1 魚鱗多肽亞鐵螯合物的紫外光譜分析 從圖7可看出，兩者具有不同的最大吸收峰，魚鱗多肽溶液的最大吸光度在204.5 nm，亞鐵螯合物的最大吸光度為201.0 nm，說明由于亞鐵離子的加入導致了多肽分子中某些基團結構的變化，基團中電子躍遷能級發生了改變，從而使螯合后的產物的最大吸收產生了藍移。據此可判定魚鱗多肽與亞鐵離子螯合后生成了新的物質[14]。

圖6 反應溫度對螯合率的影響

表2 正交試驗結果

注：k1、k2、k3、R為鐵螯合率對應的參數。

表3 方差分析

注：“**”表示差異極顯著(P< 0.01)。

2.4.2 魚鱗多肽和魚鱗多肽亞鐵螯合物元素分析 由表4可以看出，魚鱗多肽與氯化亞鐵螯合后含鐵量為10.625 %，N、C、H含量明顯降低，元素組成符合多肽亞鐵螯合物主要元素成分，為氨基酸和鐵元素共同組成，證明了魚鱗多肽亞鐵螯合物的生成。

2.4.3 魚鱗多肽和魚鱗多肽亞鐵螯合物紅外光譜分析 多肽分子中有一些特征官能團，如羰基、氨基、羧基等，當多肽分子與金屬離子配位后，這些特征基團在紅外光譜中的特征峰會產生不同程度的位移[16]。從圖8可知，其中3301.42 cm-1處為-NH2的吸收峰，1654.39 cm-1處為酰胺I帶的C=O的吸收峰，1544.76 cm-1屬于酰胺II帶的-NH吸收峰，1447.88 cm-1為-COO-吸收峰，這說明多肽上的多個官能團，如氨基、羧基、肽鍵等都參與了與亞鐵離子的螯合反應。特征區-NH2的吸收峰移動至3362.61 cm-1處，發生明顯的位移，說明氨基多肽分子中的氨基參與了反應；指紋區C=O的吸收峰移動至1651.84 cm-1處；-COO-的吸收峰移動至1452.97 cm-1；另外，在1103.68 cm-1處吸收峰強度較大，與文獻中PtNH2峰吸收位置相似，表明亞鐵離子與多肽中的氨基發生了螯合反應[17]。

表4 魚鱗多肽與魚鱗多肽亞鐵螯合物元素分析結果

圖8 魚鱗多肽和鐵肽螯合物的紅外光譜圖

圖9 魚鱗多肽和多肽螯合鐵的X-衍射圖譜

2.4.4 魚鱗多肽和多肽亞鐵螯合物的X光衍射光譜分析 如圖9所示，其中多肽的衍射圖譜上沒有出現較強的X衍射峰，只在2θ為20.55 °處有吸收，且吸收峰本底大，吸收峰強度不大，說明魚鱗多肽組成復雜，所得的多肽是無規則的非晶型結構。魚鱗多肽加入亞鐵離子后，生成多肽亞鐵螯合物的X光衍射圖譜發生了變化。能明顯看到20.55 °處的吸收峰減弱，具有多個典型晶體的比較尖銳的衍射線。這表明多肽與亞鐵離子螯合后，產物的結構與螯合前相比發生了一定程度的改變，由原料的無定形結構轉變為結晶結構和無定型結構共存的狀態，結晶度大幅提高[14,18]。

圖10 魚鱗多肽及多肽亞鐵螯合物的電鏡掃描圖(×500)

2.4.5 魚鱗多肽和多肽亞鐵螯合物的電鏡掃描[13,15]由圖10可見，魚鱗多肽在螯合前結構疏松，表面光滑、透亮，呈圓球空心結構，與亞鐵離子螯合后呈致密的類似于鹽的結構，多肽分子表面覆蓋有許多白色晶粒，為小顆粒聚集體，應該是吸附在膠原多肽上面的亞鐵晶體。由此推斷，多肽分子與亞鐵離子之間除了配位結合、離子結合之外，還有一定的吸附作用。

3 討 論

富含鐵元素的食物需在體內轉化為二價鐵后才能被人體吸收利用，因此在合成魚鱗多肽螯合鐵的過程中，為防止亞鐵離子的氧化，需加入抗氧化劑進行保護。魚鱗作為水產加工的常見下腳料，通過蛋白酶水解后得到多肽，與亞鐵離子螯合后，不僅提高了生物利用度，還具有了抑菌、抗氧化、防貧血等多種生理功能[4,10,19]。由于原料價廉易得，技術路線簡單，容易實現工業化生產。

通過比對魚鱗多肽和魚鱗多肽螯合亞鐵的表征圖譜，推測亞鐵離子與魚鱗多肽的結合方式多樣，如Fe2+與多肽分子中羧基與氨基的配位結合、Fe2+與羧基陰離子的離子鍵結合以及多肽分子表面對Fe2+離子的吸附作用。為進一步弄清螯合產物的結構，可對螯合初產物進行超濾分離[19]，從而在下一步工作中繼續探討其生理活性和功能。

4 結 論

本研究以草魚魚鱗多肽和亞鐵鹽為原料，對其螯合反應的合成條件進行了系統研究，通過單因素實驗和正交實驗，得到魚鱗多肽亞鐵螯合物的最優條件為：抗壞血酸與亞鐵鹽的質量比為0.150∶1，魚鱗多肽與亞鐵鹽的質量比為2∶1，pH 5，螯合時間為40 min，反應溫度為30 ℃，在此條件下測得的鐵螯合率為83.4 %。比大豆多肽亞鐵螯合物[6]的螯合率(86.6 %)略低，但稍高于帶魚蛋白螯合多肽亞鐵[12]的螯合率(80.46 %)。螯合率差異的存在可能與多種因素有關，如原料類型、由不同原料得到的多肽中氨基酸組成、分子量分布等，從而導致各自螯合條件不同，鐵與多肽螯合的產率有高有低。

紫外、紅外光譜分析以及X衍射分析和電鏡掃描對原料魚鱗多肽和其亞鐵螯合物進行表征，說明了亞鐵離子與氨基以及羧基以共價鍵的形式結合，合成出新型的魚鱗多肽亞鐵螯合物，為魚鱗廢棄物的綜合利用提供了基礎，后續工作中將對該螯合產物生理活性開展進一步的研究。