鈣周期蛋白S100A6在子宮腺肌病患者相關組織中的表達

李妍儀 申英 張秀艷

子宮腺肌病(adenomyosis，AM)為育齡期女性常見卻難治的一種良性疾病，其定義為子宮內膜的腺體及間質侵入子宮肌層形成的病變，現已作為異常子宮出血FIGO分期(PALM-COEIN)中的一種獨立因素[1]。子宮腺肌病雖然是一種良性疾病，卻表現出一些類似惡性腫瘤的生物學行為，如異位病灶異常增殖、浸潤、甚至向鄰近組織侵襲等[2]。關于有活性的異位子宮內膜來源的學說有多種，如種植學說、體腔上皮化生學說、誘導學說、在位內膜決定論等。子宮腺肌病患者的主要臨床表現是月經改變(常見經量增多、經期延長)和痛經進行性加重。進行性加重的痛經對子宮腺肌病患者的生活質量和心理健康造成了極其嚴重的影響。該病具有形態多、范圍廣、極具復發性的特點，致使其難以被早期診斷，越來越多的患者因不堪疾病反復發作的痛苦而選擇全子宮切除術這種徹底性的治療手段，對患者生育功能及生活質量造成了極大損害。然而目前子宮腺肌病的病因及發病機制以及痛經的發生機制卻尚未完全明確。鈣周期蛋白S100A6很可能通過誘導細胞分化、影響信號轉導通路等方式，改變細胞的增殖、遷移和凋亡能力，來參與腫瘤的發生發展過程。據此推測S100A6也可能通過誘導子宮內膜細胞發生浸潤和轉移[3]，參與子宮腺肌病和(或)子宮內膜異位癥的發生。本實驗通過研究S100A6在子宮腺肌病患者子宮相關組織中的表達水平，探索其在疾病發生發展過程中的作用及與患者痛經的關系，以期證明可以通過子宮內膜活檢等方法術前獲取患者子宮內膜，檢測子宮內膜組織中S100A6的表達，為術前診斷子宮腺肌病提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月至2017年8月在河北省承德市中心醫院婦科就診，行全子宮切除術，臨床病例資料完整的子宮腺肌病患者30例作為病例組；選取同期因子宮肌瘤行全子宮切除術的患者30例作為對照組。術前通過模擬視覺評分法(visual analogue score,VAS)對病例組子宮腺肌病患者進行痛經程度評分，輕度痛經10例中度痛經12例，重度痛經8例。2組患者年齡、BMI、孕次、產次、經期、月經周期相比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組臨床特點比較

1.2 入選標準 所有病例的診斷經病理組織學證實，2組患者均未絕經、未放置宮內節育器及術前6個月內均未使用過激素類藥物。子宮腺肌病患者，且不同時患有子宮內膜異位癥。本研究經過醫院倫理委員會批準，患者知情同意。

1.3 免疫組化法檢測S100A6 分別選取病例組包埋在位子宮內膜組織、子宮肌層異位內膜組織蠟塊和對照組包埋正常子宮內膜組織蠟塊。全部石蠟標本入選后進行4 μm厚連續切片，置于玻片，60℃烤片過夜，常規脫蠟水化，蒸餾水水洗2次,檸檬酸高溫高壓修復2 min，PBS洗5 min×3次。3%雙氧水處理10 min，PBS洗5 min×3次，每張切片依次滴加S100一抗4℃冰箱過夜，PBS洗5 min×3次，二抗孵育20 min，PBS洗5 min×3次，DAB進行顯色10 min，蘇木紫復染，最后常規脫水透明，進行封片。在高倍鏡下對圖像進行觀察分析。實驗相應的試劑：免疫組織化學染色Rabbit Anti-S100A6 antibody，購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.4 結果判讀 結果判定在雙盲下進行，由至少2名經驗豐富的病理科醫師分別閱片和統計結果。陽性標準：細胞漿和(或)胞膜、胞核出現棕黃色顆粒標記為陽性。陽性判斷：在100倍光學顯微鏡下觀察，然后在400倍光學顯微鏡下隨機計數5個視野。評分標準：(1)染色細胞率計分：0～5%評0分；6%～40%評1分；41%～70%評2分；>70%評3分。(2)染色強度計分：無著色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。每張切片免疫組化染色評分(IRS)=染色細胞率分數+染色強度分數。IRS分數<1分為陰性(-)，分數≥1分為陽性。陽性強度根據所得分值分為3個等級：1～2分記為弱陽性(+)；3～4分記為中度陽性(++)；5～6分記為強陽性(+++)。

2 結果

2.1 3組A100A6免疫組化染色 病例組在位內膜、異位內膜的子宮內膜上皮細胞和間質中均可檢測到S100A6的表達，其主要表達于子宮內膜的上皮細胞和間質細胞的胞質和胞膜(呈淡黃色、棕黃色或棕褐色)。圖1可見子宮內膜腺體組織異位至子宮肌層組織中，稱之為異位內膜。S100A6在對照組正常子宮內膜組織中無表達。見圖1～3。

2.2 3組S100A6表達及其陽性率比較 病例組在位內膜、異位內膜S100A6的表達陽性率分別為80%和70%，對照組正常子宮內膜的S100A6表達陽性率為33.33%。見表2。

2.3 3組S100A6表達水平比較

2.3.1 病例組在位子宮內膜與對照組正常子宮內膜S100A6表達:病例組在位子宮內膜S100A6表達水平高于對照組(Z=-3.745，P=0.00018)。見表3。

2.3.2 病例組異位子宮內膜與對照組正常子宮內膜S100A6表達:病例組異位內膜的S100A6表達水平高于對照組(Z=-3.215，P=0.001)。見表3。

圖1 病例組異位內膜組織中S100A6的表達(免疫組化×400)圖2 病例組在位子宮內膜組織中S100A6的表達(免疫組化×400)圖3 對照組正常子宮內膜組織中S100A6的表達(免疫組化×400)

表2 S100A6在子宮腺肌病組和對照組中的表達 n=30，例

表3 3組S100A6 的表達水平 n=30，例

2.3.3 病例組在位子宮內膜與病例組異位子宮內膜S100A6表達:病例組在位內膜S100A6的表達水平與病例組異位內膜相似(Z=-1.134，P=0.257)。

2.4 S100A6在子宮腺肌病患者在位內膜組織中的表達強度與痛經程度比較 不同痛經程度的患者在位子宮內膜組織中S100A6表達水平，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 S100A6在子宮腺肌病患者在位內膜組織中的表達強度與痛經程度比較 例

3 討論

據不完全統計，子宮腺肌病患者的痛經率高達64.8%～77.8%[4]，近年來其發病率顯著提高，但迄今為止，其發病機制仍不清楚。目前子宮腺肌病的主要治療方法包括(1)藥物治療如：應用促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a)、無相對禁忌證的女性應用左炔諾孕酮宮內緩釋系統(LNG-IUS)以及口服抗雌激素藥物等；(2)介入治療如：子宮動脈栓塞、高強度聚焦超聲(HIFU)等[5]；(3)手術治療：開腹或腹腔鏡子宮切除術、子宮肌層異位病灶切除術等。因藥物治療時，患者不良反應多，停藥后癥狀易復發，大多數患者因無法忍受進行性加重的痛經而最終選擇全子宮切除術這種極端的治療手段。如今子宮腺肌病患者群體趨于年輕化，選擇子宮切除術無法保留其生育功能，保守治療復發率高，臨床醫生在選擇治療方案時進退兩難，越來越多的臨床醫生及患者亟待新的治療方法出現。現子宮腺肌病痛經的發病機制尚不完全明確，仍在不斷探討的過程中，可能是由EMJZ區的功能失調、神經源性因素、異常的激素水平、炎性反應等多種因素共同介導。許多神經遞質(細胞因子、肽類激素等)及相應受體的表達可鏈接神經系統、內分泌系統和免疫系統，參與這幾大系統之間的信息交流，使其互相影響，共同發揮作用，最終導致AM患者產生痛經等臨床癥狀。其中最被廣泛接受及認可的發病機制是子宮內膜-肌層交界區功能失調。子宮內膜-肌層交界區(endometrial-myometrial iunctional zone，EMJZ)是子宮內膜基底層和子宮肌層(IM)之間的區域。由組織損傷等因素導致EMJZ結構發生改變，增加了該部位的張力，進而促進了雌激素分泌，分泌過多的雌激素可上調子宮肌層細胞上催產素受體的表達，其作用是誘導產生更多的過度運動，進而導致更多EMJZ區組織的損傷，使基底層子宮內膜腺體和基質組織進一步向子宮肌層的深處移位，形成子宮腺肌病的病灶，引發痛經[6]。神經生長也是引起疼痛的直接原因，考慮為有髓神經纖維與無髓神經C纖維發揮重要作用[7]，而S100則是高度特異性表達于此類神經纖維的標記物[8]，同時也是子宮內膜異位癥及子宮腺肌病常用的神經標記物[9,10]。

本課題針對S100A6在AM患者相關組織中的表達情況進行研究。S100A6蛋白即鈣周期蛋白，是S100蛋白家族的成員之一，S100A6蛋白相對分子質量為10 235，像其他S100蛋白家族成員一樣，其活性形式為同源二聚體。S100A6蛋白與鈣離子結合后，其EF手型經典區得到暴露，進而可以與多種靶蛋白結合(原肌球蛋白、膜聯蛋白Ⅱ、Ⅵ、Ⅺ、鈣調結合蛋白等)[11]。S100A6蛋白最初由Kuznicki和Filipek在Ehrlich腹水瘤中檢出，主要存在于細胞的胞質、胞膜及核被膜上(包括核膜內表面)[12]。近年研究已經發現2條有關S100A6在細胞增殖、凋亡、腫瘤發生、浸潤和轉移等過程中發揮作用的信號通路：一是S100A6可能通過RAGE(晚期糖基化終末產物受體)信號通路發生作用[13]，RAGE作為一種細胞膜表面受體，通過第2個C型S100A6主要與RAGE的第 2個 C型免疫球蛋白結構域與S100A6蛋白結合并發揮細胞外信號傳導作用。其機制可能是通過激活ROS依賴性的c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminalkinase,JNK)及凋亡蛋白酶3和7來引起神經細胞凋亡，從而激活下游的NF-kB轉錄因子調節的一些促進生存和(或)抗凋亡通路；二是發現S100A6通過結合CacyBP/SIP蛋白，阻斷β-catenin磷酸化，使β-catenin增多。而后者是Wnt信號通路的關鍵分子，Wnt與跨膜Frlzzled家族受體的N末端細胞富含半胱氨酸的結構域和輔受體脂蛋白受體相關蛋白(LRP)5/6結合時，使得Dishevelled蛋白活化，將信號傳遞到細胞內，抑制破壞復合物Axin，腺瘤病大腸桿菌(APC)，蛋白磷酸酶2A(PP2A)，糖原合成酶激酶3(GSK3)和酪蛋白激酶1α(CK1α)的活性，使得β-catenin磷酸化被阻斷，大量去磷酸化β-catenin轉移入核，并且這種信號與核因子轉錄因子/淋巴樣增強因子(TCF/LEF)相互結合，能進一步激活靶基因，從而能誘導疾病的發生發展[14]。結合近年來有關AM發病機制的基礎研究分析，認為S100A6很可能參與子宮腺肌病的發生。利用反義核酸技術阻斷S100A6的表達，是否可以抑制子宮腺肌病的轉移和復發[15]，有待進一步研究。

劉澤群等[16]研究發現：S100A6在子宮腺肌病患者子宮內膜間質細胞中存在高表達，并推斷其可能參與子宮腺肌病的發生，且在子宮腺肌病患者疼痛的發生發展過程中起重要作用，其通過影響細胞的增殖、遷移和凋亡能力，造成子宮腺肌病異位內膜的轉移和浸潤性生長。車璇等[8]通過檢測子宮腺肌病患者子宮內膜-肌層交界區S100蛋白及蛋白基因產物9.5(PGP9.5)的表達，并探究其與子宮腺肌病發病機制及患者痛經的關系，結論是：子宮腺肌病患者子宮內膜-肌層交界區S100蛋白與PGP9.5的表達異常增高，這可能參與子宮腺肌病的發病機制，并可能在子宮腺肌病患者疼痛的發生中起重要作用。Tokushige等[7]發現，在嚴重痛經和性交困難的子宮內膜異位癥患者直腸陰道子宮內膜異位病灶中出現了由非特性抗體 S100 蛋白染色的神經纖維[7]。但對于同時檢測子宮腺肌病患者在位子宮內膜和異位內膜中S100A6的表達情況的相關研究比較少見。本研究通過檢測S100A6在病例組子宮腺肌病患者在位子宮內膜、異位內膜和對照組子宮內膜中的表達水平發現：病例組在位子宮內膜和異位到肌層的子宮內膜組織中S100A6的表達水平均高于對照組，且差異有統計學意義(P<0.05)。子宮腺肌病患者相關組織中表達異常增高的S100A6與患者痛經程度存在正相關，可由此推斷，S100A6可作為子宮腺肌病的一種診斷參考指標。同時，本研究通過檢測同一位子宮腺肌病患者在位內膜和異位到肌層的子宮內膜組織中S100A6的表達情況，得出結論：病例組在位內膜S100A6的表達水平與病例組異位內膜相似，差異無統計學意義(P>0.05)，故推測可以通過術前子宮內膜活檢等方法獲取患者子宮內膜組織，通過病理免疫組化法檢測子宮內膜組織中S100A6的表達，作為診斷子宮腺肌病的重要參考指標，亦可根據其表達程度評估患者病情嚴重程度。

李蘊薇等[17]研究結果顯示221例子宮腺肌病患者中72.4%血清CA125水平升高，痛經癥狀及其嚴重程度與血清CA125水平升高有關。給予GnRH-a后血清CA125水平能明顯下降。CA125是目前研究比較透徹，亦最常用于子宮內膜異位癥診斷的一種糖蛋白、其檢測敏感性與疾病嚴重程度呈正相關。但單獨檢測CA125表達水平，其診斷特異性較低，因此目前國內外大量研究推薦聯合其他指標進行檢測。張清等[18]的研究結果提示CA125聯合CA199可將診斷敏感度提高到60%。Agic等[19]發現CA125聯合檢測CCR1mRNA(趨化因子受體-1信使RNA)和MCP1(單核細胞趨化蛋白-1)的表達水平，可以使診斷敏感性達到92.2%，特異性達到81.6%。Acimovic等[20]近年研究發現CA125聯合檢測生存素(survivin)和VEGF(血管內皮生長因子)，其敏感性可達到到93.3%，特異性可達到90%。但因本研究時間及經費有限，樣本量較小，只通過病理免疫組化檢測了S100A6這一種子宮腺肌病患者組織中的觀測指標。在之后的研究中可進一步擴大樣本量，增加血清學觀測指標(如CA125)，探究其與子宮內膜組織中S100A6聯合檢測子宮腺肌病，是否能提高診斷敏感性及特異性。

目前，子宮腺肌病難以用微創甚至無創的方法，診斷和評估病情嚴重程度[21]，影像學診斷為現今診斷子宮腺肌病的主要方法，特異性診斷子宮腺肌病的分子標志物尚未出現。本研究顯示，病例組在位內膜與子宮肌層異位內膜S100A6的表達水平相似，差異無統計學意義(P>0.05)，且兩者的S100A6的表達水平均高于對照組。因此推斷，可以通過子宮內膜活檢的方法，取得子宮腺肌病患者子宮內膜進行免疫組化染色，檢測S100A6的表達水平,將其作為診斷子宮腺肌病的一項重要參考指標。還可在子宮腺肌病患者保守治療前后取患者子宮內膜，進行免疫組化染色，檢測S100A6的表達水平，作為評價保守治療療效，甚至預測復發的一項指標。以后可進一步擴大樣本量，對上述內容進一步研究。