治中顆粒對腦缺血再灌注模型大鼠顳葉神經元凋亡的影響

王龍 張勇 黃燕 席麗娜 張明 呂建瑞

動脈硬化性腦梗死是指大腦中動脈系統的動脈粥樣硬化和血栓形成使動脈管腔狹窄，導致該動脈供血區局部腦組織的壞死，臨床上表現為偏癱、講話不清等突然發生的神經功能缺損癥狀[1]。該病為最常見的腦血管病，中醫藥治療腦栓塞有豐富的臨床經驗，治中顆粒出自《備急千金要方》卷二十治中湯，主要成分為人參、干姜、甘草、(炙)、白術各9 g，用水1.6 L，煮取600 ml，去滓，每次溫服200 ml，3次/d。治五臟中寒，口噤失音，四肢強直。本文對該劑進行了與功能主治有關的藥效學試驗。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 SPF級雌性SD大鼠70只，體重180～220 g；由西安交通大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(陜)2015-002。大鼠晝夜循環光照,飼養在溫度19～28℃，相對濕度40%的潔凈環境中，喂食雙蒸水和購于動物中心的大鼠飼料，大鼠自由飲水和進食。

1.2 受試藥物 治中顆粒，用法用量：口服，5 g/次，3次/d；規格：5 g/袋，每袋相當于12 g生藥；由西安交通大學附屬第二醫院提供，批號：20171103。銀杏葉片，用法用量：口服：2片/次，3次/d；規格：0.2 g；石家莊以嶺藥業股份有限公司，批號：170116。

1.3 試劑 枸櫞酸鈉，批號：20160718，國藥集團化學試劑有限公司。枸櫞酸，批號：20160313，國藥集團化學試劑有限公司。PBS磷酸緩沖液，批號：20180221，北京Solarbio科技有限公司。大鼠含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)一抗，13A111，博士德生物工程有限公司。大鼠凋亡誘導因子(AIF)一抗，13F57，博士德生物工程有限公司。多聚甲醛，批號：F20160417，國藥集團化學試劑有限公司。TMS-P超敏試劑盒，批號：1703261406，福建邁新生物技術開發有限公司。DAB顯色試劑盒，批號：1705110031福建邁新生物技術開發有限公司。

1.4 儀器 YG-280KX型陽光神琦攤片機。YG-280KX型陽光神琦烤片機。TP1020型徠卡自動脫水機。Leica切片機。BX53型奧林巴斯光電顯微鏡。

1.5 研究方法

1.5.1 動物分組、造模、給藥方法：70只SPF級SD大鼠隨機選取10只為假手術組，其余60只大鼠隨機分為模型組、治中顆粒低劑量組(3.24 g生藥/kg)、治中顆粒中劑量組(6.48 g生藥/kg)、治中顆粒高劑量組(12.96生藥/kg)、銀杏葉片組(0.108 g/kg)，每組12只。給藥體積為10 ml·kg-1·d-1，假手術組和模型組灌胃等體積蒸餾水。大鼠腹腔注射6 ml/kg的水合氯醛溶液(5%)麻醉，大鼠仰臥位固定，頸部褪毛、消毒，分離、雙側頸總動脈，在其下置線備用。待所有大鼠自然蘇醒3 h后，用無創性微動脈夾夾閉雙側頸總動脈20 min后，松夾進行再灌注，止血后，涂青霉素粉，縫合皮膚。大鼠缺血30～60 s 內昏迷，翻正反射消失、雙側瞳孔放大為造模成功，剔除6組因實驗操作死亡的動物。假手術組只分離雙側頸動脈，不夾閉雙側頸總動脈[2]。造模后繼續灌胃給藥14 d。

1.5.2 大鼠腦組織灌流方法:末次給藥1 h后，6組大鼠腹腔注射6 ml/kg 的水合氯醛溶液(5%)麻醉，大鼠仰臥位固定，開胸暴露心臟，將灌注針刺入左心室，右心耳剪孔，使用200 ml 0.9%氯化鈉溶液沖洗，然后用4%多聚甲醛固定液灌流，直至身體逐漸僵硬震顫為止。開顱取腦，腦組織行冠狀位切片，置于4%多聚甲酸溶液(pH值7.4，0.01 mol/L PBS配制)中固定24 h。固定后的腦組織用乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片進行HE染色以及Caspase-3和AIF在顳葉神經元表達的檢測[3]。

1.5.3 大鼠腦顳葉神經HE染色方法：切片用二甲苯(Ⅰ)透明15 min，二甲苯(Ⅱ)透明15 min， 100%乙醇(Ⅰ)浸泡5 min，100%乙醇(Ⅱ)浸泡5 min，80%乙醇浸泡5 min，蒸餾水浸泡5 min，蘇木精液染色 5 min，流水稍洗去蘇木精液3 s，1%鹽酸乙醇3 s，水洗30 s，0.5%伊紅液染色3 min，蒸餾水洗2 s，80%乙醇洗2 s，95%乙醇(Ⅰ)3 s，95%乙醇(Ⅱ)5 s，無水乙醇浸泡10 min，二甲苯(Ⅰ)浸泡2 min，二甲苯(Ⅱ)浸泡2 min，二甲苯(Ⅲ)浸泡2 min，中性樹膠封固。將切片置于200 倍顯微鏡下觀察6組大鼠顳葉皮層神經元染色結果[4]。

1.5.4 免疫組化方法檢測大鼠腦顳葉神經元Caspase-3和AIF的表達：石蠟切片，在烘箱中60℃烘烤3 h，然后切片用二甲苯(Ⅰ)透明15 min，二甲苯(Ⅱ) 透明15 min，100%乙醇(Ⅰ)浸泡5 min，100%乙醇(Ⅱ)浸泡5 min，80%乙醇浸泡5 min，蒸餾水浸泡5 min。用3%的H2O2去離子水孵育10 min。蒸餾水沖洗，使用PBS緩沖液浸泡3次，每次5 min。在檸檬酸鈉緩沖溶液中(pH值7.0)高壓修復5 min。室溫血清封閉15 min，傾去血清。滴加PBS稀釋的一抗(Caspase-3 1∶100，AIF 1∶200)，于37℃孵育2 h。使用PBS緩沖液浸泡3次，每次5 min。滴加生物素標記的二抗,37℃孵育1 h,PBS浸泡3次，每次5 min。滴加鏈霉親和素-過氧化物酶,于37℃孵育30 min。PBS浸泡3次，每次5 min。滴加(DAB)顯色劑顯色[5]。自來水沖洗。蘇木精液染色 5 min，流水稍洗去蘇木精液3 s，1%鹽酸乙醇3 s，水洗30 s，中性樹膠封片，免疫組化染色圖片采用ImageJ軟件進行灰度值分析，計算各組積分光密度值(integral optical density IOD)。IOD = log[gv0/gv]，gv0 為背景灰度值，gv為目標區灰度值[6]。

2 結果

2.1 6組大鼠腦顳葉皮層神經元HE染色結果 假手術組大鼠腦顳葉皮層神經元，結構清晰、完整，胞漿透明，胞核呈圓形或橢圓形，染色質分布均勻，核仁清晰，形態正常；模型對照組，大鼠腦顳葉皮層出現明顯的神經元損傷，細胞變性和死亡，細胞形態改變。腦顳葉皮層部分神經元結構不完整，細胞腫脹、破裂，輪廓模糊、界限不清，變性損傷的神經元失去了正常結構，其胞體呈三角形，細胞質濃縮、深染，細胞核固縮，核仁不明顯。給藥組與模型組相比均有所改善，其中治中顆粒中劑量組、治中顆粒高劑量組及銀杏葉片組神經元損傷程度具有較為明顯的改善。見圖1。

圖1 大鼠腦顳葉神經元(HE×200)；A 假手術組；B 模型組；C 治中顆粒低劑量組；D 治中顆粒中劑量組；E 治中顆粒高劑量組F 銀杏葉片組

2.2 6組大鼠腦顳葉神經元Caspase-3表達免疫組化圖片IOD值比較 與假手術組比較模型組Caspase-3表達顯著增加(P<0.01)。與模型組比較治中顆粒中劑量組、治中顆粒高劑量組及銀杏葉片組Caspase-3表達顯著降低(P<0.05)。見表1，圖2。

表1 6組大鼠腦前顳葉Caspase-3的表達結果比較

注：與假手術組比較,*P<0.01；與模型組比較,#P<0.05

2.3 6組大鼠腦顳葉神經元AIF表達免疫組化圖片IOD值比較 與假手術組比較模型組AIF表達顯著增加(P<0.01)。與模型組比較治中顆粒中劑量組、治中顆粒高劑量組及銀杏葉片組AIF表達顯著降低(P<0.05)。見表2,圖3。

圖2 大鼠腦顳葉神經元caspase-3表達結果(HE×200)；A 假手術組；B 模型組；C 治中顆粒低劑量組；D 治中顆粒中劑量組；E 治中顆粒高劑量組F：銀杏葉片組

表2 6組大鼠腦前顳葉AIF的表達結果比較

注：與假手術組比較,*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05

3 討論

腦動脈狹窄大腦由兩側頸內動脈和椎動脈供血，當其中一條動脈發生閉塞時，若側支循環良好，可不發生臨床缺血癥狀，如側支循環不良，或多條動脈發生狹窄時，則會使局部或全腦的腦血流(減少，產生腦缺血癥狀[7]。輕度動脈狹窄不影響血流量，當動脈縮窄至原有管腔橫斷面積的80%以上才足以使血流量減少。多條腦動脈狹窄對腦血流的影響更大，因為可能使全腦血流處于缺血的邊緣狀態，此時如果有全身性血壓波動，就可能誘發腦缺血。造成腦動脈狹窄的主要原因為動脈粥樣硬化，且絕大多數累及顱內的中等動脈，其中以頸動脈起始部受累的機會最多[8]。動脈粥樣硬化斑塊除了可以造成動脈管腔狹窄外，在斑塊上的附著物被血流沖刷脫落后形成栓子，隨血流進入顱內動脈，堵塞遠側動脈引起腦栓塞，造成供血區缺血。栓子常來源于頸內動脈起始部的動脈粥樣硬化斑塊。栓子可能很快分裂成碎片后溶解，或向遠側動脈移動。頸內動脈內的栓子大多隨血液的主流進入腦中動脈，引起相應的臨床癥狀。短暫的低血壓也可引起腦缺血，如果腦血管狹窄嚴重，使腦血流處于少血狀態時，輕度的血壓降低就可以引起腦缺血，如心肌梗死、休克、直立性低血壓等[9]。本研究中的治中顆粒，由人參、干姜、甘草、(炙)、白術組成，所含藥物具有擴張動脈及升高血壓的作用，因此可以用于治療腦缺血性疾病。

圖3 大鼠腦顳葉神經元AIF表達結果(HE×200)；A假手術組；B 模型組；C 治中顆粒低劑量組；D 治中顆粒中劑量組；E 治中顆粒高劑量組；F 銀杏葉片組

由于神經元本身儲存的能量物質ATP或ATP代謝底物很有限，大腦需要持續的腦血流來供應葡萄糖和氧。當腦血流下降時，腦組織通過自動調節機制來調節血流，最大限度地減少腦缺血對神經元的影響[10]。但當腦血流下降到一定閾值，腦自動調節機制失代償，則可引起腦功能性或器質性改變。腦血流<10～12 ml·100 g-1·min-1時，ATP耗竭，膜磷脂降解，K+從神經元內釋放到細胞外，Ca2+則大量進入神經元內，引起神經元鈣超載，星形膠質細胞內Na+、Cl-和水分異常增加，細胞破壞死亡[11]。本研究結果表明大鼠雙側頸動脈結扎20 min后，大鼠腦顳葉皮層神經元出現明顯的損傷，細胞形態改變，細胞變性和死亡，治中顆粒中劑量組、治中顆粒高劑量組及銀杏葉片組與模型組相比神經元損傷有明顯改善。

腦缺血后缺血核心區腦血流停止，細胞膜穩定性被破壞，細胞內容物釋放，細胞死亡或凋亡，細胞凋亡是腦缺血后的細胞損害的主要形式，特別是缺血半暗區的神經元或暫時性腦缺血伴再灌注等缺血程度相對較輕的區域[12]。形態學上細胞凋亡表現為染色質的濃縮和折疊或形成碎片，細胞皺縮，并在胞質內出現凋亡小體[13]。Caspase為含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶。Caspase為存在于細胞質中具有相似結構的蛋白酶。Caspase是一類蛋白酶家族，Caspase-1亞族包含 Caspase-1、4、5、11；Caspase-2亞族包含Caspase-2、9；Caspase-3亞族包含Caspase-3、6、7、8、10。正常的細胞中，每一種Caspase都以非活化狀態存在的，這種非活化的Caspase稱作酶原，它是酶的非活性前體，其肽鏈比有活性的長一些，將多出的部分切除，就轉變成有活性的Caspase[14]。Caspase有兩類，分為起始者和執行者,外來蛋白信號切割激活起始Caspase，起始Caspase切割執行者Caspase并使之激活，被激活的執行者Caspase通過對靶蛋白的水解，導致細胞程序性死亡。凋亡誘導因子(AIF)是一類存在于線粒體內外膜間隙的保守的黃素蛋白。AIF具有雙重功能，在細胞正常的生理狀態下，AIF可作為線粒體氧化還原酶，能催化細胞色素c和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)之間的電子傳遞；當細胞受到凋亡的刺激時， AIF從線粒體中轉移到細胞質內，然后進入細胞核，引起細胞核內DNA凝集并斷裂成50 kb大小的片段，這是其與典型細胞凋亡的區別[15]。本研究中與模型組比較治中顆粒中劑量組、治中顆粒高劑量組及銀杏葉片組Caspase-3、AIF表達顯著降低，說明治中顆粒可以通過調節Caspase-3和AIF在神經元中的表達，而抑制腦缺血再灌注引起的神經元凋亡。

綜上所述，治中顆粒可通過調節Caspase-3和AIF在神經元中的表達對腦缺血再灌注模型產生保護作用，以上藥效學結果為治中顆粒在臨床上治療腦缺血性疾病提供了試驗依據。