藏藥熏倒牛種子及其萌發(fā)特性研究

柳娜，謝田朋，劉越敏，曲馨，景明

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000)

藏藥熏倒牛(BiebersteiniaheterostemonMaxim.)為牻牛兒苗科熏倒牛屬植物，藥用部位為地上部分。藏名音譯為明見(jiàn)賽保,民間又稱(chēng)為臭花椒、狼尾巴，為藏醫(yī)專(zhuān)用和特色藥材之一[1]。《晶珠本草》中記載熏倒牛味辛、苦，性寒，具有消腫止痛、清熱解毒、涼血、祛風(fēng)的功效，用于治療各種炎癥、結(jié)核、丹毒、瘧疾、咽喉腫痛、胃痛、全身水腫、卒中等癥[2]。主要分布在甘肅、青海、寧夏、四川等地區(qū)[3-4]。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要集中研究熏倒牛的化學(xué)成分及藥理藥效等方面，有關(guān)熏倒牛的種子繁育未見(jiàn)報(bào)道，本試驗(yàn)開(kāi)展熏倒牛的種子及其萌發(fā)特性研究，可為熏倒牛的應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 熏倒牛種子于2018年10月采自定西市安定區(qū)團(tuán)結(jié)鎮(zhèn)聯(lián)莊村，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)陳垣教授鑒定為熏倒牛(BiebersteiniaheterostemonMaxim.)正品，野外采集的種子于實(shí)驗(yàn)室中自然分干，剔除不飽滿(mǎn)不成熟的種子，置于具塞廣口瓶中，室溫保存?zhèn)溆茫怀嗝顾?GA3(山東瑞普生物科技有限公司)；萘乙酸 NAA(四川國(guó)光農(nóng)化股份有限公司)；吲哚乙酸 IAA(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；顯微成像儀 (尼康-80i型，上海德沃斯科技儀器有限公司)；超純水機(jī)(型號(hào)：FCR1502-UF-P，青島富勒姆科技有限公司)；電子天平[型號(hào)：ME103E/02，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；電熱恒溫鼓風(fēng)燥箱(型號(hào)：GZX-GF101-1-BS-Ⅱ/H，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)；鋼尺。

1.2 種子基本形態(tài)測(cè)定 熏倒牛種子形態(tài)及千粒重：采用立體顯微鏡下觀(guān)察熏倒牛種子形狀、顏色及大小。隨機(jī)取風(fēng)干的種子1 000粒稱(chēng)重，重復(fù)5次，換算種子的千粒重。

種子含水量測(cè)定[5]：稱(chēng)取1 g種子置于干燥至恒重的稱(chēng)量瓶中，于90 ℃烘箱中烘干，第一次稱(chēng)重時(shí)間為2 h，其次稱(chēng)重時(shí)間為每隔12 h一次，直至稱(chēng)重樣品3次恒重為止，設(shè)置5組重復(fù)試驗(yàn)，計(jì)算平均值，種子含水量計(jì)算公式如下：

種子含水量(%)=(W0-Wt)/W0×100%

注：式中W0為烘干前種子的重量，Wt為烘干后種子的重量。

種子吸水率[5]：稱(chēng)取約1 g種子，置于培養(yǎng)皿中，加入種子3倍量的蒸餾水，置于(20±1)℃恒溫培養(yǎng)箱中，每隔4 h取出種子吸干表面水分后稱(chēng)重，再放回培養(yǎng)皿中繼續(xù)吸水，反復(fù)操作直至稱(chēng)重樣品連續(xù)3次恒定為止，設(shè)5組重復(fù)，計(jì)算平均值。吸水率計(jì)算公式如下：

種子吸水率(%)=(Wt-W0)/W0×100%

注:式中W0為吸水試驗(yàn)前種子的重量，Wt為吸水后種子的重量。

1.3 種子萌發(fā)試驗(yàn)

1.3.1 不同培養(yǎng)溫度處理 取約400粒種子，放入盛有濃度為25%的濃硫酸溶液中浸泡60 min，倒去溶液，用蒸餾水沖洗2～3次后，瀝干水后用0.1%高錳酸鉀溶液消毒20 min。取培養(yǎng)皿3個(gè)，分別墊2層干凈的濾紙于培養(yǎng)皿中，編號(hào)1～3號(hào)，每皿擺放100粒種子，加蓋，置于15、20、25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在培養(yǎng)期間添加無(wú)菌水保持濾紙濕潤(rùn)，觀(guān)察種子發(fā)芽情況[7]。

1.3.2 不同溫度浸種處理 取約600粒種子，放入盛有25%的濃硫酸溶液中浸泡60 min，倒去溶液，用蒸餾水沖洗2～3次。將種子分別置于溫度為20、30、40、50、60 ℃水中浸泡60 min。取出瀝干水分后，各組用0.1%高錳酸鉀溶液浸泡60 min，蒸餾水沖洗2～3次。取鋪有2層潤(rùn)濕濾紙的培養(yǎng)皿，編號(hào)，將處理過(guò)的各組種子分別置于相應(yīng)編號(hào)的培養(yǎng)皿中，每組重復(fù)3次。置于(20±1)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在培養(yǎng)期間田間無(wú)菌水保持濾紙濕潤(rùn)，觀(guān)察種子發(fā)芽情況。

1.3.3 不同植物激素處理 按照表1的設(shè)置分別配置5個(gè)濃度梯度的GA3、IAA、NAA作為試驗(yàn)組，以蒸餾水作為對(duì)照組；取一定量的熏倒牛種子置于盛有25% 100 mL的濃硫酸的燒杯中浸泡60 min，倒去溶液，用蒸餾水沖洗2～3次，依次放入有各組有編號(hào)的植物生長(zhǎng)素濃度的燒杯中浸泡60 min，對(duì)照組為用蒸餾水處理，浸泡30 min。各組用0.1%的高錳酸鉀溶液消毒20 min，用蒸餾水沖洗2～3次。取培養(yǎng)皿，按照分組，將處理后的種子置于鋪有2層濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，放入(20±1)℃中進(jìn)行種子萌發(fā)試驗(yàn)，在培養(yǎng)期間添加無(wú)菌水以保持培養(yǎng)皿中濕潤(rùn)，觀(guān)察并記錄種子的發(fā)芽情況，從萌發(fā)開(kāi)始至種子不在萌發(fā)，計(jì)算其種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)。

表1 不同植物激素及濃度設(shè)置

1.3.4 種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)及最終發(fā)芽率的計(jì)算[8-10]

種子發(fā)芽勢(shì)(%)=(發(fā)芽高峰期天數(shù)內(nèi)發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子數(shù))×100%

種子發(fā)芽率(%) =(規(guī)定時(shí)間內(nèi)發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子數(shù))×100%

最終發(fā)芽率(%)=(最終發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%

根長(zhǎng)的測(cè)定：萌發(fā)結(jié)束后，按照隨機(jī)選株的方式，從每個(gè)培養(yǎng)皿中選取5株，用刻度尺分別測(cè)量根的長(zhǎng)度。

1.3.5 試驗(yàn)管理 試驗(yàn)開(kāi)始之后，每天觀(guān)察記錄，保持濾紙濕潤(rùn)，記錄種子萌發(fā)時(shí)間(以種子突破種皮，長(zhǎng)度達(dá)到種子一半時(shí)記為萌發(fā))培養(yǎng)20 d后，統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)數(shù)，記為發(fā)芽鋁盒發(fā)芽勢(shì)，取3次平均值。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel統(tǒng)計(jì)，SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 熏倒牛植株及種子基本形態(tài) 熏倒牛植株根粗壯,紡錘形,表皮褐色和黃褐色；莖直立，呈圓柱狀，有明顯的縱棱,表皮黃棕色至棕褐色,密被黑色腺毛和柔毛；多葉少枝，有棕色托葉，葉互生,呈倒披針形,葉片 2～3回羽狀深裂或全裂；小裂片條狀披針形,皺縮；著生長(zhǎng)黃褐色柔毛和腺；花序長(zhǎng)，葉狀苞片，披針形，為單毛所覆蓋，花瓣 5,倒卵形,淡黃色,排列緊密,與萼片等長(zhǎng)或稍短。花萼 5,宿存,黑色,被腺毛和柔毛。熏倒牛種子呈腎型，種皮有皺紋，呈棕褐色，較堅(jiān)硬，長(zhǎng)約2 mm，寬約1.5 mm，如圖1所示。

試驗(yàn)結(jié)果顯示熏倒牛種子的千粒重為2.929 g，種子含水量為5.84%，吸水曲線(xiàn)如圖2所示，熏倒牛種子吸水特點(diǎn)總體上前24 h吸水量直線(xiàn)上升，至24 h吸水率達(dá)到46.8%，在30 h之后，吸水速率逐漸減緩，直至42 h后趨于飽和，48 h吸水率為53.2%。

2.2 熏倒牛種子萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 不同培養(yǎng)溫度對(duì)熏倒牛種子萌發(fā)的影響 種子萌發(fā)是指種子從吸脹作用開(kāi)始的一系列有序的生理過(guò)程和形態(tài)發(fā)生過(guò)程。而溫度直接影響種子內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解和其他一系列的生理活動(dòng)，不同溫度對(duì)熏倒牛種子的萌發(fā)影響(見(jiàn)圖3)。

由圖3可知，在10～25 ℃溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，發(fā)芽率提高，發(fā)芽速度加快，溫度對(duì)于熏倒牛種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)以及最終發(fā)芽率的影響趨勢(shì)相似。其中在25 ℃條件下發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)最高，分別達(dá)到31%和 37%。不同的溫度條件下熏倒牛種子的發(fā)芽率勢(shì)和發(fā)芽率存在差異，除20 ℃與25 ℃條件下發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)差異不顯著外，其他各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，即說(shuō)明溫度達(dá)到20 ℃后，溫度的增加對(duì)于發(fā)芽率的影響不大。

2.2.2 不同浸種溫度處理對(duì)于熏倒牛種子萌發(fā)的影響 采用不同溫度進(jìn)行浸種處理旨在研究不同溫度對(duì)于打破熏倒牛種子休眠的影響，研究結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知不同溫度對(duì)于熏倒牛種子的萌發(fā)具有一定的影響，20 ℃與60 ℃發(fā)芽勢(shì)差異不顯著，30 ℃與50 ℃發(fā)芽率差異不顯著，40 ℃與50 ℃浸種溫度條件下熏倒牛種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)差異均不顯著外，其余各組不同溫度下發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中40 ℃浸種處理發(fā)芽率最高，發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)分別達(dá)到 22%和24%，比20 ℃高12%。

2.2.3 不同植物激素對(duì)于熏倒牛種子萌發(fā)的影響 植物激素是植物自身合成的具有調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育功能的有機(jī)物質(zhì)，對(duì)于種子萌發(fā)和植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有多方面的調(diào)節(jié)作用。本試驗(yàn)研究了不同濃度梯度的GA3、IAA、NAA對(duì)于熏倒牛種子萌發(fā)的影響，研究結(jié)果如圖5～7所示。

試驗(yàn)結(jié)果表明，在一定的濃度范圍內(nèi)，隨著植物激素濃度的增加，熏倒牛種子發(fā)芽率逐漸提高，當(dāng)濃度超過(guò)臨界濃度時(shí)，表現(xiàn)出抑制作用。GA3與IAA對(duì)于熏倒牛種子萌發(fā)的臨界濃度相同，均為180 mg·mL-1。其中GA3作用下的熏倒牛種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和最終發(fā)芽率分別為53%、31%和58%；IAA作用下的熏倒牛種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和最終發(fā)芽率分別為46%、31%和49%。而NAA對(duì)于熏倒牛種子萌發(fā)的臨界濃度為140 mg·mL-1，發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和最終發(fā)芽率分別為32%、21%和39%。3種植物激素在不同濃度梯度下對(duì)于熏倒牛種子萌發(fā)的影響具有一定的差異性，其中GA3組除140與220 mg·mL-1濃度條件下發(fā)芽率與發(fā)芽勢(shì)差異不顯著外，其他各組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；IAA除60與120、220 mg·mL-1濃度條件下差異不顯著和120與220 mg·mL-1濃度條件下差異不顯著外，其他各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；NAA除0與60 mg·mL-1、220與180 mg·mL-1、140和60 mg·mL-1濃度條件下差異不顯著外，其他各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

同一濃度下比較結(jié)果顯示GA3與IAA在各濃度梯度下對(duì)于熏倒牛種子的萌發(fā)作用不存在顯著性差異，但與NAA在180 mg·mL-1濃度下差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，IAA與NAA在140 mg·mL-1和180 mg·mL-1濃度下差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由此可以看出，本試驗(yàn)中3種植物激素對(duì)于熏倒牛種子萌發(fā)的影響，表現(xiàn)為GA3>IAA>NAA。即GA3對(duì)于種子萌發(fā)的作用最強(qiáng)，最佳濃度為180 mg·mL-1。

2.2.4 不同濃度的植物生長(zhǎng)激素對(duì)于熏倒牛幼苗根長(zhǎng)的影響研究 不同的植物生長(zhǎng)激素對(duì)于熏倒牛幼苗根長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，不同的植物生長(zhǎng)激素對(duì)于幼苗根長(zhǎng)的影響趨勢(shì)相同，植物激素濃度與幼苗根長(zhǎng)存在正相關(guān)，相同的試驗(yàn)時(shí)間內(nèi)3種植物激素不同濃度條件所對(duì)應(yīng)的幼苗根長(zhǎng)如圖8所示，其中GA3對(duì)于幼苗根長(zhǎng)的促進(jìn)作用最強(qiáng)，0 mg·mL-1GA3作用下幼苗根長(zhǎng)僅為2 mm，而220 mg·mL-1濃度下根長(zhǎng)最長(zhǎng)，達(dá)到4.1 cm，如圖9所示。不同濃度下的植物激素對(duì)于熏倒牛幼苗根長(zhǎng)存在差異，其中GA3除120與180 mg·mL-1差異不明顯外，其他各濃度之間存在顯著性差異(P<0.05)；IAA除120與0、140 mg·mL-1沒(méi)有顯著性差異，其他各組間差異顯著(P<0.05)。NAA除120與140、180與220、140 mg·mL-1組差異不顯著，其他各組間存在顯著性差異(P<0.05)。同一濃度下3種激素的比較結(jié)果顯示GA3與IAA、NAA在140 mg·mL-1與220 mg·mL-1濃度梯度下存在顯著性差異，IAA與NAA在100 mg·mL-1濃度下具有顯著性差異，其余各組差異不顯著。

3 結(jié)論與討論

種子萌發(fā)受多種因素影響， 包括外部的生態(tài)環(huán)境因素和內(nèi)部的生理因素[11]。熏倒牛種子種皮堅(jiān)硬，結(jié)構(gòu)致密,透水、透氣性較差，同時(shí)種子內(nèi)部受到脫落酸(ABA)和香豆素等物質(zhì)的抑制，是致使其休眠的主要原因。采用不同溫度浸種處理或采用外源性植物激素能夠增強(qiáng)其透水性、透氣性，也能消除種子抑制物質(zhì)，促進(jìn)植物提早發(fā)芽[12]，本試驗(yàn)研究結(jié)論如下。

3.1 采用不同培養(yǎng)溫度處理熏倒牛種子結(jié)果顯示種子在25 ℃條件下發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)最高，各組之間統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明溫度達(dá)到20 ℃后，溫度的增加對(duì)于發(fā)芽率的影響不大。熏倒牛多分布在海拔1 000～3 700 m的黃土山坡、海灘地和草坡地，溫度在10 ℃以上的季節(jié)多在5月中下旬，考慮到要充分利用季溫和出苗率，生產(chǎn)上熏倒牛的直播時(shí)間應(yīng)接近5月中下旬為益。

3.2 采用不同的浸種溫度處理熏倒牛種子發(fā)現(xiàn)，隨著浸種溫度的升高，種子發(fā)芽率逐漸提高。當(dāng)溫度大于40 ℃時(shí)，種子發(fā)芽率逐漸降低，在60 ℃時(shí)種子的發(fā)芽率僅為4%。以上原因是熏倒牛種子種皮透水性好，超過(guò)40 ℃的水浸透種皮燙傷種胚，從而影響了種子萌發(fā)。

3.3 采用不同濃度的3種植物激素處理熏倒牛種子發(fā)現(xiàn)，在20 ℃條件下，種子第3天就開(kāi)始發(fā)芽，第5天發(fā)芽旺盛，各處理組與對(duì)照組比較結(jié)果顯示低濃度的GA3、IAA和NAA能夠通過(guò)刺激細(xì)胞形成層的分裂，增強(qiáng)種子活力，促進(jìn)萌發(fā)，當(dāng)濃度超過(guò)臨界濃度時(shí)，表現(xiàn)出抑制作用。其中GA3與IAA對(duì)于熏倒牛種子萌發(fā)的臨界濃度相同，均為180 mg·mL-1、NAA對(duì)于熏倒牛種子萌發(fā)的臨界濃度為140 mg·mL-1。同一濃度下本試驗(yàn)中3種植物激素對(duì)于熏倒牛種子萌發(fā)的影響強(qiáng)度，表現(xiàn)為GA3>IAA>NAA。統(tǒng)計(jì)不同處理?xiàng)l件下熏倒牛種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)等發(fā)現(xiàn)，采用植物激素并不能徹底打破熏倒牛種子的休眠，原因概括如下：①應(yīng)用外源萌發(fā)促進(jìn)物質(zhì)處理熏倒牛種子僅能解除部分休眠，而達(dá)不到層積處理過(guò)程中種子內(nèi)部發(fā)生的一系列反應(yīng)；②種子中存在其他抑制種子萌發(fā)的物質(zhì)，植物激素并不能消除其影響[13-14]。因此，針對(duì)熏倒牛種子休眠機(jī)制的分析和萌發(fā)特性還應(yīng)進(jìn)一步深入研究。