基于固體核磁共振方法的蛋白質組裝體三維結構解析

鄧靜 ，馬濤 ，常自偉 ，趙偉靜 ，楊俊 ,＊

1中國科學院武漢物理與數學研究所，波譜與原子分子物理國家重點實驗室，武漢磁共振中心，武漢 430071

2中國科學院大學，北京 100049

1 引言

蛋白質組裝體廣泛存在于生物體內，并行使不同的生物學功能，如有些蛋白質組裝體參與組成細菌分泌系統1、病毒衣殼2和細胞骨架細菌素細絲3等，而某些蛋白質組裝體存在于病變的生物組織或細胞內，參與某些疾病的發生或發展，如與神經退行性疾病密切相關的淀粉樣蛋白纖維PrP(Prion Protein)4、Aβ (Amyloid beta)5和α-syn (αsynuclein)6等。因此，對于這些組裝體的研究有利于理解其生物學功能及相關疾病的發生發展。目前，常用的解析蛋白質高分辨三維結構的方法包括X射線晶體衍射(X-ray)，核磁共振技術(包括液體NMR，固體NMR)，和冷凍電鏡(Cryo-EM)等。其中，固體NMR是一種強有力的分析手段，廣泛應用于物理、化學和生物等領域7。在蛋白質組裝體的結構解析中，與其它方法相比，固體NMR具有以下獨特優勢：(1)蛋白組裝體分子量大，且有些樣品如淀粉樣纖維溶解度很低，無法使用液體NMR技術進行研究。而固體NMR適用于難溶或不溶的樣品，且信號線寬不受蛋白質分子量大小影響，因此擅長于蛋白質組裝體的研究；(2)蛋白質組裝體難結晶，限制了X射線晶體方法的應用；而固體NMR不需要樣品結晶，可在更接近生理條件下探測其結構信息；(3)近年來Cryo-EM廣泛應用于蛋白質結構解析，它可快速獲得蛋白分子整體輪廓，但要得到高分辨的三維結構仍有一定難度。固體NMR可獲得原子水平的蛋白結構信息，常與Cryo-EM聯用共同完成對蛋白質組裝體的高分辨結構解析。如今固體NMR及其聯用技術應用于多種蛋白質組裝體的結構研究中，成功獲得了一些蛋白質組裝體的高分辨結構，如圖1中的生物組裝體結構和圖2中的淀粉樣纖維結構。

固體NMR可以測定蛋白質組裝體的二級，三級和四級結構信息，在測定其高分辨結構時一般遵循以下流程：(1)制備蛋白質組裝體樣品。(2)完成蛋白質氨基酸殘基的化學位移歸屬?；?3C檢測的固體NMR多維實驗(如三維NCACX，NCOCX和CONCA等)采集得到殘基內和殘基間主/側鏈相關信號，通過主鏈行走的辦法完成殘基化學位移歸屬。(3)采集結構約束信息。固體NMR中常利用重耦技術(包括13C–13C同核重偶和15N–13C異核重偶)得到空間距離接近的原子間相關信號，對這些信號進行指認，得到距離約束信息。此外，固體NMR常聯合其它實驗技術(如STEM，X-ray和Cryo-EM等)收集重要的結構輔助信息。(4)蛋白質組裝體結構計算與優化。以收集到的所有結構約束信息為依據，利用結構計算軟件如XPLORNIH11、CNS12、CYANA13等對蛋白質組裝體高分辨結構進行計算與優化。

圖1 固體NMR解析的生物組裝體的高分辨結構示意圖Fig. 1 Examples of biological assemblies that have resulted in high resolution structures by solid-state NMR data.

圖2 固體NMR解析的淀粉樣蛋白纖維高分辨結構示意圖Fig. 2 Examples of amyloid protein fibrils that have resulted in high resolution structures by solid-state NMR data.

在過去近十年中，通過固體NMR解析生物大分子結構的數量顯著增加，在這些結構中，大約30%屬于蛋白質組裝體18，表明固體NMR在蛋白質組裝體的研究中發揮著越來越重要的作用。在固體NMR對蛋白質結構的解析中，關鍵步驟是收集距離約束條件，距離約束條件的數量和質量決定了最終三維結構的質量。而良好的譜圖分辨率是獲得距離約束條件的重要因素，因此提高譜圖分辨率是解析蛋白質三維結構的重要前提。本文介紹了固體NMR中改善譜圖分辨率和收集蛋白質結構約束條件的常用方法，以及固體NMR與其它技術的聯用解析蛋白質組裝體的方法，并以Aβ淀粉樣蛋白纖維和T3SS針狀體結構解析為例介紹固體NMR在蛋白質組裝體結構解析方面的進展。

2 利用固體NMR技術獲得蛋白質結構約束信息

2.1 改善譜圖質量的方法

信噪比和分辨率是評價譜圖質量的兩大要素。高信噪比一般通過13C/15N同位素標記和提高樣品量的方法獲得。譜圖分辨率一般以信號線寬(即半高寬)作為評判標準。影響信號線寬的因素包括均勻增寬和非均勻增寬。粗略地講，均勻增寬是指每個核對線寬的貢獻都相同，非均勻增寬中每個核對線寬的貢獻不同，影響因素包括同核偶極-偶極耦合，異核偶極-偶極耦合和化學位移各向異性等。在固體NMR中蛋白樣品運動受限，不能如溶液狀態一樣通過自身快速翻轉平均偶極-偶極耦合和化學位移各向異性，故而信號線寬增寬嚴重?？焖倌Ы切D(MAS)可有效壓制偶極-偶極耦合和化學位移各向異性作用，大大提高譜圖的分辨率。為了進一步提高譜圖質量，在樣品制備和同位素標記方法上進行了不遺余力的探索，為結構距離約束的采集奠定基礎。

2.1.1 優化樣品制備方法

蛋白質構象不均一會引起譜線的非均勻增寬，在固體NMR中是影響譜圖分辨率的主要因素。在蛋白質纖維樣品的研究中發現，改變制備樣品的條件就可能得到不同構象的纖維?？赏ㄟ^優化纖維孵育時間，攪動速度，溫度，pH，蛋白濃度，緩沖液性質和其它物質(如金屬離子、磷脂膜19、螯合劑、氧化還原劑、抗菌分子等)的存在與數量等來提高樣品的構象均一性。樣品的水合程度也會影響譜圖分辨率，因此蛋白樣品裝入轉子時的狀態(水合還是凍干，以及含水量)也需要優化。

2.1.2 優化樣品同位素標記方法

同位素標記的蛋白樣品可以通過化學合成或生物表達的方式獲得，而對于一般蛋白樣品，通過基因重組表達(大腸桿菌，酵母或其它真核細胞)是獲得15N/13C標記蛋白樣品的有效方法。標記方法包括均勻全標記(uniform labeling)，稀疏標記(sparse labeling)和選擇性標記(selective labeling)等。均勻全標記樣品譜峰重疊嚴重，且存在很強的偶極截短效應20。偶極截短效應是指當周圍標記的原子數目多時，鄰近的原子的偶極耦合占主導作用，信號不能實現較遠距離傳遞，不利于長程距離約束的獲得。稀疏標記方法利用特殊13C源選擇性的標記某些原子，如1-13C葡萄糖碳源表達的蛋白質傾向標記絲氨酸和丙氨酸Cβ，而2-13C葡萄糖碳源傾向標記絲氨酸和丙氨酸Cα。這種方法有效的降低了偶極截短效應，同時與均勻標記相比，信號線寬明顯下降，因此可以大大提高譜圖分辨率。此外選擇性標記可特異性的標記某類氨基酸，甚至是某個原子，實現特定位點的信息采集。

2.1.3 其它方法

通過改善實驗條件和實驗方法也可以提高譜圖的質量，如采用更高磁場的譜儀(高達1 GHz)，不斷優化的極化轉移技術21，采用超快速MAS探頭22以及高轉速下的1H檢測實驗方法23對信號的靈敏度和譜圖分辨率都有很大改善。我們課題組提出了新的脈沖序列，可增強脂肪族13C/13C同核間24和13C/15N異核間25極化轉移效率，提高信號強度，節省固體NMR多維實驗的時間。

2.2 提取結構約束的方法

蛋白質結構的質量依賴于結構約束的數目和質量。結構約束條件主要包括角度約束和距離約束，距離約束又分為單體內(或分子內)和單體間(或分子間)的距離約束。這些結構約束可確定蛋白質單體折疊方式以及單體堆疊的界面信息。本節主要介紹固體NMR獲取結構約束條件的常用方法和一些新的技術手段。

2.2.1 角度約束

蛋白質的主鏈扭轉角信息(如φ/Ψ二面角)作為結構計算中重要的角度約束，可通過TALOS+26利用氨基酸的13Cα，13Cβ，13C’和15N的化學位移預測得到。此外根據相關公式27計算其二級化學位移可推斷殘基片段的二級結構類型(如α-螺旋，β-折疊或無規結構)。

2.2.2 距離約束

距離約束對蛋白質結構解析至關重要，尤其是長程距離約束，涉及的實驗方法有13C-13C相關的PDSD28、DARR29、PAR30等，13C-15N相關的REDOR，TEDOR31等，以及1H-1H相關的NHHC，CHHC實驗32，可采集到空間距離鄰近的13C/13C原子間或13C/15N間的相關信號，即為距離約束。改變混合時間可以控制信號傳遞的距離范圍，在不考慮弛豫時，混合時間越長，信號傳遞的越遠，越有利于建立長程耦合。但是，CHHC/NHHC、PAR/TEDOR和PDSD/DARR的混合時間通常分別小于1.0、20和500 ms。這是因為過長的混合時間既使信號因弛豫而衰減，也使信號因傳至更多自旋而分散，反而不利于獲取長程相關信息。相關信號一般分為四類：(1)殘基內13C-13C的相關，即所有相關信號來自同一個殘基；(2)短程相關，來自殘基i與(i ± 1) –(i ± 2)的相關；(3)中程相關，包括從殘基i與(i ± 2)–(i ± 4)的相關性。(4)長程相關/遠程相關，包含殘基i與> (i + 4)的相關，較多出現在長混合時間譜中(如600M譜儀中混合時間300–500 ms等)。長程相關的殘基在一級序列中距離較遠，但空間距離較近(約1–9 ?)，這對于蛋白折疊方式的確認十分重要。

在實際譜圖分析中，很多信號歸屬不明確，即模糊約束(ambiguous restraints)，歸屬的不確定性主要源于兩方面：譜圖分辨率很差，信號重疊無法區分；單體內殘基與單體間殘基相關信號同時出現，難以區分。譜圖的分辨率和信號重疊可以通過優化樣品制備或標記方法進行改善，而對于單體內與單體間殘基信號的區分，則通過設計同位素的標記方式進行區分，詳細內容見章節4.1，圖3b。

2.2.3 其它獲得距離約束的方法

氫檢測技術近年來得到快速發展，在固體NMR中的應用逐漸成熟。由于1H比13C原子具有更高的旋磁比(約是13C原子的4倍)，同時1H具有幾乎100%的天然豐度，且在蛋白質中含量高分布廣，因此1H非常適用于蛋白長程距離約束測定。目前，高磁場核磁譜儀的應用，快速MAS技術的發展和樣品氘代方法的設計都極大促進了氫檢測技術在固體NMR中的發展33。氫檢測技術提高了譜圖分辨率和靈敏度，減少了蛋白質樣品用量和實驗時間，得到豐富的結構約束條件，在生物大分子的結構解析中具有強大潛力。

順磁標記技術是基于未成對電子與自旋核之間的偶極–偶極相互作用而建立起來的技術。未成對電子自旋可以產生磁場，且電子的旋磁比高于自旋核～2–3個數量級，因此自由電子對與自旋核間具有很強的偶極-偶極耦合作用。這種相互作用的輻射范圍最遠可達20–24 ?，遠大于傳統的自旋核間相互作用的距離上限(約為9 ?)。在固體NMR中引入順磁標記技術可獲得更為豐富的距離約束條件。Sengupta等34利用順磁馳豫增強(PRE，Paramagnetic relaxation enhancement)技術，引入Cu2+順磁探針在固體NMR中得到豐富的距離約束信息。此外我們課題組35結合贗接觸位移技術(PCS，Pseudocontact shift)和Rosetta方法，通過引入的磁各向異性順磁金屬離子獲得了固體NMR的PCS數據，并計算得到GB1蛋白的高分辨三維結構。因此，利用順磁標記技術可以為固體NMR解析蛋白結構提供新思路。

圖3 Aβ42纖維結構解析相關的距離約束Fig. 3 The structure restraints determining the Aβ42 fibril structure.

3 固體NMR聯合其它技術解析蛋白質結構

近年來，固體NMR與其它研究手段的聯用得到快速發展。這些研究手段包括X-ray晶體衍射，STEM，Cryo-EM等實驗技術以及CS-Rosetta和分子動力學(MD，molecular dynamics)模擬等結構預測和模擬手段。X-ray晶體衍射常見于晶體樣品的結構解析，也應用于一些結晶淀粉樣蛋白中，揭示了其交叉β折疊的結構特性，且發現其β片層間的距離約為4.7 ?，后證明該特性廣泛存在于淀粉樣纖維中36。故在淀粉樣蛋白中，固體NMR常結合X-ray晶體衍射的結論共同描述其三維結構37。STEM可提供蛋白質組裝體的MPL數據，有助于確認單體堆積方式38，詳細過程見章節4.1。MD利用分子的力場約束和能量約束來演示分子運動，尤其在描述瞬態結構或結構中間態發揮著重要作用，常與固體NMR技術聯用確認蛋白的結構模型以及其動力學信息39。

氨基酸的化學位移中包含了豐富的蛋白質構象信息。Rosetta等40是一種結合化學位移數據進行蛋白質結構預測的軟件。Rosetta把目標蛋白質序列分為若干個片段，從蛋白質數據庫(PDB)中搜索序列相似的結構，并加入實驗所得的化學位移數據對所選結構進行篩選，提高所選結構的可信度。Rosetta結合PDB中的結構信息與實驗數據對目標蛋白進行模擬，可快速獲得與實驗條件更為接近的結構模型或高分辨結構。如在細菌衣殼蛋白M138的結構確認中，基于明確的固體NMR距離約束利用Rosetta得到一個結構模型，在該結構模型基礎上對模糊的距離約束進行歸屬，最后得到高分辨結構(RMSD為0.47 ?)。

Cryo-EM是近年來熱門的蛋白結構解析手段，固體NMR與Cryo-EM聯用技術逐漸廣泛地應用于多種蛋白質組裝體的結構解析。最具有代表性的是T3SS針狀體的高分辨結構41的確認，結合Cryo-EM得到的7.7 ?的密度圖和固體NMR的二面角約束和大量距離約束條件，利用Rosetta將兩套數據整合得到了分辨率為0.4 ?的高分辨結構，詳細過程見章節4.2。這種固體NMR-Cryo-EM的聯用技術也被應用到淀粉樣纖維的結構解析，如運甲狀腺素蛋白的交聯淀粉樣蛋白原纖維中，將固體NMR測量的分子內距離約束和扭轉角約束與Cryo-EM的電子密度圖結合，解析得到了運甲狀腺素蛋白原纖維的二級，三級和四級結構。這些結構提供了分子堆疊的相互作用信息，有助于了解運甲狀腺素蛋白從單體組裝成原絲，再到成熟原纖維的過程42。此外，Jeon等2在對RSV CA的結構研究中，僅利用固體NMR所得的原子位點的扭轉角信息與Cryo-EM所得結構結合，將分辨率從Cryo-EM的24 ?提高到1.5 ?。Cryo-EM擅長表征蛋白質的剛性結構域的特性，而固體NMR可同時描述剛性和柔性的結構信息。Sborgi等43在ASC炎性體結構的研究中，結合Cryo-EM的結構信息和固體NMR的扭轉角信息以及柔性區域的結構信息，得到了更高分辨率的結構模型。

4 固體NMR在蛋白質組裝體結構解析中的應用

4.1 Aβ淀粉樣蛋白纖維結構解析

淀粉樣蛋白纖維一般由正常的蛋白質異常累積形成，常伴隨著蛋白質構象錯誤折疊。Aβ淀粉樣蛋白具有神經毒性，與阿爾茲海默癥(AD，又名老年癡呆癥)密切相關。Aβ由淀粉樣前體蛋白(APP)經過β-分泌酶和γ-分泌酶兩步切割形成，常見類型有Aβ40和Aβ42。Aβ淀粉樣纖維結構的解析有助于理解其聚集機制和致病機理。

運用固體NMR方法，Walti等5和Colvin等16先后發表了Aβ42的高分辨纖維結構，兩個結構顯示出相同的“S”型單體結構特征(如圖2c)，并且單體間的堆疊方式(包括垂直于纖維軸的側向堆基和平行于纖維軸的軸向排列)也十分類似。通過STEM的暗場圖像分析Aβ42纖維的MPL值，可確認單體側向堆積數目。MPL定義為每0.47 nm長度的纖維單絲的相對分子質量：公式為MPL = M × n ÷0.47，其中M表示蛋白單體相對分子質量，n為每個β層的單體數目，相鄰的β片層間距約為0.47 nm (淀粉樣蛋白纖維的X-ray衍射圖案表明其β層間主鏈間距約為0.47 nm)。其中煙草花葉病毒(TMV)有固定MPL值(131 kDa·nm?1)，常作為內標用于質量校準。Colvin等16分析表明Aβ42纖維側向堆積為二聚體形式，如圖3a。

不同標記方式可幫助區分單體內/單體間距離約束條件，如圖3b。對于13C/15N均勻(homogeneous)記樣品，同時出現單體內和單體間相關信號，天然豐度稀釋(diluted)樣品(天然豐度：13C/15N標記 =3 : 1)中主要出現單體內相關信號，13C :15N = 1 : 1混合(mixed)標記樣品其13C-15N相關信號主要來源分子間相關。此外Loquet等44利用1-13C葡萄糖和2-13C葡萄糖標記的互補性區分單體內/單體間信號。單體內距離約束確定Aβ42單體的“S”型結構特征；分子間距離約束如L17Cγ–M35Cβ，Q15Cγ–M35Cβ等則反應出側向排列分子間的界面信息，如圖3c；分子間距離約束如S8Cα–S8Cα，L17Cδ1–L17Cγ，S26Cα–S26Cβ，V40Cγ2–V40Cβ等說明其軸向排列方式為平行對準方式。

結合STEM所得的二聚體結構信息和固體NMR所收集的497個距離約束，利用CYANA最終確定Aβ42纖維高分辨結構，主鏈原子的RMSD(Root-mean-square Deviation)為(0.71 ± 0.12) ?，如圖2c所示。

圖4 多種Aβ40纖維結構示意圖Fig. 4 The various structure models of Aβ40 fibrils.

隨著Aβ42和Aβ40結構研究的報道日益增多，Aβ纖維結構展現出多態性。Aβ42的結構中Colvin等16，W?lti等5和Xiao等45都發現單體內K28與C端殘基存在鹽橋，這對結構有重要的穩定作用；單體沿纖維軸平行對準排列，如圖2c。此外Luhrs等15在2005年發表的Aβ42結構中發現不同單體的β片層交錯排列，即單體n的β1和單體n?1的β2排列，形成獨特的結構形態，如圖2b。Aβ40的結構同樣存在多態性。Petkova等46在2002年發表的結構中，Aβ40以二聚形式存在，兩單體C端平行排列，如圖4a。Petkova等47在2006年和Bertini等48在2011提出結構中，單體的C端反平行排列，如圖4b。已報道的Osaka突變體(E22Δ)17顯示出獨特的結構特點，如圖2d。Paravastu等49在2008年提出的結構中，Aβ40以三聚體形式存在，如圖4c。此外我們課題組19在2014年提出了Aβ40在磷脂囊泡環境中形成的纖維結構，與溶液環境中形成的Aβ40纖維對比，前者纖維疏水內核更短，且三維結構也有明顯不同。這些結構差異表明了磷脂膜對Aβ纖維結構的影響，對探索細胞膜環境中的Aβ淀粉樣蛋白結構具有重要意義。Aβ40結構多態性是Aβ淀粉樣纖維的內在屬性，這些豐富的蛋白結構可幫助我們了解在生理條件下Aβ的蛋白錯誤折疊機理，對理解其在AD疾病中的致病機理具有重要意義。

4.2 T3SS針狀組裝體結構解析

細菌III型分泌系統(T3SS)存在于多種細菌中，其用于將細菌效應蛋白從細菌傳送到宿主細胞中。完整的T3SS包括膜嵌入機體(即針狀體)和宿主膜中的易位孔。T3SS針狀體起著細菌與細胞的通道連接作用，使細菌效應蛋白通過該通道注入宿主細胞。T3SS針狀體主要由MxiH蛋白自組裝形成長約100 nm，寬約8 nm的針狀中空絲，單體間排列方式如圖5a，b。了解針狀體的結構與功能幫助我們解決細菌感染，噬菌體入侵等問題。

T3SS針狀體的結構解析采用了13C的稀疏標記方法，大大提高了譜圖分辨率，得到了完整的化學位移歸屬50；并根據二級結構特點確立了MxiH單體的螺旋發夾式折疊特征，如圖5c。與Aβ42纖維類似，T3SS針狀體的組裝方式包括側向堆積和軸向排列，如圖5a。分別利用[1-13C]葡萄糖碳源標記，[2-13C]葡萄糖碳源標記，以及[1-13C]葡萄糖 :[2-13C]葡萄糖 = 1 : 1的混合標記樣品收集結構約束條件，從中提取出明確的單體內/單體間結構約束信息，構建單體排列的結構模型，如圖5c。由于單體i同時與6個其它單體接觸(i ± 5、i ± 6和i ± 11，如圖5a，d)，界面信息復雜，存在多種約束可能性，故而結合圖5c中的結構模型和固體NMR信號的距離上限(～9 ?)進行排除，如圖5d。對于無法手動排除的模糊約束，在結構計算中采用迭代的算法進行自動歸屬。最終，從固體NMR譜中共獲得996個確定的長程約束。

圖5 T3SS針狀體單體界面示意圖Fig. 5 Intermolecular interfaces of the TSSS needle.

利用cryo-EM技術對T3SS組裝體進行分析，得到分辨率為7.7 ?的結構低溫密度圖。為了提高T3SS針狀體結構的分辨率，提出了固體NMRCryo-EM-Rosetta聯用技術。固體NMR和Cryo-EM兩種技術手段所得的結構信息在分辨率水平上存在差異，整合這兩套數據成為實現技術聯用的關鍵。這里利用Rosetta設計出一種迭代方案來整合這兩套數據，該方案可以調整每種數據的權重大小以滿足數據間的自洽性，使得兩種技術手段的結構信息可以同時應用于結構計算，大大提高結構的分辨率。最后計算得到精確度高達0.4 ?的高分辨結構。固體NMR-cryo-EM-Rosetta聯用方法獲得了分辨率高于任何單一手段的T3SS針狀結構，充分證明的技術聯用的優勢和可行性，可推廣到其它超分子蛋白組裝體的結構解析中。

6 總結與展望

在過去的20年中，固體NMR技術已被證實在蛋白質組裝體結構解析中具有很大潛力。常見的蛋白質組裝體如蛋白質細絲、原纖維或病毒衣殼等，它們通常不易結晶且難溶解，傳統的結構解析方法如液體NMR，X射線晶體學方法等很難得到高分辨結構，而固體NMR可在原子水平對這些生物體系進行高分辨結構研究。固體NMR實驗技術的提升和樣品制備方法的改進都大大促進了固體NMR在蛋白質組裝體研究領域的發展。采用多種13C稀疏標記和選擇性標記方法有助于提高譜圖分辨率，混合標記方法可區分單體內/單體間距離約束條件；多種實驗方法如DARR、PDSD、PAR和TEDOR等可以有效地獲得距離約束，為高分辨結構解析提供條件。氫檢測方法和順磁標記技術的發展為固體NMR獲取蛋白質結構信息提供了新思路，在蛋白組裝體結構的研究中具有很大潛力。固體NMR與多種研究手段(如STEM、X-ray、Cryo-EM、MD、Rosetta等)的強強聯合，在解析復雜蛋白質體系結構方面展現出顯著優勢。隨著固體NMR技術以及相關實驗技術的進一步發展，固體NMR在蛋白質組裝體結構解析領域發揮著越來越重要的作用，為相關生物分子的功能和致病機理提供重要的結構信息。