牛至精油對腐生葡萄球菌抑制作用機制

陳夢玲，藍蔚青*，李函笑，任智楚，蘆子萱，謝 晶*

（上海海洋大學食品學院，上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，食品科學與工程國家級實驗教學示范中心（上海海洋大學），上海 201306）

牛至（Origanum vulgare）為唇形科多年生草本植物，其在地中海地區、北非、北美與亞洲均有分布，全草可提精油[1]。牛至精油為一種淡黃色透明液體，其含有30多種化合物，主要活性成分為酚類物質與萜烯類物質[2]。這些活性成分的表面活性與脂溶性較強，使其易透過細胞膜對菌體造成損傷，從而抑制菌體生長或將其殺死[3]。近年來，關于牛至精油在水產品保鮮中的應用研究也逐見報道。如杜云飛等[3]將牛至精油作為抗菌劑，分別加入至乙烯-乙烯醇共聚物和聚乙烯，通過擠出流延制備成2 種食品保鮮膜，發現使用添加過牛至精油的保鮮膜包裝黑魚片，其脂質氧化速率降低，微生物生長受抑制。鄭宗林等[4]將牛至精油添加至紅羅非魚飼料中，經過20 周的養殖發現，添加牛至精油飼料能使冷藏魚片中腸桿菌和大腸菌群數顯著降低，且貨架期較對照組延長2 d；van Haute等[5]也報道牛至精油處理可使三文魚的冷藏貨架期顯著延長，且能明顯抑制大腸桿菌與乳酸菌生長。

水產品在流通期間，其鮮度與品質極易下降，微生物是導致其腐敗變質的主因?，F有研究發現，在腐敗過程中，只有極少種類的特定腐敗菌參與這一過程并產生不可接受異味[6]。這些適合生存、繁殖并產生腐敗臭味代謝產物的菌群則為該產品的特定腐敗菌[7]。因此，如何延緩水產品品質劣變、延長其貯藏貨架期、抑制由于微生物繁殖而引起的腐敗變質，現已成為科研工作者普遍關注的熱點。腐生葡萄球菌（Saprophytic staphylococcus）作為水產品的特定腐敗菌，為葡萄球菌屬非致病性革蘭氏陽性菌。本課題組前期通過生理生化鑒定腐敗鯧魚中的優勢腐敗菌為腐生葡萄球菌[8]，其在肉制品貯藏過程中會分泌蛋白酶和脂酶，使脂肪分解、蛋白質水解，產生腐敗代謝產物，影響產品品質[9]。傳統化學防腐劑在使用過程中會產生一定副作用，甚至癌變，對人體造成不可逆損害，這也促使安全可靠的天然生物防腐劑得到更大程度利用[10]。牛至精油的廣譜抑菌性與不易產生耐藥性的特點，使其在食品工業領域具有很好的開發利用前景，而其對菌體作用機制的研究更會為牛至精油的后期應用提供依據[11-12]。其中，王倩等[13]研究了銀杏葉提取液對腐生葡萄球菌的作用機制，結果表明腐生葡萄球菌經銀杏葉提取液處理6 h后，菌體變形且胞間黏結，其主要通過對菌體細胞膜和細胞壁的破壞實現其抑菌效果。本實驗采用瓊脂平板打孔法通過抑菌圈直徑確定牛至精油對腐生葡萄球菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），由微生物生長曲線、電導率、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性、紫外物質吸收與掃描電子顯微鏡觀察來綜合評價牛至精油對腐生葡萄球菌的抑制作用機制，以期為牛至精油作為生物保鮮劑應用于水產品保鮮領域提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

腐生葡萄球菌（Saprophytic staphylococcus）為課題組前期從腐敗鯧魚中分離、篩選并鑒定后保存的菌株。

牛至精油（產地：摩洛哥；提取部位：植株；生產工藝：蒸餾法；主要成分為香芹酚（39.45%）、對傘花烴（21.05%）、百里香酚（14.55%））購于上海雅琪實業有限公司，使用前置于陰涼干燥處存放。

AKP測試盒、LDH測試盒 南京建成生物工程研究所；胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）培養基、胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptic soy agar，TSA）培養基、氯化鈉、無水乙醇、戊二醛（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Centrifuge 5810R型冷凍離心機 德國Eppendorf公司；BCD-256KF型冰箱 青島海爾股份有限公司；ZQZY-70B型振蕩培養箱 上海知楚儀器有限公司；LS-3750型滅菌鍋 日本SANYO公司；Synergy2型自動酶標儀 美國BioTek公司；DDB-11A型電導率儀杭州齊威儀器有限公司； Mira 3型掃描電子顯微鏡捷克Tescan公司；M334712型全自動微生長曲線分析儀芬蘭Bioscreen公司；UV-2450型紫外-可見分光光度計日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將牛至精油以體積分數25%乙醇溶液為溶劑混合配制成不同體積分數備用。腐生葡萄球菌菌種在TSB液體培養基中活化2～3 代后，吸取100 μL菌液涂布在TSA固體培養基中，37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，重復平板劃線。挑取活化后的腐生葡萄球菌單菌落在TSB培養基中37 ℃培養8 h，用滅菌生理鹽水將其配制成含菌數106～107CFU/mL菌懸液備用。

1.3.2 MIC的測定

MIC的測定參考Dutra等[14]的方法，并稍作修改。采用打孔法測定抑菌圈直徑，從而得到牛至精油對腐生葡萄球菌的MIC。吸取100 μL對數期菌懸液均勻的涂布于TSA固體培養基表面，并在平板中央進行打孔，采用二倍稀釋法分別吸取8%（體積分數，下同）、4%、2%、1%、0.5%、0.25%牛至精油100 μL加入孔內；用不添加牛至精油菌液作為空白組，以25%乙醇溶液為對照組。將各組置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h后用游標卡尺測量抑菌圈直徑。每個實驗做3 個平行，按抑菌直徑大小劃分相對敏感度[15]。參考蘇萌萌等[16]的方法測定牛至精油對腐生葡萄球菌的MIC（其中MIC值為明顯抑制腐生葡萄球菌生長的最低體積分數）。

1.3.3 微生物生長曲線的測定

采用Diao Mingming等[17]的方法，并稍作修改。取對數期菌液，按1%接種量分別加入MIC與2 MIC牛至精油至無菌TSB培養基中，置于37 ℃、150 r/min搖床培養24 h，由全自動微生物生長曲線分析儀每隔1 h自動取樣測定OD600nm值，以不添加牛至精油的菌液作為空白組，以添加25%乙醇溶液的培養液為對照；以培養時間為橫坐標，OD600nm為縱坐標，繪制腐生葡萄球菌在不同條件下的微生物生長曲線。

1.3.4 電導率的測定

參考Yan Feilong等[18]的方法，并稍作修改，分別將MIC與2 MIC的牛至精油添加至1%接種量的TSB實驗菌液中，置于搖床37 ℃、150 r/min培養。分別于0、2、4、6、8、10、12 h取培養液測定其電導率，以此來確定菌體金屬離子的泄漏情況。以不添加精油的培養液作為空白組，以添加25%乙醇溶液作為對照組。每組樣品設3 個平行。

1.3.5 AKP活力的測定

腐生葡萄球菌按1%接種量在含有MIC與2 MIC牛至精油的TSB培養液中接種，置于搖床37 ℃、150 r/min培養12 h，分別于0、2、4、6、8、10、12 h取樣2 mL，置于離心機中4 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液，按AKP測試盒說明書的方法測定胞外AKP活力。以不添加精油組作為空白，添加25%乙醇溶液作為對照組，每組實驗設3 個平行。

1.3.6 牛至精油對腐生葡萄球菌細胞膜通透性的影響

1.3.6.1 紫外吸收物質的泄漏情況測定

參考Chen等[19]的方法測定牛至精油對腐生葡萄球菌紫外吸收物質的影響。將牛至精油分別加入待測菌株培養液中，使其終濃度為MIC與2 MIC，再將其置于37 ℃、150 r/min搖床中振蕩培養，分別于0、2、4、6、8、10 h取樣，再4 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液通過紫外分光光度計測定菌體上清液在260 nm波長處的吸光度，每組實驗設3 個平行。

1.3.6.2 LDH活力的測定

LDH在細胞質中存在并參與細胞的糖酵解途徑，在細胞膜受損時會泄漏至胞外[20]。將牛至精油分別加入待測菌株培養液中，使其終濃度為MIC與2 MIC。置于搖床37 ℃、150 r/min振蕩培養，分別于0、6 h取樣，4 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液并按照LDH測試盒的方法進行測定。以未經精油處理的菌株培養液為空白，25%乙醇溶液替代等體積的精油作為對照組，每組實驗設3 個平行。

1.3.7 菌體微觀結構的測定

參考Xu Jianguo等[21]的方法測定牛至精油處理后菌體的微觀結構。取對數期菌種按1%接種量接種于含MIC、2 MIC牛至精油TSB溶液中培養，以不添加牛至精油的TSB培養液作為空白組，于搖床37 ℃、150 r/min培養6 h后，取一定量的菌液于4 000 r/min、4 ℃離心10 min，棄去上清液，菌體用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液洗滌3 次，并用體積分數2.5%戊二醛溶液于4 ℃冰箱中固定4 h，將樣品分別用不同體積分數（30%、50%、70%、90%、100%）乙醇梯度脫水后，置于－80 ℃冰箱冷凍保存4～8 h，冷凍干燥機干燥24 h后涂至金屬箔片并固定噴金，置于掃描電子顯微鏡下觀察菌體形態結構。

1.4 數據處理與分析

由SPSS 13.0軟件進行平均值與方差分析，實驗數據均采用平均值±標準差表示，用Origin 8.5軟件繪制曲線。

2 結果與分析

2.1 牛至精油對腐生葡萄球菌的MIC

表1 牛至精油對腐生葡萄球菌的抑菌效果Table 1 Inhibitory effect of OEO on Saprophytic staphylococcus

由表1可知，隨著牛至精油體積分數的增加，其對腐生葡萄球菌作用效果也愈明顯。當牛至精油的體積分數為8%時，表現為極敏感；牛至精油的體積分數為0.25%時，表現為低敏感；而25%乙醇溶液對腐生葡萄球菌無抑制作用，表明25%乙醇溶液對牛至精油的抑菌效果不產生影響。低敏感時牛至精油的最小體積分數為0.25%，因此，牛至精油對腐生葡萄球菌的MIC為0.25%。

2.2 牛至精油對腐生葡萄球菌生長的影響

圖1 牛至精油處理對腐生葡萄球菌生長曲線的影響Fig. 1 Effect of OEO on the growth curve of Staphylococcus saprophyticus

由圖1可以看出，空白組與對照組菌株保持S型曲線正常生長，培養2 h后進入對數期，在10 h后進入穩定期，可見25%乙醇溶液對腐生葡萄球菌的生長無抑制作用。而經MIC牛至精油處理后，腐生葡萄球菌進入對數期生長時間延至4 h；2 MIC牛至精油處理后，菌體進入對數期延至10 h，說明牛至精油處理可延緩腐生葡萄球菌進入對數期，達到其抑菌目的。Park等[22]研究發現，月桂酸處理能抑制金黃色葡萄球菌進入對數期；藍蔚青等[23]在研究復合保鮮劑對金黃色葡萄球菌的抑菌效果時也得到類似結論。

2.3 牛至精油對腐生葡萄球菌培養液電導率的影響

圖2 牛至精油處理對腐生葡萄球菌電導率的影響Fig. 2 Effect of OEO on electric conductivity of Staphylococcus saprophyticus

細胞膜對菌體的正常生長具有保護作用，當菌體在受到抑菌物質的傷害或在不良環境下生長時，細胞膜滲透性會有所改變，且電解質會滲漏到細胞外，導致細菌培養液電導率增加[24]。由圖2可知，經過牛至精油處理的菌液的電導率顯著高于空白和對照組，且牛至精油的體積分數與電導率呈正相關。由此可知，牛至精油對腐生葡萄球菌的作用呈劑量依賴性，這與生長曲線的結果一致，可能由于菌體經牛至精油處理后，其細胞膜的通透性有所增加，使菌體內電解質如K+、Ca2+泄漏至胞外，這與李婷等[25]的研究結果相似。

2.4 牛至精油處理對腐生葡萄球菌胞外AKP活力的影響

細胞壁可有效防止外來物質如抗生素、抑菌劑等進入細胞內，AKP存在于細胞膜與細胞壁間，對生物體內物質代謝起著重要作用，因此其活力是反映細胞壁完整度的重要指標之一。當菌體正常生長時，AKP活力無法在胞外檢出，反之亦然。因此，可通過檢測細胞外AKP的活力來判斷菌體細胞壁的完整性與通透性[26]。

如圖3所示，牛至精油處理后腐生葡萄球菌胞外的AKP活力明顯上升，且在2 h后對照組的AKP活力穩定，而處理組樣品的AKP活力顯著高于對照組。在經牛至精油處理4 h后，MIC與2 MIC牛至精油處理組的AKP活力分別為0.85 U/L與1.09 U/L，這同電導率、生長曲線的測定結果相一致，進一步反映牛至精油可使菌體的細胞壁完整性遭到破壞。Hu Wei等[27]研究發現山蒼子精油對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的細胞壁也起到破壞作用，可使菌液AKP活力顯著提升。

2.5 牛至精油對腐生葡萄球菌細胞膜通透性的影響

2.5.1 紫外吸收物質的泄漏情況

細菌細胞膜的功能包括滲透屏障、物質轉運、能量代謝，其正常的結構與功能是細菌正常生長的基本前提[28]。菌體內的核酸與蛋白質類物質在260 nm波長處有強吸收峰，通過培養液中此類物質在260 nm波長處吸收峰的強弱可判定菌體細胞膜的通透性[29]。

圖4 牛至精油處理對腐生葡萄球菌膜通透性的影響Fig. 4 Effect of OEO on the membrance permeability of Staphylococcus saprophyticus

從圖4可看出，隨著處理時間的延長，處理組培養液在260 nm波長處的吸光度逐漸上升，且2 MIC牛至精油處理組的吸光度顯著高于MIC處理組，表明牛至精油體積分數越高，其對細胞膜的破壞越嚴重；而未經牛至精油處理的空白組與25%乙醇溶液處理組的吸光度無明顯變化?？赡苡捎诟咸亚蚓浘吞幚砗?，其菌體的細胞膜完整性被破壞，核酸、蛋白質等大分子由于菌體細胞膜通透性的增加而滲透到胞外。張赟彬等[30]研究肉桂精油對大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的作用機制時也發現，隨著精油濃度的升高，菌體內核酸與蛋白質類物質的泄漏增加；Wang Yue等[31]研究肉桂皮精油對牙齦卟啉單胞菌的抑菌效果時也得到相似結論。

2.5.2 胞外LDH活力

圖5 牛至精油處理對腐生葡萄球菌胞外LDH活力影響Fig. 5 Effect of OEO on extracellular LDH activity of Staphylococcus saprophyticus

LDH參與細胞的糖酵解途徑，其存在于細胞質中，當細胞膜受到損傷時會泄漏至胞外[32]。從圖5可以看出，當腐生葡萄球菌經過精油處理6 h后，MIC、2 MIC處理組培養液中的LDH活力分別從0 h的2.91、3.67 U/g升至6 h的17.59、18.67 U/g。而空白和對照組明顯低于牛至精油處理組，反映出牛至精油對菌體細胞膜的損傷作用，其能使菌體內核酸等生物大分子外泄，營養物質喪失，從而達到抑菌與殺菌的目的，本結果與紫外吸收結果一致。

2.6 微觀結構觀察結果

圖6 腐生葡萄球菌經牛至精油處理6 h后掃描電子顯微鏡圖Fig. 6 SEM graphs of Staphylococcus saprophyticus after treatment with OEO for 6 h

由圖6可知，空白組的腐生葡萄球菌外觀光滑、平整飽滿。而經牛至精油處理后，菌體外觀形態變粗糙，有凹痕存在，尤其在菌體兩端較為明顯；經過MIC牛至精油處理后，菌體出現胞膜破裂、凹陷現象，部分菌體畸形，細胞壁膜褶皺，有裂紋，甚至剝落；而經2 MIC牛至精油處理后，菌體大量胞膜剝落，且破裂畸形，細胞受損嚴重。說明牛至精油對菌體結構的破壞程度與其體積分數呈正相關，可能由于牛至精油是一類脂溶性物質，其通過結合細胞膜在膜內形成孔道進入細胞內，同時與胞內活性物質相互作用，而對菌體細胞結構造成破壞，導致其死亡。Silva等[33]發現茶樹精油對單增李斯特菌的細胞形態也產生類似損害；Dutra等[34]得出牛至精油能對脂環酸芽孢桿菌造成破壞而達到抑菌目的；Bhargava等[35]發現牛至精油能對大腸桿菌與鼠傷寒桿菌的細胞結構造成破壞，使其細胞膜破裂而達到抑菌目的。

3 結 論

綠色、健康、純天然的食品添加劑已成為當今時代的主流，而牛至精油作為一種植物天然提取物，因其良好的抗氧化性、獨特風味與較強抑菌性逐漸成為新型食品防腐劑的首選對象。本研究得出牛至精油對腐生葡萄球菌的MIC為0.25%，且經牛至精油處理后的菌體細胞內容物大量外泄至胞外，說明牛至精油會使菌體細胞壁、細胞膜的通透性與完整性遭到破壞，由于牛至精油的脂溶性特點，也使其更好地與菌體細胞膜表面結合，能在胞膜內形成孔道，使其中的疏水性活性物質與菌體內的活性物質相互結合，影響細胞的正常代謝，從而抑制其生長；牛至精油對菌體結構的破壞程度與其體積分數呈正相關。牛至精油對菌體遺傳物質影響與菌體蛋白質組學表達仍需深入研究。本研究為牛至精油作為食品工業新型抑菌劑提供了理論參考。