表面糊化處理確定乙酰化羥丙基小麥淀粉中取代基團分布

趙 凱，劉 寧，李 君，雷 鳴，陳 威，楊春華，陳鳳蓮

（哈爾濱商業大學 省高校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076）

小麥是我國主要的糧食作物，廣泛種植于華北及東北地區。淀粉是小麥中含量最高的組分，占70%以上，對小麥粉的加工及貯藏品質具有重要影響。為了改善小麥淀粉的加工品質，拓展其應用范圍，經常采用酯化及醚化進行改性處理，制備乙酰化（醋酸酯）小麥淀粉、羥丙基化小麥淀粉[1-3]。這些接入的具有空間位阻作用的基團能提高淀粉親水特性，降低淀粉的糊化溫度，改善淀粉的凍融穩定性及淀粉糊的透明度[4]。目前，業內一般采用取代度來評價酯化及醚化淀粉的改性程度[5]，但是取代度僅能從量上反映取代程度，具體取代基團在淀粉顆粒內如何分布，是從淀粉表面到顆粒內部均勻分布還是集中在某一區域，通過取代度還無法做出判斷。如果想了解取代基團在顆粒內的分布情況，可采用表面糊化技術從淀粉表面到內部逐層糊化淀粉顆粒，一般選用高濃度的氯化鈣或氯化鋰，通過化學糊化的方法對淀粉顆粒實現逐層剝離、控制糊化程度，進而分析表面糊化的淀粉和剩余淀粉顆粒內取代基團的含量，來確定反應發生在表面還是顆粒內部[6-7]。Jane等采用表面糊化技術分析直鏈淀粉在馬鈴薯淀粉顆粒內的分布，結果表明，直鏈淀粉主要分布在淀粉顆粒的表面，尤其是短直鏈淀粉，而鏈長較長的直鏈淀粉則伸展到顆粒內部[8]。Kuakpetoon等采用表面糊化技術研究了玉米淀粉顆粒內部結構，結果表明直鏈淀粉-脂質復合物主要集中在顆粒表層[9-10]。Huang Junrong等研究了乙酰基在乙酰化（醋酸酯）淀粉顆粒內取代基的分布[11]。Li Lingjin等研究了酸水解羥丙基復合改性馬鈴薯淀粉顆粒結構及流變學特性的影響，揭示出淀粉經酸水解處理后可提高羥丙基淀粉取代度[12]。而對于乙酰化羥丙基復合改性處理過程中取代基團在淀粉顆粒內的分布及表面糊化處理后淀粉分子質量分布的變化，則國內外研究較少。

本實驗采用表面糊化法研究單一及復合改性條件下取代基團在淀粉顆粒內的分布，進而研究表面糊化處理后淀粉的顆粒特性、分子質量的變化以及直鏈淀粉的含量與分布，以期為改性淀粉在食品工業中的進一步應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥淀粉 青島百樂麥食品有限公司；小麥總淀粉、小麥A淀粉、小麥B淀粉、羥丙基淀粉、乙酰化（醋酸酯）淀粉、乙酰化羥丙基淀粉由哈爾濱商業大學省高校食品科學與工程重點實驗室自制；瓊脂糖凝膠CL-2B瑞典Pharmacia LKB公司；濃硫酸、苯酚、水合茚三酮、亞硫酸氫鈉、硫酸鈉、氫氧化鈉、環氧丙烷、醋酸酐、鹽酸、酚酞、疊氮鈉、無水乙醇均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

VersaMax酶標儀 美國Molecular Devices公司；ALC-2100電子分析天平 上海精密儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州市亞榮儀器有限公司；TDL-5-A離心機 上海安亭科學儀器廠；DHG-9420A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；FW80-I高速萬能粉碎機 天津市泰斯有限公司；SU8000掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司；SBS-160F自動部分收集器 上海精科實業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小麥淀粉不同組分分離

參考文獻[13-14]對小麥淀粉不同組分進行分離。

1.3.2 乙酰化淀粉、羥丙基淀粉及乙酰化羥丙基復合改性淀粉的制備

參考文獻[15-18]對乙酰化淀粉、羥丙基淀粉及乙酰化羥丙基復合改性淀粉進行制備。

1.3.3 表面糊化淀粉的制備

精確稱量小麥淀粉7.5 g，懸浮于17.5 mL 4 mol/L的無水氯化鈣中，在溫度為21 ℃的磁力攪拌器中160～200 r/min攪拌一定時間，加入0 ℃冰水混合物后，8 000 r/min離心20 min，棄上清液，將沉淀用1 L蒸餾水洗滌15～25 min，去除殘留氯化鈣后離心[8,19]。

1.3.4 淀粉糊化率的測定

將處理后的淀粉懸浮于200 mL蒸餾水中，高速（960～1 000 r/min）攪拌10 min，此過程重復5 次，靜置30 min，小心倒出上清液， 分離糊化淀粉。重新注入200 mL蒸餾水，將上述過程重復一次。沉淀用無水乙醇洗滌2 次，離心，然后將其放入40 ℃的烘箱中干燥，上清液經旋轉蒸發去除水分后，用10 倍體積無水乙醇洗滌，8 000 r/min離心30 min后收集糊化淀粉，無水乙醇洗滌2 次后于40 ℃的烘箱中干燥[8,19]。按下式計算淀粉糊化率。

1.3.5 取代度測定

參考文獻[20-21]測定取代度。

1.3.6 凝膠滲透色譜測定分子質量分布

參考文獻[22]，采用凝膠滲透色譜測定分子質量分布。

1.3.7 總糖含量的測定

通過苯酚-硫酸法進行總糖含量的測定，取1 mL樣品（含總糖10～100 μg）加入1 mL體積分數5%的苯酚溶液，混合，加入5 mL濃硫酸后混合均勻，置于室溫保持20～30 min，在490 nm波長處測定吸光度[23]。

1.3.8 淀粉藍值測定

取200 μL樣品注入96 孔酶標板，加入200 μL碘溶液，混合，使用VersaMax酶標儀在630 nm波長處測定吸光度[23]。

1.3.9 直鏈淀粉質量分數的測定

根據凝膠滲透色譜圖，利用面積法計算出直鏈淀粉質量分數[23]。

1.3.10 淀粉顆粒形貌分析

利用SU8000掃描電子顯微鏡，將待測樣品用雙面膠固定在樣品臺上，采取離子濺射法在樣品的表面鍍金。分析條件為：噴金180 s，電流20 mA。

1.4 數據統計與分析

采用Origin 9.0軟件處理數據并進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 小麥淀粉顆粒形貌分析結果

圖1 表面糊化處理前后小麥淀粉顆粒形貌Fig. 1 Granule morphology of the wheat starches before and after surface gelatinization

圖1 A～C分別為小麥總淀粉及小麥A淀粉、B淀粉的掃描電子顯微鏡照片，可以看出小麥A淀粉的顆粒呈圓盤形、扁球形，顆粒表面比較光滑，無明顯孔洞及破損；B淀粉形狀并不均勻一致，其不完整程度和邊緣破損程度均較A淀粉高，B淀粉顆粒間有團聚現象，在數量上明顯多于A淀粉，這與文獻[24-26]觀察到的結果一致。圖1D～E為表面糊化處理30、45 min后剩余A淀粉顆粒，外層糊化淀粉移除后顆粒大小有所減小，且表面較為粗糙，有明顯的剝蝕現象，這表明氯化鈣溶液主要作用于淀粉顆粒表層，糊化后在機械力作用下，淀粉從表層脫落，剩余淀粉顆粒的結構仍被保留。圖1F為表面糊化處理后表層剝離的糊化淀粉，可以看到這部分淀粉已經完全失去顆粒結構，呈現不規則形狀。

2.2 小麥淀粉分子質量分布分析結果

凝膠滲透色譜法不但能應用于不同組分的分離與鑒定，還可用來分析化學性質相同但分子體積不同的高分子同系物。一般按照淀粉分子流出凝膠柱的先后順序將淀粉的組成分為高分子質量級分、中間級分和低分子質量級分；前者主要為支鏈淀粉，其峰形尖銳，相對分子質量分布相對較為集中；后者為直鏈淀粉，由許多不同聚合度的直鏈分子組成，多呈現連續分布的狀態；而中間級分分布有時不是十分明顯，它主要包括了支化度較低的支鏈淀粉和糊精[27]。

圖2 小麥淀粉及其改性淀粉的滲透凝膠色譜圖Fig. 2 Gel permeation chromatograms of the native and modified wheat starch

由圖2可見，凝膠色譜圖呈連續分布狀態，主要由直鏈淀粉與支鏈淀粉兩個部分組成，其中支鏈淀粉分子摩爾質量較大，約在幾百萬到幾億g/mol，所以先被洗脫出來；直鏈淀粉分子摩爾質量較小，約在幾萬至幾百萬g/mol，所以后被洗脫出來[28-29]。由圖2可以看出，淀粉改性前后分子質量的大小與分布發生了較大變化，原淀粉（圖2A～C）的分子質量分布相對集中，支鏈淀粉的分子質量很大，峰形高且尖銳；直鏈淀粉峰較寬但高度低，這表明直鏈淀粉分子是由很多聚合度不同的直鏈淀粉分子組成，其聚合度呈連續分布。而改性淀粉（圖2D～H）的尖峰位置相較于原淀粉均出現推移的現象。由此可說明，隨著酯化反應的進行，淀粉的支鏈發生一定程度裂解，逐漸斷裂成支化度更小的分子。此外，改性淀粉的分子質量分布范圍逐漸變寬，由凝膠排阻色譜圖可以看出，醋酸酐添加量越多取代度越大，對于淀粉分子質量分布影響也越大。高取代度下，改性淀粉分子質量下降愈加明顯，意味著淀粉分子降解程度提高。此外，乙酰化羥丙基復合改性淀粉（圖2G～H）先醚化再酯化，其中環氧丙烷及醋酸酐對于乙酰化羥丙基淀粉的分子質量分布影響較大，原料羥丙基淀粉，摩爾取代度是0.13，經乙酰化后分子質量分布依然較寬，藍值明顯增加，可能是因為在制備過程中要以酸為試劑，在加熱條件下，部分長支鏈淀粉降解，斷裂成不同分子質量的短鏈淀粉所導致。所以制備乙酰化羥丙基淀粉的分子質量分布也較寬，分子質量也有所降低。

2.3 表面糊化處理后小麥淀粉分子質量分布分析結果

圖3 表面糊化處理前后小麥淀粉及乙酰化小麥A淀粉凝膠滲透色譜Fig. 3 Gel permeation chromatograms of the native and modified wheat starches before and after surface gelatinization

由圖3可以看出，不論是原淀粉還是改性淀粉，經表面糊化處理后剩余淀粉的藍值都顯著下降，表面糊化處理時間越長，高分子質量的淀粉分子被去除越多，所以藍值逐漸降低。隨著處理時間的延長，支鏈淀粉分子質量也逐漸降低，可能是淀粉經表面糊化處理后部分的支鏈淀粉被移除或降解，后者斷裂成不同分子質量的短直鏈淀粉所致；且隨著處理時間的延長其藍值下降愈加明顯；其次，與原淀粉相比，表面糊化處理后剩余淀粉的藍值彌散性顯著增大。小麥A淀粉及乙酰化A淀粉經表面糊化處理后剩余淀粉的總糖含量下降顯著，這與Jane[8]和Granza[18]等的研究規律一致。

2.4 表面糊化前后小麥淀粉不同組分直鏈淀粉質量分數與 糊化率分析結果

表1 表面糊化前后小麥淀粉不同組分直鏈淀粉質量分數及糊化率Table 1 Amylose content and gelatinization degree of the wheat starches before and after surface gelatinization

從表1中可以看出，小麥淀粉各組分經表面糊化處理后直鏈淀粉質量分數呈下降趨勢，并且隨著處理時間的延長而逐漸降低；在表面糊化處理30 min后，直鏈淀粉質量分數為（24.10±0.12）%，下降的速率較快，隨后減慢；其次，小麥淀粉各組分經表面糊化處理后，隨處理時間延長糊化度呈上升趨勢。由表1可知，剩余小麥A淀粉的直鏈淀粉質量分數要高于剩余小麥B淀粉的，證明隨著顆粒增大其直鏈淀粉質量分數增加，這與Jane[8]、Kuakpetoon[10]和Pan Daodong[19]等之前的報道一致。以上實驗結果表明直鏈淀粉更集中于淀粉顆粒外層，且剩余淀粉有一個較低的直鏈淀粉質量分數，也證明了CaCl2處理發生在淀粉的外層。

2.5 表面糊化處理單一及復合改性淀粉取代度變化分析結果

由圖4可知，乙酰化小麥B淀粉的取代度高于相應的乙酰化小麥A淀粉。這是因為與大顆粒淀粉相比，小顆粒淀粉的比表面積更大，表面的羥基更多，和乙酸酐反應的羥基基團也更多。單一改性及復合改性的淀粉經表面糊化處理后，乙酰化小麥總淀粉剩余淀粉（CaCl2處理30、45、60 min）的取代度分別為0.049、0.035及0.021，羥丙基小麥總淀粉剩余淀粉取代度分別為0.109、 0.087及0.062，乙酰化羥丙基小麥總淀粉剩余淀粉取代度分別為0.05、0.04及0.02。從以上數據可以看出，隨著表面糊化處理時間的延長，剩余淀粉顆粒的取代度呈下降趨勢。表面糊化處理后外層糊化的程度越高，所獲得的剩余淀粉顆粒取代度就越小，表明乙酰化基團的取代反應主要在淀粉顆粒的外層發生，淀粉顆粒中心部位的乙酰基含量均較低，說明顆粒內部發生取代的概率小。因為乙酸酐是一類快速反應劑，在進入到淀粉內部前已經和外部的羥基進行了反應。Chen Zhenghong等研究結果證實淀粉和乙酸酐發生反應時，主要發生在淀粉的無定形區域及結晶區域的外層[6]。Stapley等也證明快速反應試劑會在較大程度上和淀粉顆粒外層的羥基發生反應[30]。

圖4 表面糊化處理前后小麥改性淀粉取代度Fig. 4 Substitution degree of the wheat starches before and after surface gelatinization

3 結 論

小麥原淀粉主要由支鏈與直鏈淀粉組成，前者峰形較為尖銳，說明其相對分子質量較為集中；后者峰寬高但強度低，表明其是由一些不同聚合度的直鏈淀粉分子組成，聚合度呈連續分布。通過凝膠排阻色譜發現，表面糊化后剩余淀粉的藍值及總糖含量明顯下降，表明小麥淀粉經表面糊化處理后部分被移除或降解。通過測定其剩余淀粉顆粒中直鏈淀粉質量分數可知，隨著表面糊化處理時間的延長，其直鏈淀粉質量分數隨之降低；且剩余小麥A淀粉的直鏈淀粉質量分數要高于剩余小麥B淀粉的含量，證明隨著顆粒大小的增加其直鏈淀粉質量分數增加。通過淀粉表面糊化處理前后的取代度測定結果可知，單一及復合改性的取代反應都主要發生在淀粉顆粒的表層，顆粒內部發生取代反應的概率較小。