射流空化對大豆分離蛋白的理化性質及結構的影響

白 銀，高 悅，王中江，江中洋，孟凡迪，江連洲,*

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省政務大數據中心，黑龍江 哈爾濱 150028）

大豆分離蛋白是一種產量大、價格低廉的植物蛋白資源，不僅具有良好的營養價值和保健作用，還具有出色的功能性質，包括凝膠性、黏彈性、乳化性、起泡性等[1]，在食品工業中作為食品添加劑被廣泛應用。然而未經改性的大豆蛋白理化性質受到限制，不能滿足特定食品加工的要求，因此，改善大豆分離蛋白功能性質、提高其在工業上的利用率成為亟待解決的問題。大豆分離蛋白改性方法可分為物理改性、化學改性、酶法改性和基因工程改性。其中物理改性主要通過改變蛋白質的高級結構以及分子間聚集方式達到蛋白改性的目的，因其具有成本低、無毒害、操作簡單等優點受到研究人員廣泛關注。針對大豆蛋白結構改造、提高理化性質的物理改性方法很多，目前國內外有學者將高壓微射流、高壓均質、液氮冷凍等技術應用到大豆蛋白改性中，使大豆蛋白部分理化性質得到改善[2-5]。

水力空化技術是一種新興技術，它有著與超聲空化相似的空化效應，是目前國內外學者的研究熱點。與超聲空化相比，水力空化結合了高溫高壓、瞬時微射流以及強烈的沖擊波，為多物理場結合的處理方法[6]。形成水力空化的方法主要有渦流和射流，其中射流空化是一種物理現象，當液體進入空化反應器中后，空氣會對液體施加一種低于該液體飽和蒸氣壓以下的壓力，使得氣核快速增長產生空化起泡，此時混在流體里的空化氣泡要經歷初生、發育、長大、收縮和潰滅這一過程。而空化氣泡在破裂的瞬間，微射流產生的溫度可以達到5 000 K[7]，壓力可以達到140～170 MPa，其強烈的沖擊波時速可達400 km/h[8]。射流空化因其設備操作簡單、性能穩定、能耗低、易于實現工業化等特點，近年來逐漸得到各界學者的廣泛關注。管金發等[7]研究射流空化破乳效果，發現其既可以促進小液滴聚集促使乳化油廢水破乳，又可使廢水中較大液滴破碎分散并且進一步乳化。孫煥煥等[9]發現射流空化能夠有效地強化糖液澄清脫色，使糖液的色值下降率達到最大值2.056%。古穎龍等[10]探究發現空化作用可以形成強烈的沖擊波和高速的微射流，作用于液體可以實現一般條件下難以實現的物理和化學反應。任仙娥等[6]研究基于渦流的水力空化對大豆分離蛋白功能性質的影響，發現大豆分離蛋白的溶解度隨著水力空化處理時間的延長而增加，并且經過處理后液體的起泡性由14%顯著增加到310%。Yang Feng等[11]利用旋轉空化對大豆分離蛋白進行改性，發現旋轉空化處理可以改善大豆分離蛋白的乳化性能、改變二硫鍵和巰基含量，同時二級結構也會受到旋轉空化的影響。本實驗以大豆分離蛋白為原材料，通過射流空化處理對大豆分離蛋白進行物理改性，并探究射流空化時間對其理化性質和功能結構的影響，以期為射流空化在大豆蛋白工業改性方面的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食品級大豆分離蛋白（純度99%） 山東禹王有限公司。

十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）天津市光復精細化工研究所；Lowry蛋白試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS） 美國Sigma公司。所用試劑最低純度為分析純。

1.2 儀器與設備

FD 5-3型冷凍干燥機 美國SIM公司；電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司；高速離心機德國Eppendorf公司；1600PC紫外-可見分光光度計上海美譜達儀器有限公司；XW-80A漩渦混合器 上海青浦滬西儀器廠；F-4500型熒光分光光度計 日本日立公司；MAGNA-IR560傅里葉變換紅外光譜系統 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將大豆分離蛋白以質量分數2%和5%（下同）溶解于磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L、pH 7.0）中，充分攪拌后將樣品溶液用射流空化機在20 ℃、0.01 MPa條件下處理不同時間（2、4、6、8、10 min），得到樣品溶液，冷凍干燥后磨粉備用。

1.3.2 傅里葉變換紅外光譜測定

傅里葉變換紅外光譜測定參考齊寶坤等[12]的方法，精確稱取1 g樣品，與100 g溴化鉀用研缽混合后壓片測定，掃描范圍為400～4 000 cm－1，所得數據用peak fit軟件分析。

1.3.3 熒光光譜測定

參照孫英杰[13]的方法將樣品用0.01 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液溶解至0.05 mg/mL，并在10 000×g下離心30 min，測定上清液的熒光強度。熒光光譜激發波長為290 nm，掃描發射光譜范圍為300～400 nm，掃描速率為60 nm/s，激發和發射狹縫寬度均為5 nm。

1.3.4 溶解度的測定

參考Molina等[14]的測定方法，用磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L、pH 7.0）配制2 mg/mL的蛋白質溶液，攪拌1 h使樣品溶解，在室溫條件下20 000 r/min離心15 min，采用Lowry法[15]測定蛋白質含量。蛋白質溶解度為上清液中蛋白的含量比樣品中總的蛋白含量。

1.3.5 濁度的測定

采用Beveridge等[16]的方法測定，將凍干粉末樣品用蒸餾水溶解至蛋白質量濃度為2 mg/mL，用紫外-可見分光光度計在600 nm波長處測定其吸光度，以不加蛋白的空白溶液為對照。

1.3.6 表面疏水性的測定

參考Kato等[17]采用的ANS熒光探針法進行測定。用0.01 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液溶解樣品使其質量濃度為2 mg/mL，在室溫下攪拌1 h后將其在10 000×g下離心30 min獲取上清液。用磷酸鹽緩沖液將上清液梯度稀釋至0.005～0.5 mg/mL之間，取40 μL 8 mmol/L的ANS溶液加入到4 mL不同質量濃度的蛋白樣品中，振蕩混勻，靜置3 min后測其熒光強度。激發波長370 nm，發射波長490 nm，夾縫寬度為1 nm。以熒光強度對蛋白質量濃度作圖，以初始段斜率表示蛋白質分子的表面疏水性。

1.3.7 乳化活性及乳化穩定性的測定

乳化活性及乳化穩定性的測定根據汪菁琴[18]的方法稍加改動，用磷酸鹽緩沖液將蛋白樣品溶解至質量濃度為2 mg/mL，取9 mL樣品溶液加入3 mL油，在室溫下用均質機在10 000 r/min條件下均質1 min。快速取出50 μL樣品，用0.1 g/100 mL的SDS溶液稀釋250 倍，漩渦振蕩后用分光光度計在500 nm波長處測定其吸光度A。30 min后再次測定其吸光度A0。用0.1 g/100 mL的SDS溶液作為空白對照。按式（1）、（2）分別計算乳化活性及乳化穩定性。

式中：A為樣品溶液吸光度；ρ為乳化液形成之前的溶液中蛋白質量濃度/（g/mL）；φ為油占乳化液的體積分數/%；N為樣品稀釋倍數。

式中：A0為30 min后樣品溶液的吸光度。

1.3.8 持水性的測定

持水性的測定參考Javier等[19]的方法，準確稱取蛋白樣品0.2 g于離心管中并記錄此時樣品和離心管的總質量m1/g，向離心管中加入4 mL去離子水并漩渦振蕩，之后靜置30 min，然后在室溫條件下2 500 r/min離心20 min，去除上清液，稱量此時離心管及剩余樣品總質量m2/g。按公式（3）計算持水性。

1.3.9 持油性的測定

持油性的測定參考Javier等[19]的方法，準確稱取蛋白樣品0.2 g于離心管中并記錄此時樣品和離心管的總質量m3/g，向離心管中加入4 mL大豆油，漩渦振蕩后靜置30 min，然后在室溫條件下2 500 r/min離心20 min，去除上層油，稱量此時離心管及剩余樣品總質量m4/g。按公式（4）計算持油性。

1.4 數據統計與分析

每個實驗重復3 次，采用Origin 8.5軟件作圖。采用SPSS V17.0軟件中方差分析法進行差異顯著性分析，P＜0.05為顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 射流空化處理后大豆分離蛋白的傅里葉變換紅外光譜分析結果

傅里葉變換光譜是研究蛋白質二級結構的重要手段，該方法主要能夠提供蛋白質分子中酰胺I帶的振動波段信息，再用二階導數紅外去卷積光譜擬合對二級結構進行定量分析[20]。不同射流空化處理時間2%、5%大豆分離蛋白的傅里葉變換紅外光譜分別見圖1、2。

圖1 不同處理時間2%大豆分離蛋白傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 1 Fourier transform infrared spectra of 2% SPI at different treatment times

圖2 不同處理時間5%大豆分離蛋白傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 2 Fourier transform infrared spectra of 5% SPI at different treatment time

表1 射流空化對2 大豆分離蛋白二級結構的影響Table 1 Effect of jet cavitation on the secondary structure of 2 SPI

如表1、2所示，大豆分離蛋白的二級結構主要以β-折疊為主，這與已有研究結果[21-22]相符。射流空化處理后大豆分離蛋白的二級結構發生改變，α-螺旋結構相對含量升高，證明射流空化破壞了蛋白質分子的有序結構，呈現出無序結構的結合[23]。而β-折疊和β-轉角相對含量降低，無規卷曲相對含量升高，說明大豆分離蛋白分子的剛性結構減弱，柔性結構增強，分子由有序結構變為無序[24]。射流空化處理4 min內大豆分離蛋白的二級結構變化較為明顯，α-螺旋和無規卷曲含量升高最多，說明此時射流空化處理對蛋白質的二級結構影響最大。經射流空化處理后β-折疊結構含量降低，說明在處理過程中β-折疊結構逐漸轉變為α-螺旋結構及無規卷曲結構，而β-折疊結構位于蛋白質內部，其含量降低表明蛋白質疏水位點暴露，因此蛋白質表面疏水性增加[25]。而在不同蛋白質量分數下，各結構變化趨勢基本相同，說明改變蛋白質量分數不會進一步影響其二級結構。

表2 射流空化對5%大豆分離蛋白二級結構的影響Table 2 Effect of jet cavitation on the secondary structure of 5 SPI

2.2 射流空化大豆分離蛋白的熒光光譜分析結果

激發波長為290 nm時，色氨酸殘基可在300～400 nm的發射圖譜內產生熒光，色氨酸的熒光峰位表示其在蛋白質中的位置[26]，因此可以表征蛋白質三級結構的變化。

圖3 射流空化對2%的大豆分離蛋白熒光強度的影響Fig. 3 Effect of jet cavitation on the fl uorescence intensity of 2% SPI

圖4 射流空化對5%的大豆分離蛋白熒光強度的影響Fig. 4 Effect of jet cavitation on the fl uorescence intensity of 5% SPI

從圖3、4可知，兩種質量分數大豆分離蛋白的最大吸收峰位均從335 nm波長處紅移至340 nm波長處。熒光峰位的紅移說明在空化作用下，蛋白質分子結構逐漸展開，空間構象發生變化，色氨酸殘基暴露于蛋白質表面，也就是熒光發射基團的微環境極性增加，肽鏈更加伸展[27]。經過射流空化處理的蛋白樣品熒光強度發生明顯上升，其中2%蛋白樣品的熒光強度隨處理時間的延長呈逐漸上升趨勢，5%的蛋白樣品的熒光強度隨處理時間的延長呈先增加后降低的趨勢，這與表面疏水性的測定結果一致，這說明一定程度的射流空化會導致大豆分離蛋白內部的疏水基團的暴露。

2.3 射流空化處理對大豆分離蛋白溶解性的影響

蛋白質的溶解性是其他功能性質的先決條件，蛋白質和水分子通過肽鍵或者其氨基酸側鏈相互作用[28]。

圖5 射流空化對大豆分離蛋白樣品溶解度的影響Fig. 5 Effect of jet cavitation on the solubility of SPI

由圖5可以看出，射流空化處理能夠顯著提升大豆分離蛋白的溶解性。射流空化處理兩種質量分數的蛋白樣品時溶解度均有所上升，這可能是由于射流空化中產生的壓力和高速微射流作用于大豆蛋白聚集體，進而解聚分散成顆粒較小的分子，并暴露更多的疏水基團和親水性基團等，增加分子的表面電荷，提高了蛋白質的水合作用，從而使大豆分離蛋白的溶解度增加[29]。而質量分數為2%的樣品溶解度在處理4 min時最大，達到96.15%，在此之后呈現降低的趨勢。這可能是因為射流空化處理大豆分離蛋白時存在的過處理現象，當樣品中蛋白質量分數較低時，溶液中顆粒比較分散，而過度的空化效應提高了蛋白質分子間的靜電作用力以及疏水相互作用，這些作用力使過度展開的蛋白質分子聚集形成不溶性聚集體，導致溶解度又略有下降[10]。

2.4 射流空化處理對大豆分離蛋白濁度的影響

濁度表示溶液的透明程度，是溶劑中存在的懸浮物對光線透過時產生的阻礙程度[13]，濁度可以直觀反映出溶液中顆粒的分散情況。

由圖6可以看出，經射流空化后兩種質量分數的蛋白溶液濁度均有所下降，這是由于空化效應可以使溶液中聚集體尺寸降低[30]。且質量分數為5%時濁度下降幅度較大，呈持續下降趨勢，這是因為未經射流空化處理時樣品質量分數較高，含有較多的聚集體，但經射流空化處理后蛋白分子結構展開，增加了蛋白分散程度，降低了溶液的濁度，并且射流空化時間越長，溶液的濁度越低。但樣品質量分數為2%時蛋白溶液的濁度變化不明顯，總體呈先降低后增加的趨勢。這表明射流空化對高質量分數的蛋白溶液的濁度降低更加明顯，這可能是由于射流空化的過處理效應導致過度展開的蛋白質分子發生聚集。

圖6 射流空化對大豆分離蛋白濁度的影響Fig. 6 Effect of jet cavitation on the turbidity of SPI

2.5 射流空化處理對大豆分離蛋白表面疏水性的影響

表面疏水性是維持蛋白質結構的主要作用力，對蛋白質分子間的相互作用具有很大影響，是衡量蛋白質理化性質的重要指標之一[31]。

圖7 射流空化對大豆分離蛋白表面疏水性的影響Fig. 7 Effect of jet cavitation on the surface hydrophobicity of SPI

從圖7可以看出，與未經射流空化處理的蛋白樣品相比，兩種質量分數蛋白樣品的表面疏水性均有不同程度的增加。其中質量分數2%的大豆分離蛋白表面疏水性總體呈上升趨勢，說明射流空化中的空化現象會使蛋白質分子擴散和展開，使其疏水區域暴露在分子表面[32]。在處理8 min和10 min時表面疏水性最高分別達到20 080和19 820，這可能是因為隨射流空化處理時間延長，蛋白質分子的解折疊效果遠大于亞基的解聚，因此此時大豆蛋白的表面疏水性顯著增加。而質量分數5%的大豆分離蛋白的表面疏水性呈現先增加后保持平穩的趨勢，這可能是因為大豆分離蛋白溶液質量分數的增加，射流空化使蛋白質分子的疏水基團暴露，表面疏水性增加。然而隨著處理時間延長，射流空化作用達到飽和，使蛋白質分子的表面疏水性沒有明顯變化。

2.6 射流空化處理對大豆分離蛋白乳化活性及乳化穩定性的影響

蛋白質的乳化性能可以通過乳化活性和乳化穩定性來表征，乳化活性表示蛋白質在水-油混合過程中吸附在油滴界面降低其界面張力，起到乳化作用的性質，它主要是由蛋白質分子鏈內部分布的親水或疏水基團所決定的[18]。

圖8 射流空化對大豆分離蛋白乳化活性的影響Fig. 8 Effect of jet cavitation on the emulsifying activity of SPI

從圖8可以看出，質量分數2%蛋白樣品的乳化活性隨射流空化處理時間延長而顯著升高，這是因為射流空化處理后樣品中的蛋白質分子伸展，分子內部基團暴露，使得在乳化過程中有更多的小分子聚集在油-水界面上，因此使得樣品的乳化活性有顯著提高[18]。質量分數5%的蛋白樣品乳化活性呈先降低后增加的趨勢，這可能是因為蛋白質量分數增加，在短時間內分子間的亞基會發生聚集，產生分子間作用力，導致乳化活性降低，而隨著射流空化處理時間延長，蛋白質分子趨于無序，剛性結構減少，柔性結構增加，使得乳化活性又逐漸增加。

圖9 射流空化處理對大豆分離蛋白乳化穩定性的影響Fig. 9 Effect of jet cavitation on the emulsion stability of SPI

由圖9可以看出，兩種質量分數的大豆分離蛋白經射流空化處理后乳化穩定性均明顯增加，這可能是因為隨著射流空化時間的延長，蛋白質分子中的疏水性基團逐漸暴露出來，增加了蛋白分子與油滴的吸引作用，使蛋白質分子的體積減小，從而增加了蛋白溶液的乳化穩定性[14]。2%的大豆分離蛋白樣品乳化穩定性呈先增加后降低的趨勢，這可能是因為在樣品質量分數較小時存在射流空化的過處理現象，過度的空化效應導致了蛋白分子發生聚集，聚集后構象穩定性增強，不易快速在油-水界面上穩定，導致乳化穩定性降低[33]。

2.7 射流空化處理對大豆分離蛋白持水性的影響

蛋白質的持水性指蛋白質吸收水并將水保留在蛋白質組織中的能力。從圖10中可以看出，兩種質量分數蛋白樣品經射流空化處理后持水性均有所下降。隨著射流空化時間的延長，質量分數2%的大豆分離蛋白的持水性呈總體下降趨勢，這是因為長時間的射流空化處理使蛋白質分子展開，暴露了其中的疏水性基團，使持水性下降[33]。而質量分數5%的大豆分離蛋白經射流空化處理后，持水性略有下降，且不同處理時間的樣品持水性變化不明顯，這可能是因為隨著處理時間延長，射流空化作用達到飽和，疏水基團不再暴露，各樣品的持水性基本持平，這與表面疏水性測定結果一致。

圖10 射流空化對大豆分離蛋白持水性的影響Fig. 10 Effect of jet cavitation on the water-holding capacity of SPI

2.8 射流空化處理對大豆分離蛋白持油性的影響

圖11 射流空化處理對大豆分離蛋白持油性的影響Fig. 11 Effect of jet cavitation on the oil-holding capacity of SPI

持油性反映了蛋白質吸附油的能力，從圖11中可以看出，經射流空化處理后的蛋白樣品持油性均有較明顯的增加，其中質量分數2%的蛋白樣品增加幅度較大，這是因為經射流空化處理后，蛋白質分子結構打開，使分子中的疏水性基團暴露，油中存在的疏水脂肪酸鏈就會結合到疏水基團上[14]，因此提高了分子的持油能力。而質量分數5%的蛋白樣品持油性隨射流空化時間的延長變化不明顯，這可能是由于此時射流空化作用達到飽和，疏水性基團不再暴露，因此持油性變化不明顯。

3 結 論

射流空化能夠使大豆分離蛋白的亞基解聚，使濁度明顯下降，且射流空化中的空化效應會使蛋白質分子擴散并展開，暴露其疏水性氨基酸，使其乳化性、持油性、表面疏水性隨處理時間延長而增加。然而射流空化處理會使大豆分離蛋白的疏水基團暴露，導致持水性明顯下降。在研究過程中還發現射流空化對高質量分數大豆分離蛋白功能性質的改善較為明顯，當溶液中蛋白質質量分數較低時，顆粒分散至一定程度，過度的空化效應提高了蛋白質分子間的靜電作用力以及疏水相互作用，這些作用力使過度展開的蛋白質分子聚集形成不溶性聚集，所以導致溶解性和乳化穩定性有一定的下降。射流空化處理后大豆分離蛋白的二級結構也會發生變化，α-螺旋和無規卷曲相對含量升高，而β-折疊和β-轉角的相對含量降低，說明大豆分離蛋白分子的剛性結構減少，柔性結構增加，分子由有序結構變為無序。同時，在射流空化作用下，大豆分離蛋白熒光峰位紅移，兩種濃度蛋白的熒光強度均呈增加趨勢，表明色氨酸暴露于蛋白質表面，蛋白質分子結構展開，肽鏈更加伸展。