葉 韜,陳志娜,葉倩文,劉慧乾,王 云,陸劍鋒*
(1.淮南師范學院生物工程學院,安徽 淮南 232038;2.資源與環境生物技術安徽普通高校重點實驗室,
安徽 淮南 232038;3.合肥工業大學食品與生物工程學院,安徽 合肥 230009;4.安徽省農產品精深加工重點實驗室,安徽 合肥 230009;5.農產品生物化工教育部工程研究中心,安徽 合肥 230009)
豆干是豆腐干的簡稱,它是熟豆漿經添加凝固劑、擠壓脫水而成的含水分較低的各種形狀的產品,屬于非發酵豆制品。將豆干在鹵湯中鹵制,經過或不經過調味、過油、拌料,得到具有一定滋味的鹵制豆腐干(有地區稱作茶干)[1]。鹵豆干美味可口,深受廣大消費者的喜愛。然而豆干營養豐富,容易滋生微生物,從而導致腐敗變質,使其貨架期通常較短[2]。為了延長鹵豆干保質期,方便其市場流通,需要對鹵制(調味)的豆干進行包裝、殺菌,得到預包裝食品,也稱作即食豆干、休閑豆干[3]。目前,即食豆干已成為豆制品加工企業的主要休閑產品之一,其生產量和銷售量在逐年增加[4]。
即食豆干在生產過程中,原料白干、所在的加工環境、加工設備和加工人員等各因素都可能給即食豆干產品帶來微生物污染,而殺菌工藝是控制成品微生物含量的最后一道關鍵工藝[5-6]。為保證即食豆干在貯藏、運輸和銷售中達到所要求的微生物標準,前期本課題組采用了高溫滅菌(121 ℃、30 min)進行了處理[2]。然而,高溫滅菌處理會導致豆干口感變差、香氣下降等品質劣變的問題[7],因此,需要對即食豆干生產過程中現有的殺菌工藝進行改良,以改善產品品質。周先漢等[8]報道稱采用巴氏殺菌(80 ℃、20 min)處理茶干具有較好的殺菌效果,再配合乳酸鏈球菌素(0.1 g/kg)可以有效地延長茶干的貨架期。陳浩[9]采用響應面法優化法得到酸漿豆干(豆清蛋白發酵液點漿)超高壓殺菌的最佳工藝參數為438 MPa、21 min、61 ℃,并比較了超高壓殺菌、巴氏殺菌和高溫滅菌對休閑豆干質構和感官屬性的影響。Huang等[10]比較了高溫殺菌(105 ℃、20 min)和過氧化氫浸泡(體積分數0.25% H2O2溶液浸泡10 min)對石膏豆干的影響時發現,高溫滅菌能夠使得石膏豆干中的菌落總數降低3 個對數值,且熱處理殺菌后豆干中大豆異黃酮的損失要小于過氧化氫浸泡組。然而,關于熱處理和超高壓處理對鹽鹵豆干品質特性影響的相關報道較少,尤其是殺菌方式對于豆干中生物活性成分大豆異黃酮組分和含量的影響鮮見報道。
為探討不同殺菌方式對即食豆干品質特性的影響,本實驗研究了傳統的熱殺菌工藝(巴氏殺菌和高溫殺菌)、典型的冷殺菌工藝(超高壓殺菌)以及熱輔助高壓殺菌對即食鹽鹵豆干微生物、感官指標以及生物活性成分大豆異黃酮的影響,旨在為即食鹽鹵豆干的品質改良提供參考。
大豆為市售東北大豆;鹽鹵(MgCl2,食品級)天津瑞澤順暢化工科技有限公司;大豆苷元(daidzein)、染料木黃酮(genistein)、大豆苷(daidzin)、黃豆黃素(glycitein)、染料木苷(genistin)和黃豆黃苷(glycitin)標準品 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
甲醇、乙腈、乙酸(均為色譜純) 上海安譜實驗科技股份有限公司;胰蛋白胨、瓊脂、酵母浸膏、葡萄糖(均為分析純) 北京奧博星生物技術公司。
FDM-100-40型自動分離磨漿機 鎮江新區鑫寶機械廠;76-1A型恒溫水浴鍋 金壇市白塔新寶儀器廠;數顯豆腐壓榨機由實驗室自組裝;SQP型分析天平賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;DZ-500型多功能真空包裝機 南通彩星工貿有限公司;HPP.L2-600/0.6型超高壓設備 天津華泰森淼生物工程技術股份有限公司;YT-48A型白度色度儀 杭州研特科技有限公司;TA.XT PLUS型物性測試儀 英國Stable Micro Systems公司;YM50CM型高壓滅菌鍋 上海三申醫療器械有限公司;e2695型高效液相色譜儀(配有2998紫外檢測器)美國Waters公司。
1.3.1 豆干的制備
取1 000 g大豆,按豆水質量比1∶3于室溫(25 ℃)下浸泡18 h,豆水比1∶6磨漿,調整可溶性固形物質量分數至8%,加熱并煮沸(100 ℃)5 min,加干大豆質量2%的鹽鹵,于85 ℃下點漿,保溫蹲腦15 min,入模,以5 MPa壓榨30 min,切分成3.5 cm×3.5 cm×0.5 cm小塊后進行鹵制,豆干和鹵水的質量比為1∶4,鹵水中含有食鹽3%(質量分數,下同)、白砂糖4%、味精1%、辣椒0.6%、花椒0.3%、八角0.5%、小茴香0.3%、生姜0.3%、牛肉膏0.2%,水浴鍋中90 ℃煮制20 min,40 ℃熱風干燥20 min后真空包裝。
1.3.2 豆干的殺菌處理
按表1所示條件對真空包裝豆干分別進行巴氏殺菌、高溫殺菌、超高壓殺菌、熱輔助超高壓殺菌,將殺菌后的豆干放于4 ℃冷藏待測。

表1 即食豆干的殺菌處理方式Table 1 Sterilization treatments for ready-to-eat dried soybean curd
1.3.3 微生物檢驗
細菌總數測定按GB/T 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品衛生微生物學檢驗 菌落總數測定》執行,大腸菌群測定按GB/T 4789.3—2016《食品安全國家標準食品衛生微生物學檢驗 大腸菌群計數》執行。
1.3.4 即食豆干質構的測定
采用TPA模式對樣品進行質構測定。每種殺菌樣品取10 份,測定豆干的硬度、彈性、黏聚性、咀嚼性、回復性。選擇P/36R探頭,進行力量校準,再進行高度校準,將待測樣品放于載物臺上,使探頭正對樣品,選擇觸發類型為Auto,觸發力為10 g,測定前運行速率為1 mm/s,測定時運行速率為2 mm/s,測定后運行速率為1 mm/s,壓縮程度為25%,兩次間隔時間為5 s。
1.3.5 即食豆干色澤的測定
每種樣品取大小厚薄均勻的10 份,測定各樣品色差。色度儀使用前先用黑板調零,再用白板校準,校準數據應與白板蓋上的數據一致。將樣品放入樣品槽中,測量樣品的色澤參數L值(亮度:0為黑,100為白);a值(紅綠度:負值表示綠色程度,正值表示紅色程度);b值(黃藍度:負值表示藍色程度,正值表示黃色程度)。
1.3.6 感官評價
以食品專業的師生共10 人組成評定小組,參照DB34/T 720.2—2009《地理標志產品 八公山豆腐 豆腐干》中的感官評價部分制定評定標準(表2)。分別從色澤、滋味與氣味和組織形態3 個方面對即食豆干進行感官評定,各項所占權重分別為0.3、0.4和0.3。

表2 即食豆干感官評定標準Table 2 Criteria for sensory evaluation of ready-to-eat dried soybean curd
1.3.7 即食豆干持水率的測定
參照賀云[11]的方法,稍有修改。準確稱取2.000 g豆干置于帶有小孔的5 mL離心管中,記錄此時的質量m1,套上10 mL的離心管后,于5 000 r/min下離心15 min,稱量離心后的豆干和5 mL離心管的質量,記為m2。離心后樣品的質量與離心前樣品質量的比值定義為持水率,按下式計算。

式中:m1為離心前樣品和離心管的質量/g;m2為離心后樣品和離心管的質量/g。
1.3.8 即食豆干大豆異黃酮含量的測定
參照馬玉榮[12]的方法,略有修改。樣品的制備:準確稱取冷凍干燥后的豆干樣品2.000 g放于5 mL的離心管中,加入3 mL體積分數80%甲醇溶液,超聲處理30 min,體積分數80%甲醇溶液定容至5 mL,以5 000 r/min離心15 min,取上清液過0.22 μm微孔濾膜待測。
高效液相色譜檢測條件:檢測波長為260 nm;柱溫為34 ℃;進樣量為20 μL;流動相為A:體積分數0.1%乙酸-水溶液,B:體積分數0.1%乙酸-乙腈溶液;梯度洗脫程序為0~5 min,15% A、85% B;6~35 min,15%~25% A、85%~75% B;36~40 min,50% A、50% B;41~45 min,50% A、50% B;46~50 min,50%~15% A、50%~85% B;51~55 min,15% A、85% B。
將大豆苷元、染料木黃酮、大豆苷、黃豆黃素、染料木苷和黃豆黃苷標準品溶解于體積分數80%甲醇溶液,超聲處理30 min,過0.22 μm的微孔濾膜,得到儲備溶液。
用進樣器吸取25 μL的樣品溶液于液相色譜儀中檢測1 h,再分別與標準品的峰面積進行比較,得出各種殺菌處理條件下對豆干中大豆異黃酮的影響。
每個實驗指標至少重復3 次,使用SPSS 17.0軟件中的Duncan多重比較進行差異顯著性分析(P<0.05),并用Origin Pro 8.0軟件作圖。
壓制成型的白干經過鹵制、干燥和真空包裝后得到待滅菌產品,干燥過程中的設備、真空包裝中的手工裝袋以及車間空氣等各因素都可能會導致即食豆干污染微生物,因此殺菌工序是控制即食豆干衛生品質的關鍵工序。表3為殺菌方式對即食豆干滅菌效果的影響,包裝后的豆干菌落總數達到76 000 CFU/g,經巴氏殺菌、超高壓殺菌、熱輔助超高壓殺菌、高溫殺菌后,菌落總數分別下降至420、180、120、130 CFU/g,且均未檢出大腸菌群(數據未列出),均低于DB34/T 720.2—2009中對菌落總數和大腸菌群的限量(750 CFU/g和150 MPN/100 g),也符合GB 2712—2014《食品安全國家標準 豆制品》中關于大腸菌群的限量。因此,選擇的殺菌方式均有較好的殺菌效果。

表3 殺菌方式對即食豆干滅菌效果的影響Table 3 Effect of sterilization methods on the sterilization ef fi ciency of ready-to-eat dried soybean curd
即食豆干的質構特性是評判產品感官質量的重要依據[3],由表4可知,不同殺菌方式主要影響豆干的硬度和咀嚼性,而對其 他指標影響不顯著(P>0.05)。與對照組相比,巴氏殺菌對鹽鹵豆干硬度和咀嚼性無顯著影響,超高壓殺菌、熱輔助超高壓殺菌、高溫殺菌會顯著增加豆干的硬度(分別增加36.51%、43.02%、68.04%)(P<0.05)。陳浩[9]在研究殺菌方式對湘式休閑豆干(酸漿豆干)品質影響時發現,超高壓殺菌和高溫殺菌分別使得豆干的硬度增加56%、135%,而巴氏殺菌影響不顯著,本研究結果與其類似。Lee等[13]在研究熱處理(高于100 ℃)對大豆分離蛋白豆腐質構影響時報道稱,高溫引起豆腐硬度的變化一方面是由于豆腐凝膠在高溫下水分含量下降;另一方面是高溫促使7S和11S大豆蛋白(豆腐的主要蛋白)之間產生了二硫鍵的交聯,使得豆腐的硬度增加,且熱處理的溫度越高,水分丟失越多,二硫鍵交聯越多。Prestamo等[14]應用超高壓(400 MPa、30 min、5 ℃)對豆腐進行保鮮時發現高壓處理后豆腐的凝膠網狀結構變的更加緊湊,這可能是由于7S和11S大豆蛋白的亞基在壓力的作用下展開,形成了堅實的凝膠網狀結構,使得豆腐的硬度增大。因此,高溫和超高壓殺菌會增加豆干的硬度。

表4 殺菌方式對即食豆干質構特性的影響Table 4 Effect of sterilization methods on the texture of ready-to-eat dried soybean curd
色澤是消費者選擇即食豆干的重要感官屬性之一,由圖1可知,巴氏殺菌、超高壓殺菌、熱輔助超高壓殺菌對豆干的色澤(L、a、b值)無顯著影響(P>0.05)。然而,高溫殺菌會顯著影響豆干的色澤,與對照組相比,豆干的亮度L值由80.99顯著降低至74.76(P<0.05),豆干的紅綠度a值由3.24增加至3.70,但統計學上差異不顯著(P>0.05),表明高溫滅菌后的豆干色澤變得灰暗,紅色略微加深。王磊等[7]研究發現,高溫殺菌(116 ℃、30 min)能夠使得醬香豆腐干的亮度L值損失8.10%,本研究結果與其類似,這可能是由于豆干在高溫下發生美拉德反應而產生的色澤變化[15]。因此,高溫殺菌對即食豆干色澤的影響較大。

圖1 殺菌方式對即食豆干色澤的影響Fig. 1 Effect of sterilization methods on the color of ready-to-eat dried ried soybean curd

表5 殺菌方式對即食豆干感官特性的影響Table 5 Effect of sterilization methods on sensory attributes of ready-to-eat dried soybean curd
由表5可知,巴氏殺菌和熱輔助超高壓殺菌對豆干色澤、滋味與氣味以及組織形態方面感官評分無顯著影響(P>0.05)。然而,超高壓和高溫殺菌會顯著降低豆干的評分(P<0.05),其中高溫殺菌影響最大,豆干的感官評分最低。陳浩[9]研究發現,超高壓殺菌后的豆干(豆清蛋白發酵液凝固)感官評分(92.8)稍低于未處理組(94.3),但差異不顯著(P>0.05),本研究結果與其稍有不同,這可能是由于制備豆干的原料和選用的凝固劑不同而造成的。高溫殺菌后豆干的感官品質嚴重下降,主要表現在色澤變暗、顏色加深,豆香味減弱,口感粗糙,組織形態變差,這可能是由于高溫下發生了蛋白變性、美拉德反應等復雜的變化導致,本研究結果與楊倩[16]研究中發現的現象一致。因此,巴氏殺菌和熱輔助超高壓殺菌能在一定程度上減少豆干感官品質的變化。

圖2 殺菌方式對即食豆干持水率的影響Fig. 2 Effect of sterilization methods on the water-holding capacity of ready-to-eat dried ried soybean curd
持水率是分析即食豆干在離心力的作用下保留水分的情況,能夠反映豆干保持水分的能力。由圖2可知,對照組鹽鹵豆干的持水率為92.94%,與對照組相比,巴氏殺菌后豆干的持水率無顯著變化(P>0.05),超高壓、熱輔助超高壓和高溫滅菌后鹽鹵豆干的持水率顯著提高(P<0.05)。豆干是一種大豆蛋白凝膠,凝膠中的少部分水與蛋白質、多糖的功能基團相結合,大部分水分(約90%)被鎖定在凝膠網狀結構中[15],大豆蛋白凝膠網狀結構影響著即食豆干的持水率[17]。不同殺菌方式處理后可能會導致大豆蛋白凝膠的微觀結構發生變化,而最終影響到即食豆干的持水率。巴氏殺菌對持水率無顯著影響,推測其對豆干凝膠微觀結構的影響較小,而超高壓、熱輔助超高壓和高溫滅菌等處理會顯著改變豆干的持水率,所以這3 種處理可能會對豆干凝膠微觀結構有較大的影響。本部分關于殺菌方式對豆干持水率影響的結果與豆干質構、色澤以及感官屬性部分的結果保持一致。
大豆異黃酮被報道具有多種生理活性,如分子結構上的酚羥基使其具有抗氧化作用,化學結構與雌激素極為相似,具有類雌激素活性,能緩解更年期綜合征[12],降低血液中膽固醇和低密度脂蛋白含量而減少心血管疾病的發病率[18-19]。此外,也有報道稱大豆異黃酮對激素相關性腫瘤(乳腺癌、結腸癌和前列腺癌)具有明顯的抑制作用[20]。然而,Fernandez-Lopez等[21]則報道稱從健康角度考慮,大豆異黃酮精確的安全攝入量還需要進一步研究。因此,大豆異黃酮是即食豆干中值得關注的生物活性成分。大豆異黃酮在豆制品中以苷元和糖苷(葡萄糖苷型、丙二?;咸烟擒招汀⒁阴;咸烟擒招停┑男问酱嬖冢ü灿?2 種單體同系物),苷元型包括大豆苷元、染料木黃酮(又稱金雀異黃酮)和黃豆黃素[22]。
通常情況下,豆干中的大豆異黃酮主要以苷元型和葡萄糖苷型的形式存在,其他形態的大豆異黃酮含量較少[23]。王春娥等[24]研究發現,豆腐加工過程中,經漿渣分離后在豆渣中損失14.85%的異黃酮,壓榨過程在黃漿水中損失67.83%的異黃酮,最后僅有17.32%的異黃酮從原料大豆中進入豆腐(約639.89 μg/g),其中大豆苷元、染料木黃酮、黃豆黃素(苷元型)和大豆苷、染料木苷、黃豆黃苷(葡萄糖苷型)6 種異黃酮的含量為558.77 μg/g,占大豆異黃酮總量的87.32%,這可能是由于在煮漿過程中熱不穩定的丙二酰基和乙?;咸烟擒招痛蠖巩慄S酮會轉化成葡萄糖苷型[22],因此,可以使用3 種苷元型和3 種葡萄糖苷型的異黃酮來分析即食豆干殺菌過程中大豆異黃酮的變化。

表6 殺菌方式對即食豆干中大豆異黃酮含量的影響Table 6 Effect of sterilization methods on iso fl avone contents of ready-to-eat dried soybean curd
由表6可知,對照組豆干中6 種大豆異黃酮的總量為1 031.8 μg/g(干基質量),與對照相比,巴氏殺菌、高溫短時殺菌和熱輔助高壓殺菌后總大豆異黃酮含量分別顯著下降至882.3、846.1、893.8 μg/g(P<0.05),但超高壓殺菌對即食豆干總大豆異黃酮含量的影響(979.3 μg/g)不顯著(P>0.05)。因此,除了超高壓處理,其他幾種滅菌方式均會導致即食豆干中總大豆異黃酮含量的下降。此外,所采用的殺菌方式均會造成苷元型總大豆異黃酮含量的降低,其中熱處理(巴氏殺菌和高溫短時滅菌)損失最大,其次是超高壓殺菌和熱輔助超高壓殺菌。
巴氏殺菌后即食豆干中的染料木苷含量由238.1 μg/g顯著增加至312.2 μg/g(P<0.05),但大豆苷元和染料木黃酮的含量分別由310.6 μg/g和300.2 μg/g顯著降低至183.7 μg/g和149.4 μg/g(P<0.05),兩種苷元型異黃酮含量的降低最終導致總大豆異黃酮含量的下降。高溫滅菌后,葡萄糖苷型異黃酮含量變化不顯著(P>0.05),大豆苷元和染料木黃酮含量分別顯著降低至86.6 μg/g和225.9 μg/g,其中大豆苷元損失較大。Grün等[18]研究熱處理(80~100 ℃、0~40 min)對石膏豆腐大豆異黃酮影響時發現,豆腐中大豆異黃酮的總量(染料木黃酮和大豆苷元系列)隨著加熱時間的延長顯著減少,溫度越高減少幅度越大,大豆苷元的損失是總大豆異黃酮含量下降的主要原因,100 ℃加熱30 min后大豆苷元損失65.5%(由48.975 mg/g降低至16.898 mg/g),本研究結果與其類似。
熱處理過程中即食豆干中的大豆異黃酮發生復雜的化學變化,苷元衍生物(葡萄糖苷、乙酰葡萄糖苷和丙二酰葡萄糖苷異黃酮)在加熱過程中也可轉化為苷元和其他衍生物類型,如丙二?;咸烟擒招徒浢擊确磻赊D化為乙?;咸擒眨:鸵阴;咸烟擒招涂赏ㄟ^脫酯化反應轉化為葡萄糖苷而導致葡萄糖苷型異黃酮含量的上升[25],葡萄糖苷型異黃酮會降解產生相應的苷元而導致苷元型異黃酮含量的上升[26],苷元型異黃酮會在加熱過程中發生降解[27]。因此,熱處理過程中葡萄糖苷型和苷元型異黃酮的降解和生成會影響其最終含量。此外,豆干殺菌過程中會損失約總質量2%的水分[7],大豆異黃酮也會溶解到水中而導致豆干中大豆異黃酮的損失[18]。
超高壓殺菌和熱輔助高壓殺菌后豆干中大豆苷元和染料木黃酮的含量顯著下降(P<0.05)。Jung等[28]研究發現超高壓(400 MPa、25 ℃、10 min)處理豆乳后,豆乳中的大豆異黃酮含量和種類與對照組(未處理)類似,無明顯變化,但是熱輔助高壓(400 MPa、75 ℃、10 min)處理豆乳后,豆乳中大豆異黃酮的組分發生變化,丙二酰葡萄糖苷異黃酮含量下降,葡萄糖苷型含量增加,并認為這可能是由于超高壓使介質水的絕熱升溫而引起的。而Toro-Funes等[29]研究發現超高壓均質(200 MPa、55 ℃)會導致豆乳中大豆異黃酮含量的升高,并認為這可能是由于高壓均質會導致大豆蛋白發生變性而釋放出與其結合的大豆異黃酮。此外,超高壓處理也會產生類似于“壓榨”的效果,而導致即食豆干水分的損失[14],損失的水分也會導致大豆異黃酮的損失。因此,超高壓和熱輔助超高壓處理引起即食豆干中大豆異黃酮含量變化的原因可能是由于高壓會引起介質“絕熱升溫”、大豆蛋白變性釋放異黃酮以及壓榨效應丟失水分。然而,有關不同殺菌方式對即食豆干中大豆異黃酮影響的機制還有待進一步研究。

表7 即食豆干不同殺菌方式的能耗對比Table 7 Comparison of energy consumption between different sterilization methods for ready-to-eat dried soybean curd
參考文獻[30-31]的計算方法,對即食豆干在不同殺菌條件下的能耗進行估算,結果見表7,高溫殺菌、巴氏殺菌、熱輔助高壓殺菌和超高壓殺菌的能耗比分別是100.00%、72.92%、45.60%和12.22%,其中400 MPa超高壓處理的能耗僅為高溫處理的12.22%,由此可見,超高壓殺菌具有非常明顯的節能優勢。此外,熱輔助超高壓處理的能耗比為45.60%,也明顯低于巴氏殺菌(72.92%)和高溫殺菌(100.00%)的能耗比,表明熱輔助高壓殺菌同樣也能在一定程度上大幅節約能耗。因此,從節約能耗方面,兩種方式的超高壓殺菌處理在即食豆干的工業化生產中均具有較大的應用前景。
在殺菌效果方面,巴氏殺菌(95 ℃、30 min)、高溫殺菌(121 ℃、15 min)、超高壓殺菌(400 MPa、25 ℃、20 min)和熱輔助超高壓殺菌(400 MPa、60 ℃、20 min)對即食豆干均具有較好的殺菌效果,殺菌后的產品的菌落總數和大腸菌總數均符合DB34/T 720.2—2009以及GB 2712—2014;在感官指標方面,巴氏殺菌對豆干的質構無顯著影響,其他殺菌方式顯著增加豆干的硬度和咀嚼性;高溫殺菌顯著降低豆干的亮度,增加豆干的紅綠度,其他殺菌方式無顯著影響;超高壓殺菌和高溫殺菌顯著降低豆干的感官評分,可見巴氏殺菌和熱輔助高壓殺菌有利于保持即食豆干感官品質;在對大豆異黃酮影響方面,巴氏殺菌、高溫殺菌和熱輔助超高壓殺菌顯著降低即食豆干中的大豆異黃酮的總含量,但熱輔助超高壓殺菌有助于減少苷元型總大豆異黃酮含量的損失。此外,對不同殺菌方式的能耗估算結果表明,采用超高壓及熱輔助超高壓處理均具有明顯的節能優勢。綜上,本研究結果可為即食豆干殺菌技術的改良提供參考。然而,有關不同殺菌方式豆干在貯藏中的品質變化以及殺菌中大豆異黃酮含量變化的機制還有待進一步研究。