近冰溫貯藏對杏果實冷害及活性氧代謝的影響

李亞玲，崔寬波，石 玲，祝兆帥，李 玲，劉 嚴，朱 璇,*

（1.新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆農業科學院農業機械化研究所，新疆 烏魯木齊 830091）

杏（Prunus armeniaca L.）為杏屬，在新疆林果業中占據重要的地位[1]。據2017年數據統計，全疆杏樹栽培總面積達12萬 公頃，產量為115萬 t，占新疆水果總產量的11.37%[2]。杏果實屬于呼吸躍變型果實，且采收季節較為集中，多為高溫季節，采后在常溫下放置會迅速后熟衰老，導致果實出現嚴重的腐爛[3]。低溫貯藏可有效抑制杏果實采后品質下降和腐爛變質，由于杏果實屬于冷敏性果實，在不適宜的低溫下貯藏，容易導致冷害的發生[4]。冷害癥狀一般是從低溫環境被轉移到溫暖的環境下才易被發現，果實受到冷害后又易被病原微生物所浸染，其貯藏品質及商品價值將會受到嚴重的影響[5]。因此，控制杏果實采后貯藏冷害的發生，尋求簡單、高效的貯藏保鮮技術己成為杏貯運產業中亟需解決的問題。

近冰溫貯藏是指將果蔬貯藏在其冰點以上、0 ℃以下溫度范圍內的一種非凍結保鮮技術[6]。當果蔬貯藏在其冰點附近時，果蔬內部細胞組織不會被破壞，且呼吸代謝作用可被降至最低限度，能最大程度地抑制果蔬的生命活動，從而維持其貯藏品質，延長貯藏期，是一種安全、綠色的保鮮技術[7-8]。研究表明，近冰溫貯藏可最大程度地延緩藍莓[9-10]、冬棗[11]、油桃[12]營養成分的損失，抑制果實采后褐變的發生，較好地保持其品質，延長貯藏期。近冰溫貯藏條件下的小白杏[13]、櫻桃[14]的腐爛率也明顯受到抑制。近冰溫貯藏還能有效提高吊干杏[15]、黃花梨[16]、西蘭花[17]、櫻桃[18]等果蔬的抗氧化能力和抗冷性，但抗冷性機理需要進一步研究。本實驗以新疆庫車小白杏為試材，研究近冰溫貯藏對采后杏果實冷害及活性氧的影響，為杏果實近冰溫貯藏保鮮技術提供理論參考和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小白杏于2018年6月27日購自新疆烏魯木齊市九鼎農貿市場，選取無損傷、色澤大小勻稱、成熟度（硬度為（8.3±0.1）kg/cm2、可溶性固形物質量分數為（13.3±0.2）%）相近的果實進行實驗。

乙二胺四乙酸、聚乙烯吡咯烷酮、鹽酸羥胺、對氨基苯磺酸、α-萘胺、冰醋酸、濃氨水、硫酸、四氯化鈦、硫代巴比妥酸、鹽酸、丙酮、氮藍四唑、三氯乙酸、無水醋酸鈉、愈創木酚等試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

SHB-III循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司；DDS-307型電導率儀 上海儀電科學儀器股份有限公司；RC-4溫度記錄儀 江蘇省精創電氣股份有限公司；FE22-Meter pH計、AL204-IC電子分析天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DZKW-S-6電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫療儀器廠；3H16RI智能高速冷凍離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司；UV-1700型紫外-可見分光光度計 上海美析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

分級挑選后的果實，放置在（5±1）℃的環境下預冷24 h。果實共分為3 組，每組重復3 次，每個重復4 kg，入庫之前用厚度為0.03 mm的聚乙烯袋進行包裝。分別放入近冰溫（－1.5～－1.0 ℃）、冷藏（1～2、4～6 ℃）下進行貯藏。以冷藏作為對照，冷藏期間每隔7 d取樣測定相關指標。

1.3.2 指標測定

1.3.2.1 杏果實冰點的測定

參照崔寬波等[13]的方法，使用RC-4溫度記錄儀，將記錄儀的金屬探頭完全刺入果實中心部位，將果實放入－18 ℃的冷凍庫中，記錄儀檢測果實內溫度波動，每10 s自動記錄一次溫度變化，待果實完全凍結后將RC-4溫度記錄儀中的數據導入計算機中，根據溫度曲線確定果實冰點溫度。

1.3.2.2 冷害指數的測定

果實冷害主要表現為表面出現水浸狀斑、凹陷、皺縮等現象。因此，以水浸狀斑、表面皺縮來界定冷害程度。參照Dong Li等[19]的方法并稍加改進，將冷害面積分為5級：0級，無冷害發生；1級，冷害發生面積5%～15%；2級，冷害發生面積在15%～25%之間；3級，冷害發生面積25%～50%；4 級，冷害面積50%～75%；5級，冷害面積不小于75%。按公式（1）計算冷害指數。

1.3.2.3 冷害發病率的測定

以單個果實表面出現冷害程度達1級以上記為發病果，統計發病果數占總果數的比例。按公式（2）計算冷害發病率。

1.3.2.4 過氧化氫酶活力的測定

過氧化氫酶（catalase，CAT）活力的測定參照曹建康等[20]的方法，采用比色法進行測定，以每分鐘每克鮮質量杏果實在240 nm波長處吸光度變化0.01為1 個CAT活力單位（U），結果以U/g表示。

1.3.2.5 H2O2含量的測定

H2O2含量參照Zhou Biyan等[21]的方法進行測定。

1.3.2.6 超氧化物歧化酶活力的測定

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力的測定采用氮藍四唑法[22]，以每分鐘每克鮮質量果蔬組織的反應體系抑制氮藍四唑光化還原反應50%時為一個SOD活力單位（U），結果以U/g表示。

1.3.2.7 超氧陰離子自由基產生速率的測定

超氧陰離子自由基（O2－·）產生速率參照Lin Yifen等[23]的方法測定。以每分鐘每克鮮質量果蔬組織產生的O2－·物質的量作為其產生速率，單位為nmol/（min·g）。

1.3.2.8 過氧化物酶活力的測定

過氧化物酶（peroxidase，POD）活力用愈創木酚氧化法[20]測定。以每克鮮質量果蔬樣品在470 nm波長處吸光度每分鐘增加1時為1 個POD活力單位（U），POD活力記為U/g。

1.3.2.9 丙二醛含量的測定

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量參照Kang Ruoyi等[24]的方法測定，單位為nmol/g，結果以鮮質量計。

1.3.2.10 細胞膜透性的測定

細胞膜透性的測定參照曹建康等[20]的方法，采用電導率法，單位用%表示。

1.4 數據處理與分析

采用SPSS 20.0軟件對數據進行統計分析，并用鄧肯氏多重比較進行差異分析，P＜0.05表示差異顯著，作圖采用Origin 8.5軟件。

2 結果與分析

2.1 杏果實冰點

圖1 杏果實冰點曲線Fig. 1 Freezing curves of apricot fruit

果實中含有可溶性糖、礦物質、有機酸等物質，使果實實際冰點溫度低于0 ℃，確定果實冰點溫度是進行近冰溫貯藏的重要基礎。由圖1可知，將果實放入冷凍庫后杏果實的溫度隨時間的延長迅速下降直至過冷點（－3.2 ℃）開始出現凍結現象，此時果實將會釋放出潛熱，使溫度迅速回升，一段時間內溫度不發生變化，此溫度為杏果實生物結冰點（－2 ℃）。而庫體溫度不穩定時，易造成果實凍害，本冷庫溫差波動在0.3 ℃以內，為防止凍害現象的發生，本實驗以－1.5～－1.0 ℃為杏果實近冰溫貯藏溫度。

2.2 近冰溫貯藏對杏果實冷害發病率的影響

圖2 不同貯藏溫度對杏果實冷害發病率的影響Fig. 2 Effects of storage temperatures on chilling injury incidence of apricot fruit

由圖2可知，近冰溫貯藏組冷害發生時間分別比4～6 ℃和1～2 ℃貯藏組推遲了21 d和7 d，并且冷害發病率也顯著低于4～6 ℃和1～2 ℃貯藏組。在冷藏期間，冷害發病率隨貯藏時間的延長不斷上升，果實表面也出現不同程度大小的凹陷和水浸斑等現象。4～6 ℃貯藏組在冷藏前期發病并不明顯，而在21 d時冷害發病率迅速上升，在49 d時冷害發病率已達到40.70%。1～2 ℃貯藏組則在28 d發生冷害，比4～6 ℃貯藏組推遲了14 d發生。冷藏第49天時，1～2 ℃貯藏組冷害發病率為31.30%，而近冰溫貯藏的杏果實冷害發病率為16.50%。比4～6 ℃和1～2 ℃貯藏組分別低59.46%和47.28%（P＜0.05）。說明近冰溫貯藏可明顯抑制杏果實冷害發病率的升高并有效推遲冷害發病時間。

2.3 近冰溫貯藏對杏果實冷害指數的影響

圖3 不同貯藏溫度對杏果實冷害指數的影響Fig. 3 Effects of storage temperatures on chilling injury index of apricot fruit

冷害是造成果實采后冷藏品質下降的重要原因之一。由圖3可知，4～6 ℃和1～2 ℃貯藏的杏果實分別在14 d和28 d時出現冷害癥狀，而近冰溫貯藏的杏果實推遲到35 d才發生冷害癥狀。冷藏期間，隨貯藏時間的延長，冷害指數不斷上升，但近冰溫貯藏下的杏果實冷害指數始終低于4～6 ℃和1～2 ℃貯藏組。冷藏第49天時，4～6 ℃和1～2 ℃貯藏的杏果實冷害指數分別為0.47和0.36，而近冰溫貯藏的杏果實為0.18，分別比4～6 ℃和1～2 ℃貯藏的果實冷害指數低61.70%和50.00%（P＜0.05）。說明近冰溫貯藏與普通冷藏相比可較好地控制杏果實冷害指數的上升。

2.4 近冰溫貯藏對杏果實冷藏期間H2O2含量的影響

圖4 不同貯藏溫度對杏果實HH2O2含量的影響Fig. 4 Effects of storage temperature on H2O2 content of apricot fruit

H2O2是植物體內活性氧的一種，當活性氧清除系統代謝不平衡時，H2O2將會大量累積攻擊膜系統使細胞膜結構受到破壞。由圖4可知，冷藏0～14 d時，近冰溫貯藏與1～2 ℃下冷藏的杏果實H2O2含量無顯著差異。冷藏21 d后，各組H2O2含量緩慢上升，但近冰溫貯藏的杏果實H2O2含量始終低于4～6 ℃和1～2 ℃貯藏組。在冷藏第49天時，4～6 ℃和1～2 ℃貯藏組杏果實的H2O2含量分別為20.62 μmol/g和15.93 μmol/g，比近冰溫貯藏組（12.86 μmol/g）分別高60.34%（P＜0.05）和23.87%（P＜0.05）。說明近冰溫貯藏可抑制H2O2含量的升高，從而降低對杏果實細胞組織的損傷。

2.5 近冰溫貯藏對杏果實冷藏期間CAT活力的影響

圖5 不同貯藏溫度對杏果實CAT活力的影響Fig. 5 Effects of storage temperature on CAT activity of apricot fruit

CAT是清除活性氧的主要酶類，可將果實體內過多累積的H2O2分解，使H2O2含量維持在較低水平，進而減輕對細胞組織的毒害。由圖5可知，在冷藏初期各組CAT活力均呈緩慢上升趨勢，但冷藏28 d后，4～6 ℃和1～2 ℃的CAT活力開始持續下降，且35 d時，4～6 ℃貯藏組比近冰溫貯藏的杏果實CAT活力低13.95%（P＜0.05），并且在整個冷藏期間近冰溫貯藏的杏果實CAT活力始終高于4～6 ℃和1～2 ℃貯藏組。冷藏第42天時，近冰溫貯藏的杏果實CAT活力分別比4～6 ℃和1～2 ℃貯藏組高1.0 倍和38.15%（P＜0.05），說明近冰溫貯藏能夠較好地延緩杏果實CAT活力的下降。

2.6 近冰溫貯藏對杏果實冷藏期間O2—·產生速率的影響

圖6 不同貯藏溫度對杏果實·產生速率的影響Fig. 6 Effects of storage temperature on · production rate of apricot fruit

2.7 近冰溫貯藏對杏果實冷藏期間SOD活力的影響

圖7 不同貯藏溫度對杏果實SOD活力的影響Fig. 7 Effects of storage temperature on SOD activity of apricot fruit

SOD是植物細胞組織中較為重要的抗氧化酶類，與POD、CAT、APX等相互協同清除活性氧，使果實采后耐貯性增強。由圖7可知，各組杏果實SOD活力均呈先上升后下降的趨勢，冷藏第28天時各組SOD活力均達到最高峰，此時近冰溫貯藏的杏果實為0.87 U/g，分別比4～6 ℃（0.74 U/g）和1～2 ℃（0.76 U/g）貯藏組杏果實的SOD活力高17.57%（P＜0.05）和14.47%（P＜0.05）。并且在冷藏期間近冰溫貯藏的杏果實SOD活力始終高于4～6 ℃和1～2 ℃貯藏組，且在冷藏結束時仍能保持較高活力。說明杏果實在近冰溫環境下貯藏可顯著提高SOD的活力。

2.8 近冰溫貯藏對杏果實冷藏期間POD活力的影響

圖8 不同貯藏溫度對杏果實POD活力的影響Fig. 8 Effects of storage temperature on POD activity of apricot fruit

POD是植物體內存在的主要氧化還原酶類，其作用是清除H2O2，減輕對細胞組織的傷害，維持細胞膜結構的穩定。由圖8可知，冷藏前期，各組杏果實POD活力逐漸上升，4～6 ℃和1～2 ℃均在14 d到達高峰，隨后緩慢下降；而近冰溫貯藏組則在21 d達到高峰，且POD的活力始終高于4～6 ℃和1～2 ℃貯藏組。在冷藏第49天時，近冰溫貯藏的杏果實POD活力為0.72 U/g，分別比4～6 ℃（0.56 U/g）和1～2 ℃（0.65 U/g）貯藏的杏果實POD活力高28.57%（P＜0.05）和10.77%%（P＜0.05）。說明近冰溫貯藏顯著延緩了POD活力的降低，使杏果實在冷藏結束時仍保持較高的POD活力。

2.9 近冰溫貯藏對杏果實冷藏期間MDA含量的影響

圖9 不同貯藏溫度對杏果實MDA含量的影響Fig. 9 Effects of storage temperature on MDA content of apricot fruit

MDA是膜脂過氧化的主要產物，影響膜的結構和擾亂正常生理代謝。由圖9可知，杏果實MDA含量在貯藏過程中呈逐漸上升趨勢。冷藏前期，近冰溫貯藏的杏果實MDA含量上升較為緩慢，在冷藏21 d后才顯著增長，而4～6 ℃和1～2 ℃貯藏組則在14 d后就持續上升。在冷藏期間，近冰溫貯藏的杏果實MDA含量始終低于4～6 ℃和1～2 ℃貯藏組。冷藏第49天時，而近冰溫貯藏的杏果實MDA含量為0.93 nmol/g，分別比4～6 ℃（1.26 nmol/g）和1～2 ℃（1.13 nmol/g）貯藏的杏果實MDA含量低26.19%（P＜0.05）和17.70%（P＜0.05）。說明近冰溫貯藏能顯著抑制杏果實冷藏期間MDA含量的增加，從而減輕對細胞膜的傷害，減少了冷害的發生。

2.1 0 近冰溫貯藏對杏果實冷藏期間細胞膜透性的影響

圖10 不同貯藏溫度對杏果實細胞膜透性的影響Fig. 10 Effects of storage temperature on membrane permeability of apricot fruit

細胞膜對植物的正常代謝及微環境的穩定有著重要的意義，細胞膜透性可反映植物遭受冷害的程度[25]。由圖10可知，在冷藏期間杏果實的細胞膜透性呈上升趨勢，但近冰溫貯藏的杏果實細胞膜透性始終低于4～6 ℃和1～2 ℃組。冷藏0～21 d期間，近冰溫貯藏和1～2 ℃貯藏的杏果實細胞膜透性增加并不明顯，21 d后，1～2 ℃貯藏的杏果實細胞膜透性緩慢上升，而近冰溫貯藏組則在28 d后細胞膜透性才呈逐漸升高，4～6 ℃冷藏的杏果實細胞膜透性在14 d后已迅速上升。在冷藏第35天和第49天時，4～6 ℃冷藏下的杏果實細胞膜透性分別為54.11%和65.00%，分別比近冰溫貯藏的杏果實細胞膜透性高26.86%（P＜0.05）和29.72%（P＜0.05）。說明近冰溫貯藏可明顯抑制膜脂過氧化對細胞膜造成的損傷，保持細胞膜的完整性，提高杏果實的耐冷性。

3 討 論

貯藏溫度是影響果實貯藏品質的重要因素之一。研究發現某些果蔬在其生物結冰點附近貯藏的效果明顯優于0 ℃以上的溫度[26]。果蔬細胞內的糖、有機酸、礦物質等溶質分子使果實實際冰點低于0 ℃，而細胞內的高分子物質以空間網狀結構存在，水分子擴散受到了極大的阻礙，使果蔬產生回避凍結現象[8]。因此，果蔬可在0 ℃以下的近冰溫范圍內貯藏，使細胞處于既不凍結也能保持活體狀態。本實驗結果表明，4～6 ℃和1～2 ℃下貯藏的杏果實分別在14 d和28 d呈現出不同大小的水浸狀斑和凹陷癥狀，而近冰溫貯藏（－1.5～－1.0 ℃）的杏果實49 d后僅出現少許果梗處皺縮，比4～6 ℃和1～2 ℃組分別推遲了21 d和7 d才發生冷害癥狀，且冷害指數和冷害發病率也明顯低于4～6 ℃和1～2 ℃組，這與Liu Bangdi等[27]在杏梅上的研究結果相似。有研究也發現，蜜桃在3～4 ℃下貯藏30 d后褐變率達到47.45%，同時發生嚴重的絮化，（0.0±0.5）℃貯藏40 d褐變嚴重并出現絮化，而近冰溫（－0.8 ℃）貯藏40 d基本未發生褐變和絮化，較好地保持了貯藏品質[28]。劉東杰[29]研究也發現近冰溫貯藏可有效降低番茄的冷害指數和減輕青椒的冷害發病率。

低溫引起植物細胞膜結構受損是造成冷害的根本原因。在低溫逆境條件下，膜脂由液晶態轉變為凝膠態，膜的結構和功能發生改變，進而引起一系列次級反應，導致冷害的發生[30]。研究表明，果蔬冷害的發生與活性氧的代謝有著密切關系[31]。O2－·、H2O2是主要的活性氧，在低溫脅迫的條件下過多累積會使膜脂過氧化進程加快，破壞細胞膜的結構及功能，從而使果蔬表現出代謝失衡及膜透性增加，引起冷害的發生[32]。而果蔬在長期的進化過程中形成了活性氧清除系統，CAT、SOD、POD是清除自由基的主要抗氧化酶類[33]。SOD、CAT和POD相互協調使活性氧維持在較低水平，以減少其對細胞膜的損傷[34]。適宜的近冰溫貯藏不僅可以抑制乙烯的產生和呼吸速率，而且果蔬在近冰溫條件下自由基清除系統仍具有較高活力，能有效地防止膜脂過氧化和MDA的積累，保護膜結構不受損傷[8,26]。

本實驗結果表明，與普通冷藏相比，在穩定的近冰溫環境下貯藏能有效地促進抗氧化酶SOD活力的增加，延緩CAT、POD活力的降低，并抑制H2O2和·的產生，說明近冰溫貯藏可誘導抗氧化酶活力，有效抑制自由基的累積。近冰溫貯藏條件下較高的抗氧化酶活力對減輕膜脂過氧化有積極的作用，能有效減緩杏果實MDA含量和膜透性的增加，維持細胞膜的穩定，從而抑制杏果實貯藏期間冷害的發生。Zhao Handong等[18]對櫻桃的研究表明近冰溫（（－0.3±0.1）℃）貯藏可顯著提高抗氧化酶SOD、CAT、POD活力，并抑制H2O2和·的產生，維持果實細胞膜的穩定，認為櫻桃的抗氧化能力與冷害癥狀的發生呈負相關。對吊干杏（－1.7～－2.5 ℃）[15]、杏梅（（－1.7±0.2） ℃）[27]、金冠蘋果（（－1.7±0.2）℃）[35]、黃花梨（－1 ℃）[16]、生菜（（－0.5±0.2）℃）[36]的研究均表明近冰溫貯藏可保持較高的抗氧化能力，抑制H2O2和·的產生，減緩細胞膜透性和MDA含量的增加。近冰溫條件下冷害的減輕是由于抗氧化酶活性的增加可有效清除過多累積的活性氧自由基，從而減輕冷脅迫下造成的損傷，基于其復雜性，后續實驗還需更進一步研究完善相關理論。

4 結 論

本研究表明，近冰溫（－1.5～－1.0 ℃）貯藏與冷藏（4～6、1～2 ℃）相比，能推遲杏果實冷害發病時間并降低冷害發病率及冷害指數，還可誘導抗氧化酶SOD、CAT、POD保持較高活力，抑制活性氧H2O2和·的生成，并顯著減緩杏果實冷藏期間膜透性和MDA含量的增加。