超高效液相色譜-質譜法檢測灘羊宰后成熟過程中風味前體物質的變化

尤麗琴，羅瑞明*，苑昱東，李子欣

（寧夏大學農學院，寧夏 銀川 750021）

羊肉是世界上較重要的動物蛋白質來源，而灘羊是寧夏優勢特色畜種，其肉質細嫩鮮美、營養豐富、風味獨特[1]。消費者大都根據風味、多汁性和嫩度評價羊肉品質，其中風味是消費者評價肉品質最常用的感官指標[2-3]。肉在加熱過程中，肉中的風味前體物質包括水溶性化合物和脂質發生一系列復雜的反應，如美拉德反應、脂類氧化、氨基酸降解和硫胺素熱解生成各種呈味物質，賦予肉以滋味和香味[4-7]。影響肉類風味宰前和宰后的因素包括動物的種類、年齡、體質量、性別、飼料和宰后肌肉的生化反應[8]。宰后胴體在成熟過程中風味前體形成的生化反應對于改善肉品質有重要作用[9]，亦有研究報道宰后成熟會影響風味前體濃度，肉中成分如糖、有機酸、肽、游離氨基酸和腺嘌呤核苷酸的含量變化顯著[10-11]。

代謝組學是分析低分子質量代謝物生物化學過程的研究，對代謝物進行定性或定量及探討代謝物在生物體生物系統中的變化[12]。食品代謝組學中幾種常用的分析方法包括核磁共振光譜、氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）和液相色譜-質譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LCMS）[13-14]。通常GC-MS用于分析小分子質量的揮發性化合物，而LC-MS用于分析小分子質量的非揮發性化合物[15]。在肉品科學中，代謝組學已被用于研究肉中的異味來源和評價食物腐敗機制[16-20]，檢測食品中機械回收肉[21]，評估牛肉成熟時間和保存期[22]，并分析和預測干腌火腿的工藝條件[15]。關于肉類風味物質變化研究報道中，主要采用GC-MS對肉中揮發性風味物質定量、定性分析，對比揮發性風味物質種類和含量[23-27]；針對肉中呈味核苷酸及其他非揮發性風味物質多采用高效液相色譜法分析[28-30]，而LC-MS技術為代謝組學分析中較成熟的技術之一，其樣本前處理較為簡單，并且檢測到的代謝物多為有機酸、氨基酸、核苷酸及某些脂類[31-32]。但目前采用LC-MS系統分析宰后成熟期間肉類風味物質變化的研究報道較少。

本研究以灘羊宰后背最長肌為研究對象，采用超高效液相色譜-質譜（ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS）法分析宰后肌肉在4 ℃成熟期間與風味物質相關的代謝物種類和相對含量的變化，通過代謝途徑的映射，進一步探討灘羊肉成熟過程中風味物質前體、中間體代謝過程及其調控機制，為灘羊肉生產中風味控制技術提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灘羊背最長肌 寧夏鹽池縣大夏牧場食品有限公司。

L-2-氯苯丙氨酸標準品 上海恒創生物科技有限公司；甲醇、甲酸、乙腈（均為色譜純） 德國CNW公司。

1.2 儀器與設備

ACQUITY超高效液相色譜、ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm） 美國Waters公司；AB Triple TOF 5600高分辨質譜 美國AB Sciex公司；XFSTPRP-24/32全自動樣品快速研磨儀上海凈信實業發展有限公司；TGL-16MS臺式高速冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

采集貯藏溫度為4 ℃，相對濕度為80%的灘羊背最長肌200 mg，封裝于滅菌冷凍管中待用。采樣周期為4 d，即采樣時間點為第0、4、8天，每組樣本做8 個平行。

1.3.2 樣品預處理

精確稱取30 mg組織樣本到1.5 mL EP管中，加入20 μL內標（L-2-氯-苯丙氨酸，0.3 mg/mL，甲醇配制），加入400 μL甲醇-水（4∶1，V/V）溶液；加入兩個小鋼珠，在-80 ℃冰箱中放置2 min后，放入研磨機中研磨（60 Hz，2 min）；冰水浴中超聲提取10 min；-20 ℃靜置30 min；4 ℃、13 000 r/min離心15 min，用注射器吸取150 μL的上清液，使用0.22 μm的有機相針孔過濾器過濾后，轉移到LC進樣小瓶，-80 ℃保存，直到進行LC-MS分析。質控樣本（quality control，QC）由所有樣本的提取液等體積混合制備而成，每個QC的體積與樣本相同。

1.3.3 代謝組學數據采集

采用UPLC-MS聯用分析，樣品質譜信號采集分別采用電噴霧離子源正負離子掃描模式。色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱溫保持在45 ℃，流速0.4 mL/min；進樣量5 μL。流動相A為水（含0.1%甲酸），B為乙腈（含0.1%甲酸）。梯度洗脫程序：0～2 min，5%～20% B；2～4 min，20%～60% B；4～11 min，60%～100% B；100% B保持2 min，然后降至5%，保持1 min，以平衡色譜柱。數據采集以全掃描模式（m/z70～1 000）與數據依賴型掃描模式結合進行。質譜條件：離子源溫度550 ℃；離子噴霧電壓4 500 V；霧化氣壓35 psi；溶劑化離子去簇電壓100 V，碰撞能量10 eV；接口加熱器溫度550 ℃。對于數據依賴型掃描模式（m/z50～1 000），碰撞能量30 eV。

1.4 數據處理

從UPLC-MS分析儀采集的信號和質譜數據導出后，對數據集預處理后得到一個由代謝物的相對峰面積、保留時間、離子模式和質荷比組成的二維數據矩陣。此矩陣被導入SIMCA 14.0軟件（瑞典Umetrics AB公司）的主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA）進行模式識別分析，篩選差異代謝物，作為灘羊肉宰后成熟的潛在特征物。根據差異代謝物的質荷比，主要通過儀器自帶的快速鑒定系統（OSI/SMMS）結合The Human Metabolome Database（http://www.hmdb.ca/）和METLIN（http://metlin.scripps.edu/）兩個數據庫鑒定差異代謝物。將差異代謝物的相對峰面積通過分析平臺（Metaboanalysti 3.0）進行層次聚類分析，從而獲得代謝物的相對含量變化趨勢。為了進一步識別和可視化成熟對肌肉代謝途徑的影響，將鑒定后的差異代謝輸入KEGG數據庫（http://www.kegg.com），選擇Ovis Aries（sheep通路）為通路路徑庫，進行代謝通路的構建和分析。

2 結果與分析

2.1 多元統計分析

將所得數據矩陣導入SIMCA 14.0軟件進行模式識別，采用非監督類的模式識別方法PCA和監督模式識別方法OPLS-DA對灘羊肉UPLC-MS代謝指紋峰組內和組間樣品進行識別。

圖 1 灘羊肉4 ℃冷藏成熟0、4 d和8 d的PCA得分、響應排序檢驗和OPLS-DA得分圖Fig. 1 PCA score plots, corresponding validation plots of OPLS-DA,and OPLS-DA score plots derived from UPLC-MS for Tan sheep meat aged for 0, 4 and 8 days 4 ℃

在PCA得分圖中，每個點代表一個獨立的樣品，圖1A顯示樣品在95%置信區間且組間分離程度良好，表明成熟時間對灘羊肉代謝存在差異。在PCA模型基礎上，采用OPLS-DA模型進一步分析成熟對灘羊肉代謝模式影響，繼而篩選差異代謝物，由圖1B可知，模型的可解釋變量（R2X）分別為0.648和0.811，模型的可預測度（Q2）分別為0.627和0.673，說明該模型能很好地解釋和預測兩組樣本之間的差異。采用7 次循環交互驗證和200 次響應排序檢驗的方法檢驗模型的質量，由圖1C可知，截距值R2分別為0.522和0.844，Q2分別為-0.325和-0.799，體現了模型的可靠性，說明基于UPLC-MS建立的OPLS-DA模型用于灘羊肉成熟期各組之間的差異是可信的。

2.2 差異代謝物篩選和鑒定

采用多維分析和單維分析相結合的辦法，篩選組間差異代謝物，篩選標準為OPLS-DA模型PC1的VIP值大于1.2、t檢驗的P值小于0.05和離子質量測量準確度值小于10×10―6）。根據OSI/SMMS軟件結合HMDB和METLIN數據庫鑒定代謝物，表1列出了灘羊肉4 ℃冷藏成熟0、4 d和8 d差異代謝物的相關信息。

表 1 灘羊肉4 ℃冷藏成熟0、4 d和8 d的差異代謝物Table 1 Differential metabolites in Tan sheep meat aged at 4 ℃ for 0, 4 and 8 days

由表1可知，灘羊肉4 ℃冷藏成熟過程中主要的代謝物種類有氨基酸類及其衍生物、有機酸類、碳水化合物及其代謝物、脂質、核酸及其衍生物和輔因子。據研究報道，肉類風味形成是由肉中天然水溶性前體物如游離氨基酸、小肽、核酸、糖類、脂質等經加熱生成[33]。肉中產生甜味的糖由尸僵后的糖酵解產生，肉中咸味來主要自于肉鹽（谷氨酸單鈉）、有機酸和呈味氨基酸，鮮味氨基酸和呈味核苷酸的含量決定了肌肉的鮮美程度，尤其谷氨酸是決定羊肉鮮味的重要物質，還具有形成肉鮮味和緩沖酸、堿等不良味道的特殊功效，對肉品的味道有重要影響[34-36]，此外，脂肪酸作為前體物，其在肌肉中的組成和含量可間接影響風味的形成[37]。在本研究中灘羊肉4 ℃冷藏成熟期間碳水化合物和有機酸類在4 d組和0 d組中差異顯著，賦予肌肉甜味和酸味特征，而成熟8 d游離氨基酸及其衍生物、脂類和核酸及其衍生物差異較顯著且含量明顯增加，使肌肉中風味特征更加豐富。生肉中風味前體物質可能潛在影響羊肉加工中風味物質的形成，因此在冷鮮羊肉加工時應控制和合理選擇最佳成熟期，以保證產品風味。

2.3 差異代謝物變化分析

圖2為UPLC-MS分析鑒定出灘羊肉冷藏成熟期間23 種差異代謝物的相對含量變化，0 d組樣品中腺苷二磷酸、DL-乳酸、D-赤蘚糖-4-磷酸、肌苷酸、戊烯二酸單酰輔酶A、DL-蘋果酸、D-核酮糖-5-磷酸、不對稱二甲基精氨酸和DL-7-羥基硬脂酸相對含量較高。成熟4 d時，樣品中N-乙?；?L-蛋氨酸、組氨精氨酸、L-苯丙氨酸、哌啶、檸檬酸、全順式-4,7,10,13,16-二十二碳五烯酸、肌苷和D-苯丙氨酸相對含量較高。而成熟第8天，大多數氨基酸及其衍生物、脂質和核酸及其衍生物相對含量較第4天時增加，其中組氨精氨酸、β-檸檬酰基-L-谷氨酸、D-苯丙氨酸、哌啶、肌苷和二十碳五烯酸相對含量顯著增加。

圖 2 灘羊肉4 ℃冷藏成熟0、4 d和8 d的差異代謝物相對含量變化趨勢Fig. 2 Concentrations of differential metabolites in Tan sheep meat aged at 4 ℃ for 0, 4 and 8 days

宰后肌肉成熟過程中主要變化是細胞死亡過程和內源性蛋白酶對結構蛋白的降解，這些變化都涉及肉類風味前體[26]。國際上已把肌苷酸（inosine monphosphate，IMP）作為衡量肉質鮮味的一項重要指標[38]，Macy等[39]指出IMP是肉味形成的必要條件，核苷酸和核苷是游離核糖和磷酸的潛在前體，其參與美拉德反應。本研究顯示IMP含量在成熟第4天時下降，表明成熟前期IMP已出現降解，成熟后期肌苷含量的增加也證明在成熟第8天時仍有足夠的IMP進一步降解，研究結果與Williamoson等[40]報道的野牛肉背最長肌4 ℃冷藏期間水和脂溶性風味前體研究結論一致。隨著成熟時間的延長，構成肌漿蛋白的肽鏈打開，由于氨肽酶的作用下多肽和蛋白質水解使灘羊肉成熟后期氨基酸及其衍生物種類和含量明顯增加，Koutsidis等[41]提到葡萄糖、果糖和甘露糖是生羊肉中的主要碳水化合物，而還原糖和氨基化合物之間的美拉德反應是熟肉中風味形成最重要的方式之一。Kim等[4]指出牛肉成熟過程中游離氨基酸總體含量的增加潛在影響熟肉風味的增強。因此，生肉中的風味前體無論是在美拉德反應中還是作為美拉德反應的前體，對煮熟的肉類風味都有貢獻。肉中脂質組成和脂肪酸的含量是影響肉和肉制品風味的因素之一，脂肪酸是蒸煮肉中揮發性風味物質重要的前體物[42]，肌內脂肪中含有大量不飽和脂肪酸，其中二十碳五烯酸可以抑制酸味和苦味，增加甜味和鮮味特征[43]，本研究中灘羊肉成熟第8天時二十碳五烯酸相對含量顯著增加。結果表明，隨著成熟時間的延長，灘羊背最長肌中核苷酸降解物、碳水化合物以及游離氨基酸等呈味物質含量隨之增加，灘羊肉4 ℃冷藏成熟第8天時風味前體物質的總體水平較高，因此宰后成熟工藝有利于灘羊肉風味的改善。

2.4 關鍵代謝通路分析

圖 3 代謝通路整合分析圖Fig. 3 Integrated metabolic pathways

將分析得到的差異代謝物映射到KEGG數據庫進行代謝途徑分析，結果顯示，在冷藏成熟過程中關鍵的代謝途徑為戊糖磷酸代謝、三羧酸循環、氨基酸合成和嘌呤代謝?；贙EGG代謝通路圖，將關鍵代謝通路和差異代謝物相互關聯，整合分析結果見圖3。

動物屠宰后肌肉處于厭氧狀態糖酵解途徑增強，ATP含量下降，導致肉中核苷酸減少和乳酸積累，此階段肉風味較差[44]。在成熟早期，由于糖原供應不足，木酮糖磷酸-3-差向異構酶和核酮糖-磷酸-3-差向異構酶活性減弱，使D-赤蘚糖-4-磷酸和D-核酮糖-5-磷酸含量降低。為維持肌肉細胞持有的生化過程，ATP在一系列腺苷酸激酶和AMP脫氨酶的作用下生成IMP，此階段肉質柔嫩多汁，風味較好[7]。在成熟后期，IMP在肌苷激酶的作用下進一步降解為肌苷。隨著成熟的延長，糖酵解所生成的丙酮酸不僅在一些輔酶的作用下，參與脂肪、蛋白質等物質的代謝，進一步生成脂肪酸和游離氨基酸，也可以進入三羧酸循環，在此蘋果酸通過蘋果酸脫氫酶轉化為草酰乙酸，檸檬酸在草酰乙酸和乙酰輔酶A的縮合下含量增加，此階段肉中呈味物質較多，肉質風味更加豐富[35]。綜上所述，整合圖中包含了關鍵代謝通路、代謝物及相關酶的關聯信息，以便理解灘羊肉成熟過程中風味前體物質變化的調控機理。

3 結 論

為系統分析成熟對灘羊肌肉代謝物及代謝通路的影響。本研究采用UPLC-MS代謝組學方法研究成熟過程對灘羊宰后背最長肌中內源性小分子物質代謝的影響，鑒定出23 種差異代謝物，包括7 種氨基酸及其衍生物、2 種碳水化合物及其代謝物、3 種有機酸類、5 種脂質類、5 種核酸及其衍生物和1 種輔因子。從不同成熟期差異代謝物種類和含量的對比分析得出，隨著成熟時間的延長，差異代謝物中風味特征物質種類和含量總體水平顯著增加，從而灘羊肉的風味特征更為豐富。代謝通路分析顯示，戊糖磷酸代謝、三羧酸循環、氨基酸合成和嘌呤代謝在灘羊宰后成熟期間風味前體物質形成中起主要調節作用。研究結果可為灘羊肉生產中風味形成控制技術提供理論指導。