原發性骨髓纖維化ASXLl基因突變的臨床意義

王彥麗 王正 閆世彬 夏景清

（臨沂市中心醫院 山東 臨沂 276000）

骨髓增殖性腫瘤（myeloproliferative neoplasms,MPN）是一組起源于骨髓多能造血干細胞克隆惡性血液系統疾病。原發性骨髓纖維化（PMF）是MPN的一個亞型，是MPN中最具侵襲性的一種克隆性疾病，其臨床特征是進行性貧血、脾大、髓外造血，伴全身癥狀，易進展為急性白血病。自2005年MPN患者高頻獲得JAK2V617F基因突變［1-3］，從此人們對MPN的發病機制有了新的認識。2013年，在JAK2V617F及 MPLW515陰性的ET及PMF患者中發現CALRexon9突變的檢出率高達 50%以上[4-5]。JAK2、MPL、CALR基因的發現使得約80%的MPN患者的發病機制有了新的生物學標志及預后指標，但不能解釋不同 MPN的顯著差異。研究顯示，幾乎所有髓系腫瘤中都有ASXLl突變檢出，并與其他基因事件共同作用參與了腫瘤的發生發展，但ASXL1在PMF中的突變情況及臨床意義尚不明確[6-7]。本文分析了41例PMF患者中ASXL1基因突變情況，并與JAK2V617F、CALR及MPL等單基因突變進行比較分析，初步探討其臨床意義。

1.資料和方法

1.1 病歷資料

選取2014年1月－2019年6月我院血液科診斷的骨髓纖維化患者41例。男23例，女18例；年齡52～75歲，中位年齡65歲。均符合2008年WHO診斷標準[8]。41例均有不同程度脾大，其中13例為巨脾。

1.2 JAK2、CALR、MPL和ASXL1基因突變檢測

用血液基因組DNA提取試劑盒（QIAamp DNA Mini Kit，生產商：QIAGEN）提取骨髓樣本中基因組DNA。CALRexon9突變檢測采用PCR法。其上游引物序列為：FAM-CTGGTCCTGGTCCTGATGT；下游引物序列為：TCTCACAGAGACATTATTTGGC。PCR擴增后產物經純化后，使用3500XL測序儀進行高分辨率毛細管凝膠電泳，實驗數據采用片段分析軟件GENEMAPPERID V4.1進行分析。MPLexon10突變檢測采用Sanger測序法。其上游引物序列為：TGACCTTGCGGGCCGAC；下游引物序列為：GATCTGGGGTCACAGAGCGA。PCR擴增后產物經純化、測序反應后使用3730XL測序儀進行高分辨率毛細管凝膠電泳，實驗數據采用DNA序列分析軟件Sequencher V4.5進行突變分析。JAK2基因V617F突變采用等位基因特異性聚合酶鏈反應(ASPCR)+熒光探針法進行定量檢測，試劑盒由上海源奇生物醫藥科技有限公司提供。ASXL1基因突變檢測采用二代測序法。ASXL1exon12經探針捕獲和建庫后，使用Illumina公司的Nextseq500測序儀進行雙端測序，測序長度為2×150bp。測序數據經生物信息學分析后，最后人工篩選和確認變異位點。

1.3 統計學處理

數據采用SPSS21.0統計軟件進行統計學分析，計數資料采用率（%）表示，進行χ2檢驗，計量資料采用（±s）表示，進行t檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2.結果

2.1 ASXL1、CALR、JAK2V617F、MPL基因突變分析

ASXLl結果：41例患者中，共有7例檢出ASXLl突變，突變率為17.1%(7/41)，ASXL1突變主要類型為：Gly646Trpfs(n=4)、Pro808Leufs(n=1)、Thr823X(n=1)、Glu768X(n=1)。ASXLl突變患者的平均年齡為56歲(52～60歲)，見表1。

Table 1.Clinical characteristics of 7 patients with ASXLl mutation

CALR基因分析結果：CALR基因突變率為19.5%(8/41)，主要突變類型包括：I型(p.L367fs*46 del52bp)5例(62.5%)、Ⅱ型(p.K385fs*47 ins5bpTTGTC)3例(37.5%)。CALR突變患者的平均年齡為57歲(53～71歲)。JAK2V617F突變的發生率為56.1%(23/41)，JAK2V617F突變患者的平均年齡為57歲(53～72歲)。MPL基因突變發生率為2.4%(1/41)，突變類型為MPLW515K。

2.2 ASXLl突變患者部分臨床特點及其與單突變、突變陰性患者的比較

41例患者中，有36（87.8%）例患者至少攜帶1個基因突變，3例(7.3%)患者同時伴有2個基因突變，為ASXLl/CALR基因突變共存(n=2)，ASXLl/JAK2V617F基因突變共存(n=1)。ASXLl突變患者外周血：白細胞(3.7±1.5)×109/L，血紅蛋白(56±7.8)g/L，血小板(89±38)×109/L。與CALR基因單突變相比，ASXLl基因突變組PMF患者有更低的血紅蛋白水平及較低的血小板計數，但在白細胞計數方面無差異。與JAK2V617F基因單突變患者相比，ASXLl突變組患者血紅蛋白水平低于JAK2V617F突變組，血小板數也低于JAK2V617F突變組。與突變均陰性組相比，ASXL1突變組血小板與血紅蛋白水平低于陰性組，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

Table 2.Clinical and laboratorial features of patients subdivided by different mutation type（±s）

Table 2.Clinical and laboratorial features of patients subdivided by different mutation type（±s）

parameter ASXL1+ CALR+ JAK2 + MPL+ Negative mutated Number of patients 7 8 23 1 5 Median age(years)56±1.9 48±2.5 54±2.7 57 55±2.9 Male/Female 4：3 5：3 12：11 1 2：3 WBC(×109/L)3.7±1.5 7.6±2.1 5.8±0.6 6.2 5.5±1.7 Hb(g/L)56±7.8 81±7.2 65±10.5 74 76±2.7 Plt(×109/L)89±38 161±31 128±29 202 159±18

3.討論

表觀遺傳調節是細胞維持其基因表達模式的重要機制，其中維持基因表達穩態的兩類重要表觀遺傳調節蛋白為polycomb家族(polycomb group，PcG)和Trithorax家族(Trithorax group，TrxG)。PcG蛋白的主要功能是保持發育過程中同源異形基因的沉默，而TrxG蛋白則負責維持基因的活化狀態。人類ASXLl基因定位于染色體20ql l，編碼由1541個氨基酸組成的核蛋白，是trxG(trithorax-group)和PRC(Polycomb-group repressor complex)的增強子，具有抑制／激活雙重特性，在包括血液細胞等多種組織中廣泛表達。ASXLl編碼的蛋白質表達于所有造血細胞，具有對轉錄的雙向激活與抑制作用。Fisher等[9]人建立了ASXL1敲除的小鼠模型。敲除后的小鼠淋系和髓系分化中都發生異常，表明ASXL1對于維持正常的造血功能是必須的。

作為表觀遺傳調節子基因，ASXLI在MPN可與JAK2V617F、TET2、RUNXl、CEBPA等基因突變共存。高通量DNA測序發現，90%以上的MPN 患者至少攜帶1個突變基因，具有多個基因突變共存者其轉化白血病的風險增加[10]。國內研究顯示，ASXLl突變在MPN發生率達36%。ASXLl突變的頻率在PMF為12%～13%，Pv/ET-MF為23%[11]，這一結果表明，PMF是具有多基因改變的疾病，多基因檢測可以為PMF生物標志的篩選及預后分層提供更多依據[12]。單變量分析中發現了ASXL1突變對PMF生存的不利影響[13]。有研究報道，ASXLl+CALR+PMF患者OS下降，但ASXLl+CALR-患者的預后最差[14]。CALR+ASXL1-中位生存期最長(平均10.4年)，CALR-ASXL1+患者最短(平均2.3年)。CALR+ASXLl+和CALR-ASXL1-患者具有相似的生存率，并被歸為中等風險類別(平均5.8年)[13]。

本組研究對41例PMF患者進行了多基因檢測。結果發現，93.5%的患者存在單基因突變，ASXLl基因總的突變發生率為17.1%，均為移碼突變、點突變或無義突變，大部分ASXLl突變與其它基因突變共存，7.3%的患者存在雙基因突變，其中雙基因突變患者中均攜帶ASXLl突變，且這一結果與既往研究基本一致[15]。在3例基因雙突變患者中，2例為ASXLl/CALR突變共存，未檢測到CALR/JAK2V617F突變共存。目前，關于ASXLl突變在PMF中的研究鮮見報道。與單CALR基因突變患者相比，本研究中ASXLl突變患者的血紅蛋白、血小板計數水平明顯降低，這提示ASXLl突變患者的紅系、巨核系受抑更為明顯，但尚需進一步擴大樣本并長期隨訪尚能明確。綜上，ASXL1基因突變是繼MPN患者中JAK2、CALR、MPL基因突變之后的又一重要生物學標志。PMF的發生可能由于一個或多個基因的共同作用結果,如JAK/STAT通路相關基因、表觀遺傳調控相關基因及剪接因子相關基因等[16]。針對PMF發病過程中起決定作用的基因，研制更多的靶向藥物，是根本改變PMF預后的關鍵。

未來隨著基因測序技術的提高發現更多的協同致病基因并進行深入的功能研究，可能會為詮釋PMF復雜的致病機制提供更多有力的理論依據，將對我們認識PMF的發病機制，預后和治療發揮重要的作用。