Komagataeibacter rhaeticus 3-15全基因組及葡萄糖脫氫酶基因缺失體的構建

李 蕭，王 淼

江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122

細菌纖維素(Bacterial Cellulose，BC)，是醋酸菌分泌合成的胞外多糖，由葡萄糖單體分子以β-1，4-糖苷鍵聚合而成的高分子聚合物，是一種天然形成的最細纖維[1，2]。與植物纖維素相比，BC具有均一性好、純度高等[3]特點，可廣泛用于醫療、影像器材、食品等眾多領域[4]。如今，合成生物學的發展使模型微生物可以用模塊化的DNA代碼進行編程，以便執行各種各樣的操作來達到目的[5]。這種方法可以通過基因調控來對BC合成進行更精細的調控。然而，關于BC生產菌株的基因信息較少，相關的基因改造幾乎沒有[6]。因此，獲取各種BC生產菌株的基因組信息至關重要。

到目前為止，幾種產BC的Gluconacetobacter和Komagataeibacter已被測序，如G.xylinusE25[7]，K.medellinensisNBRC 3288[8]，K.nataicolaRZS01[9]和GluconobacteroxydansDSM 3504。其中Gluconacetobacterxylinus(又稱Acetobacterxylinum)是最常被研究的物種之一，因為它可以從各類的碳、氮源中產生大量的BC[10-12]，對Komagataeibacter的研究較少。在本研究中，我們首先提出了K.rhaeticus315的完整基因組序列，為后續基因工程提供背景信息，后續可在代謝途徑的基礎上實現對BC生物合成的精確控制。其次，結合基因組序列，本研究對K.rhaeticus315的代謝途徑及代謝物進行分析。最后，本研究通過對K.rhaeticus315進行分子改造，將葡萄糖合成葡萄糖酸途徑中的關鍵酶-葡萄糖脫氫酶的相關基因敲除，使葡萄糖主要流向BC合成途徑，降低副產物的生成。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養基

萊蒂亞駒形桿菌(Komagataeibacterrhaeticus)3-15：本實驗室從紅茶菌中篩選并保藏。保藏號：CCTCC NO: M2016213。

種子培養基(g/L)：葡萄糖20、蛋白胨5、酵母粉5、Nacl 5，115 ℃滅菌20 min后室溫保存待用(固體培養基另加2%瓊脂)。

發酵培養基(g/L)：葡萄糖30、蛋白胨5、酵母粉5、2%(v/v)無水乙醇，115 ℃滅菌20 min后室溫保存待用。

圖1 細菌纖維素生物合成途徑

1.2 試劑與設備

用于PCR反應的2×PrimeSTAR Max DNA高保真聚合酶、2×Taq低保真聚合酶均購買于寶生生物有限公司(大連，中國)；Ezup柱式細菌基因組小量提取試劑盒、卡那青霉素(Km)以及瓊脂糖均購于上海生工；標準樣品葡萄糖酸(GA)和乙酸購自Sigma-Aldrich有限公司(美國)；Tryptone、Yeast Extract夠買自Oxoid公司(美國)；Gold view、DNA Marker購自廣州東盛生物科技有限公司(廣州，中國)；其他所需試劑均為國產級分析純試劑。

PCR儀：美國Bio-Rad公司；DYY-60D 型核酸電泳儀：北京六一電泳儀廠；Gel Doc 凝膠成像系統：美國Bio-Rad公司；蛋白核酸定量測定儀：美國Thermo scientific公司；高效液相安捷倫1260色譜儀：美國Agilent公司；高速低溫離心機：德國Eppendorf公司；恒溫搖床：上海躍進醫療器械廠；ZXSD-B1160生化培養箱，上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1DNA提取及序列分析

將菌體在種子培養基里活化完成后，取培養液5 mL，用試劑盒提取DNA，電泳檢測合格后，構建測序文庫。取100 ng全基因組DNA，使用超聲波破碎儀將其隨機打斷成小于500 bp的片段，然后進行末端修復，兩端加測序接頭，最后用P5和P7引物擴增純化后目的片段。使用Agilent 2100生物分析儀檢測文庫質量，并且檢測文庫濃度，用檢驗合格的文庫進行cluster制備和測序。取5 μg～10 μg高質量的基因組DNA，隨機打斷成10 kb左右的片段(根據基因組大小選擇20 kb文庫)，隨后用DNA Template Prep試劑盒構建SMRTbell文庫。結合測序引物和聚合酶，以自由擴散的方式加入到PacBio Sequel平臺的測序芯片中，準備測序。最后，對于質檢合格的文庫，根據項目數據量要求進行上機測序。

1.3.2基因組組裝與注釋

首先，基于第三代測序數據，使用HGAP4或Falcon軟件獲得初步裝配結果。然后，將經過質量篩選的第二代測序數據與裝配結果進行對比，通過軟件Pilon對裝配結果進行進一步校正，得到最終的裝配結果。

基因功能注釋主要的方法來預測基因編碼蛋白序列與數據庫包含蛋白質序列比對，如果某一個基因的蛋白質序列和蛋白質序列數據庫中具有顯著的序列相似性，可以推斷出，基因和蛋白質數據庫中相同或相似的功能。根據編碼基因的預測蛋白序列，使用BLAST等比對軟件與數據庫中的蛋白序列進行比對。序列比對值設置為1e-5，序列比對長度不小于蛋白質長度的60%。選擇最優匹配結果作為該基因的注釋結果。

1.3.3葡萄糖脫氫酶基因的敲除

(1) 感受態的制作

①將-80 ℃保存的醋酸桿菌K.rhaeticus315進行平板劃線，待長出單菌落后，挑取單菌落至3 mL種子培養基中過夜培養。

②取0.5 mL活化液接種至50 mL 種子培養基中，培養至OD600=0.5～0.6時，即達到制備感受態的要求。

③將培養液轉入無菌離心管中，冰浴10 min～15 min，于4 ℃，4 500×g離心10 min收集菌體。

④棄上清液，用1 mL預冷的0.1 mol/L氯化鈣溶液輕輕重懸菌體，于4 ℃，4 500×g離心10 min，棄上清。

⑤用1 mL預冷的超純水重懸菌體，于4 ℃，4 500×g離心10 min，棄上清。此步驟重復兩次。

⑥用1 mL 10%甘油重懸菌體，于4 ℃，4 500×g離心10 min，棄上清。

⑦按每管60 μL分裝至冰上預冷的1.5 mL無菌離心管中可直接使用或凍存于-80 ℃。

(2) 電脈沖轉化法

①將電脈沖杯從75%無水乙醇中取出，吹干，置于冰上預冷。

②從-80 ℃冰箱中取出感受態細胞，置于冰上融化后，加入10 μL片段。

③打開電脈沖儀，設置好參數(電壓為2 kV)，將混有片段的感受態細胞加入到預冷的電脈沖杯里。

④將電脈沖杯放入電脈沖儀中，按下“開始”按鈕，當聽到“叮”的一聲后，立即取出電脈沖杯并迅速加入1 mL種子培養基，混勻。

⑤在30 ℃下緩慢振蕩培養2 h，取100 μL涂布到卡那抗性平板上，30 ℃倒置培養。

(3)gcd基因的構建與克隆

根據gcd基因序列及km基因序列設計PCR引物，如表1所示。分別擴增出gcd基因的上臂、km片段、下臂并將其連接起來，采用電脈沖法對K.rhaeticus315感受態進行轉化后用驗證引物驗證是否轉化成功。

(4)gcd-重組菌株的發酵

將轉化成功的菌株進行發酵，30 ℃下靜置培養4 d，測BC干重及葡萄糖酸濃度。

1.4 分析方法

1.4.1BC干重的測定[13]

表1 PCR引物序列

取發酵后的培養液，經紗布過濾，將過濾后的BC用清水沖洗然后浸泡到1.5%(w/v)NaOH溶液中，80 ℃水浴2 h，用去離子水沖洗至pH中性，放入稱量皿中，于105 ℃烘箱中烘干至恒重，稱量，得BC的干重。

1.4.2殘糖含量的測定

使用生物傳感分析儀對發酵液中的葡萄糖濃度進行測定。

1.4.3葡萄糖酸、乙酸的測定

葡萄糖酸、醋酸的測定采用HPLC方法[14]。

樣品前處理：培養液離心后過0.22 μm水膜過濾，待測。色譜條件：高效液相色譜Agilent 1 260，檢測器為DAD，色譜柱：SB-AQ。流動相：0.025 mol/L磷酸二氫鉀溶液，pH 2.5。流速：0.5 mL/min。檢測器波長：210 nm，柱溫：30 ℃，進樣量：10 μL。

1.5 數據處理分析

采用Origin 2016進行數據分析，結果用均值±標準偏差來表示。

2 結果與討論

2.1 K.rhaeticus 315全基因組測序

K.rhaeticus315是新篩選的一株BC生產能力較強的菌株，為了最大程度的發揮BC生產菌株的生產能力，了解與BC合成相關的基因，本研究對K.rhaeticus315的全基因組進行了測序注釋。如表2所示，K.rhaeticus315的基因信息被組裝成一條序列，總長度為3.70 Mbp，平均覆蓋率為470X，GC含量63.98%。預測編碼DNA序列(CDS)數為3 314條。K.rhaeticus315基因組完整圈圖如圖2所示。

表2 K.rhaeticus 315基因組功能

圖3是菌株的蛋白質功能圖。在K.rhaeticus315基因組中，包含25個轉運蛋白基因、9個同工基因和37個透性酶基因。他們主要負責運輸糖、糖酸、氨基酸、磷酸鹽、金屬離子和脂多糖等。K.rhaeticus315可以利用多種碳源去合成BC，最常見的為葡萄糖。一般情況下，葡萄糖會通過EMP途徑代謝。由于K.rhaeticus315基因組中缺乏編碼磷酸果糖激酶的基因(PFK；EC 2.7.1.11)，所以該菌株不能通過完整的EMP途徑去代謝葡萄糖供能。這與類似菌株的研究結果一致[15，16]。此外，BC合成過程中另外兩個關鍵酶是葡萄糖激酶(glk)和丙酮酸激酶(pyk)均存在于K.rhaeticus315基因組中，它們的編碼基因座標記為WP_019084814.1和WP_110095141.1。

圖2 K.rhaeticus 315基因組圈圖

圖3 蛋白質功能的同源群(COG)分類

戊糖磷酸途徑(PPP)是K.rhaeticus315中另一種有效的葡萄糖代謝途徑，在K.rhaeticus315基因組存在編碼PPP途徑中的關鍵酶基因：葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的編碼基因是gcd(WP_110094965.1和WP_003620475.1)，6-磷酸葡糖酸內酯酶的編碼基因是pgl(WP_110094851.1)，6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶的編碼基因是pgd(WP_110094848.1)，核糖磷酸3-表異構酶的編碼基因是rpe(WP_110912266.1)，轉酮醇酶的編碼基因是tktA，tktB(K00615)。有編碼三羧酸循環(TCA)中三個關鍵酶的基因：檸檬酸合酶(K01647)，異檸檬酸脫氫酶(K00031，K00030)，2-氧戊二酸脫氫酶(K00164，K00658)。所以K.rhaeticus315可以通過PPP和TCA途徑進行代謝來維持菌體生長和BC合成。

2.2 代謝產物分析

據報道，碳源是影響BC產量和結構差異的主要因素之一[17]。本研究發現K.rhaeticus315可以較好的利用葡萄糖、甘油和甘露醇，且三種碳源所合成的BC產量相似(圖4a)。菌株對果糖的利用不好，從基因組中分析，由于不存在編碼果糖激酶的基因(frk)，所以果糖無法被轉化為果糖-6-磷酸以及6-磷酸-葡萄糖。K.rhaeticus315對于雙糖的利用也不佳，主要是因為K.rhaeticus315基因組中缺乏編碼蔗糖酶、麥芽糖酶等雙糖酶的基因。由于該菌株不具備EMP途徑，菌體主要通過PPP途徑和TCA途徑來代謝碳源。此時碳源流向三個途徑：菌體生長代謝、合成BC、合成酸類副產物。從圖4b可以看出，發酵20 d后，耗糖量為36.73 g/L，BC產量為12.81 g/L，葡萄糖酸生成量為32.25 g/L。進一步說明菌體在合成BC時，有大量的葡萄糖酸副產物生成[18]，造成碳源的浪費。并且，大量的酸會降低發酵液的pH，對菌體生長不利[19]。因此，對菌體進行改造，減少副產物的生成對提高BC產量至關重要。

2.3 K.rhaeticus 315葡萄糖脫氫酶基因缺失體的構建

葡萄糖酸(GA)是葡萄糖在葡萄糖脫氫酶(gcd，WP_110094965.1和WP_003620475.1)的作用下產生的。為了減少GA的生成，使葡萄糖代謝流向BC合成途徑，本研究通過敲除GA合成關鍵酶的基因，來減少副產物GA的生成。首先選擇敲除gcd(WP_003620475.1)這一基因，構建gcd-重組菌株。

2.3.1片段融合

首先利用PCR分別擴增gcd基因(WP_003620475.1)的左臂、右臂以及Km基因。如圖5a所示，電泳條帶顯示三段基因全都擴增成功，條帶大小為900 bp。再將已擴增完成的三段基因融合。圖5b說明三段基因連接成功，融合片段大小為2 500 bp。

2.3.2同源重組

采用電脈沖法，將2.3.1融合成功的片段轉入K.rhaeticus315感受態中進行同源重組。利用卡那霉素抗生標記篩選目的菌株gcd-重組株，并用驗證引物(表1)進行驗證，驗證片段的大小為1 000 bp左右。如圖6所示，片段轉化成功，即gcd-重組菌株構建成功。

2.3.3gcd-重組菌株的發酵

將未電轉的原始菌株與gcd-重組菌株靜置發酵4 d，觀察BC干重及GA生成量。如表3所示，gcd-重組菌株的GA生成量顯著下降，比原始菌株降低了7.93 g/L，降低了77%。但BC干重無明顯提高，推測是單純敲除一個gcd基因在有限的發酵時間內體現不出其節約BC合成前體—葡萄糖的優勢；另一方面基因的敲除可能會影響菌體的其他代謝功能。

M: DNA marker；Y: 驗證片段圖6 驗證片段瓊脂糖凝膠電泳圖

表3 gcd基因敲除后對發酵的影響

3 結論

本研究對新篩選的BC生產菌株K.rhaeticus315進行了全基因組測序及簡單分析。通過基因信息及代謝途徑分析，K.rhaeticus315是通過PPP和TCA途徑來代謝碳源，維持菌體生長和代謝。當葡萄糖作為碳源時，菌體會產生大量的葡萄糖酸，造成葡萄糖的浪費。因此，通過全基因組序列找到葡萄糖合成葡萄糖酸途徑中的關鍵基因gcd，對該基因進行敲除，可使葡萄糖酸降低了77%。本研究僅對K.rhaeticus315做了簡單分析和改造，后續可利用該基因組信息進行進一步的分析和操作。