長雙歧桿菌DD98凍干保護劑優化及菌粉保存穩定性研究

王 桃，紀 瑞，劉海燕，李忠磊，陳代杰,3*，譚 俊*

1. 上海師范大學 生命科學學院， 上海 200234； 2. 上海醫藥工業研究院， 上海 201203；3. 上海交通大學 藥學院， 上海 200240

雙歧桿菌是一類嚴格厭氧的革蘭氏陽性桿菌[1]，是人體腸道內重要的益生菌群，在成年人的腸道中約占腸道總菌數的3%～10%，而在嬰兒的腸道占到91%以上[2]，是腸黏膜屏障中生物屏障的主要成分，在機體的免疫調節、抗腫瘤、降血脂等方面都發揮著重要的作用，其益生作用已得到社會的公認[3]。

隨著年齡的增長，人體腸道內致病菌數量逐漸增加，益生菌數量逐漸減少，其中雙歧桿菌的數量減少最為明顯，從而引起腸道內微生態平衡的破壞，導致疾病發生，研究證實，可通過口服含有一定數量雙歧桿菌的活菌制劑來調節腸道菌群的平衡[4]。美國FDA推薦食品中活性雙歧桿菌的添加量最低限為1.0×106CFU/g[5]，也就是說雙歧桿菌必須是“足量的”、“有活性的”才能發揮作用，然而雙歧桿菌制品普遍存在著不能常溫保存、保質期短等缺陷[6]，使其作用發揮和應用受限，因此，雙歧桿菌活菌制劑的制備及儲存穩定性研究十分重要。

提高雙歧桿菌穩定性的常用技術主要有代謝調控技術、真空冷凍干燥技術和微膠囊技術[7]。本文主要采用真空冷凍干燥技術來制備雙歧桿菌活菌制劑。與冷凍產品以及液態雙歧桿菌制劑相比，凍干菌粉易于處理并且活菌保存期較長[8-10]，但在凍干的過程中，細菌會因滲透休克、形成胞內冰晶和再結晶而造成細胞膜損傷[11]，導致細菌的凍干存活率降低，因此需要利用凍干保護劑來減少菌體的活性損失。通常選用的凍干保護劑為可溶性物質[12]，如海藻糖、蔗糖、脫脂奶粉等。本文以長雙歧桿菌DD98為研究對象，通過對凍干保護劑配方的優化，提高凍干菌粉的活菌數；通過菌粉的保存穩定性考察，進一步證實該保護劑配方不僅適用于4 ℃低溫保藏24個月，還可在室溫25 ℃保藏至少12個月，活菌數都能達到美國FDA推薦食品中活性雙歧桿菌的添加量最低限1.0×106CFU/g的標準。常溫保存不僅具有大大降低運輸成本的優勢，還更加適合胃腸道不適的人群直接飲用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種

長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)DD98，本實驗室專利菌株。

1.1.2培養基

BBL固體培養基：蛋白胨15 g，葡萄糖20 g，氯化鈉5 g，酵母浸粉2 g，番茄浸粉5 g，可溶性淀粉0.5 g，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g，肝浸粉2 g，吐溫801 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0±0.1，115 ℃滅菌20 min。

RCM(改良)培養基：蛋白胨FP103 17 g，酵母浸粉FM405 16 g，葡萄糖(一水)22 g，氯化鈉5 g，無水乙酸鈉3 g，L-半胱氨酸鹽酸鹽(一水)0.55 g，低聚果糖4 g，純化水1 000 mL，pH 6.8±0.1，121 ℃滅菌20 min。

RCM(改良)種子培養基：蛋白胨FP103 3 g，酵母浸粉FM405 12.5 g，葡萄糖(一水)6 g，氯化鈉5 g，無水乙酸鈉3 g，L-半胱氨酸鹽酸鹽(一水)0.55 g，純化水1 000 mL，pH 6.8±0.1，121 ℃滅菌20 min。

茄子瓶斜面培養基：在RCM種子培養基中加入2.5%(w/v)的瓊脂。

1.1.3保護劑

海藻糖，來源于日本林原；葡萄糖，來源于西王藥業有限公司；水蘇糖，來源于江蘇恒惠食品有限公司；蔗糖，來源于國藥集團化學試劑有限公司；乳糖，來源于河南興源化工產品有限公司；甘露醇，來源于河南興源化工產品有限公司；乳果糖，河南興源化工產品有限公司；脫脂奶粉，來源于新西蘭乳品(中國)有限公司；Vc-Na，來源于石藥集團維生藥業；谷氨酸鈉，來源于加加食品集團股份有限公司；L-半胱氨酸鹽酸鹽，來源于河南盛之德商貿有限公司。將所有的試劑按要求配制溶解后的溶液115 ℃滅菌15 min冷卻后備用。

1.1.4儀器

超低溫冰箱FermoTM900，美國Thermo Scientific；超凈工作臺ZHJH-C1112B，上海智城分析儀器公司；立式高壓滅菌鍋LDZX-75KBS，上海申安醫療器械廠；7 L發酵罐7GB，上海保興生物設備工程有限公司。酶標儀Multiskan Go，美國Thermo Scientific；冷凍干燥機LGJ-22D，北京四環科學儀器廠有限公司；恒溫恒濕箱ICH2，德國美墨爾特。

1.2 方法

1.2.1雙歧桿菌DD98菌粉制備

雙歧桿菌DD98菌粉的制備采用二級發酵，具體流程如圖1。

圖1 雙歧桿菌DD98菌粉制備流程圖

將本實驗室保存在-80 ℃超低溫冰箱中的DD98菌株甘油管取出，放置37 ℃水浴鍋中使其快速融化后，取200 μL接入茄子瓶斜面中，用接種鏟將菌液涂勻后置于厭氧培養箱中37 ℃連續培養24 h，然后將茄子瓶斜面的菌苔刮出，轉移到300 mL液體培養基中，搖勻后置于37 ℃厭氧培養箱中培養12 h，然后將300 mL種子液轉接到7 L發酵罐進行38℃厭氧培養，接種前培養基的pH調至6.5。待菌生長成熟后放罐，收集菌液用離心機進行離心，9 900 r/min，離心5 min。將離心后的菌泥加入凍干保護劑，充分混合均勻，用冷凍干燥機凍干，獲得菌粉。

1.2.2菌株生長曲線的繪制

將長雙歧桿菌DD98接新鮮斜面，于厭氧培養箱37 ℃培養24 h，將斜面洗下至100 mL發酵培養基中，靜置在厭氧培養箱中，37 ℃培養，每隔一定時間取樣，酶標儀檢測OD600nm值，繪制生長曲線。

1.2.3凍干保護劑的篩選

脫脂奶粉添加量的篩選：分別稱取脫脂奶粉0 g、2.5 g、5 g、7.5 g和10 g置于100 mL燒杯中，加入20 mL去離子水，用玻璃棒充分攪拌溶解后，在 50 mL容量瓶中進行定容，分別配制成0%、5%、10%、15%和20%的脫脂奶粉溶液。115 ℃滅菌15 min，然后將其與菌泥質量比1∶1混勻進行凍干，計算凍干存活率。

糖類保護劑的篩選：在確定了脫脂奶粉百分含量的基礎上，分別稱取葡萄糖、水蘇糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、甘露醇、乳果糖配成10%的溶液，115 ℃滅菌15 min。然后將其與菌泥質量比1∶1混勻進行凍干，計算凍干存活率。篩選出糖類保護劑之后，再對其添加量進行篩選，方法與脫脂奶粉添加量的篩選方法一致。

抗氧化劑的篩選：在確定了脫脂奶粉百分含量和糖類保護劑的基礎上，分別稱取Vc-Na、谷氨酸鈉、L-半胱氨酸鹽酸鹽配成1%的溶液，115 ℃滅菌15 min。然后將其與菌泥質量比1∶1混勻進行凍干，計算凍干存活率。篩選出抗氧化劑之后，再對其添加量進行篩選，方法與脫脂奶粉添加量的篩選方法一致。

1.2.4保護劑與菌泥混合質量比優化

將菌泥與優化后的保護劑分別按照1∶0.3、1∶0.6、1∶0.9、1∶1、1∶1.5的比例混合，充分混合均勻后，放在冷凍干燥機中進行凍干，計算凍干存活率，選出最優的質量添加比。

1.2.5冷凍干燥

凍干工藝為：第一階段：-40 ℃，4 h預凍結束后抽真空；第二階段：5 ℃，10 h；第三階段：15 ℃，10 h，真空度為10 Pa，厚度約為0.5 cm。凍干結束后，取出凍干菌粉通過平板計數法進行準確計數，計算凍干存活率。

1.2.6菌粉保存穩定性

將加入凍干保護劑冷凍干燥后制得的菌粉每包稱取5 g充氮氣進行密封包裝，然后將其隨機分成2組放在4 ℃、25 ℃恒溫恒濕箱中保存，分別在7 d、15 d、30 d、60 d、120 d、180 d、360 d、540 d和720 d取樣測定活菌數，計算存活率。

1.2.7存活率的測定

樣品放在4 ℃、25 ℃保存，分別在7 d、15 d、30 d、60 d、120 d、180 d、360 d、540 d和720 d取出樣品依次梯度稀釋到10-9，涂BBL培養基，放在厭氧箱中37 ℃培養48 h后計數，每個樣品做三個平行。

存活率=V2/V1×100%

V1為保存/凍干前的總活菌數；V2為保存/凍干后的總活菌數。

2 結果與分析

2.1 雙歧桿菌DD98的生長曲線

長雙歧桿菌DD98在搖瓶中的生長曲線如圖2所示，菌株在0 h～4 h處于延遲期，4 h后快速生長，進入對數生長期。12 h達到穩定期，此時菌體的數量最多，菌體的特性也較穩定，可選擇此時將菌液轉接到7 L發酵罐中，進行二級發酵。

圖2 搖瓶生長曲線

長雙歧桿菌DD98在7 L罐發酵的生長曲線如圖3所示，在0 h～4 h處于延遲期，4 h后進入對數生長期。10 h達到穩定期，此時菌體的數量最多，菌體的特性也較穩定，可收集此時的菌體進行后續的凍干保護劑篩選實驗。

圖3 7 L罐生長曲線

2.2 凍干保護劑的優化

微生物在凍干的過程中會因為細胞膜損傷而造成細菌死亡，活菌數下降。為了減少細菌的死亡，提高凍干菌粉的活菌數，就需要在微生物凍干時添加凍干保護劑。不同的微生物凍干所需要的最佳保護劑是不同的[13]，但主要都是脫脂奶粉、糖類保護劑、抗氧化劑這三種成分，所以針對這三種保護劑成分進行篩選。

首先對脫脂奶粉的添加量進行篩選，其篩選結果如圖4。從圖4可以看出，當脫脂奶粉的添加量超過10%以上時，凍干存活率不再增加。脫脂奶粉的添加量為10%時，凍干存活率最高為35.7%，且與不加保護劑直接凍干的菌粉相比，其凍干存活率提高了10.7倍。

圖4 脫脂奶粉添加量篩選結果

在10%的脫脂奶粉的基礎上，對糖類保護劑進行篩選。參考動物雙歧桿菌和乳酸桿菌的保護劑成分[3]，各種糖分別配制成10%的溶液，其篩選結果如圖5。從圖5可以看出，采用海藻糖作為保護劑的凍干菌粉的凍干存活率最高，凍干存活率為48.1%，相比單純的10%脫脂奶粉，凍干存活率提高了12.4%。因此進一步對海藻糖的添加比例進行篩選，篩選結果如圖6。從圖6可以看出，海藻糖的添加量為25%時，保護效果最好，但在實際操作中25%的海藻糖相對難分散，濃度過高，流動性差，考慮到后續用凍干機進行凍干的可操作性，選擇20%作為海藻糖的最優添加比例。

圖5 糖類保護劑的篩選

圖6 海藻糖添加量篩選結果

參考動物雙歧桿菌和乳酸桿菌的保護劑成分[3]，各抗氧化劑成分分別配制成1%濃度。在10%脫脂奶粉和20%海藻糖的基礎上對抗氧化劑進行篩選，其篩選結果如圖7。由圖7可知，Vc-Na對雙歧桿菌的凍干保護效果最好，因此進一步對Vc-Na的添加比例進行了篩選，其結果如圖8。Vc-Na的添加比例在2%～4%之間對雙歧桿菌的保護效果幾乎不存在差異，因此考慮成本等問題，選擇2%的Vc-Na作為最優的添加量。

圖7 抗氧化劑的篩選

通過實驗凍干保護劑優化后的配方為脫脂奶粉10%、海藻糖20%、Vc-Na 2%、純化水68%。保護劑與菌泥的質量添加比為1∶1。凍干前稱取28 g菌泥測定其總活菌數為1.64×1012CFU，采用優化后的配方對28 g菌泥進行凍干，凍干后的菌粉總活菌數為1.4×1012CFU，其凍干存活率在85%以上，凍干菌粉活菌數為5.0×1010CFU/g。

圖8 Vc-Na添加量篩選結果

2.3 保護劑與菌泥混合質量的最優比例

保護劑添加量對菌體的保護作用是有影響的。因此要通過實驗選出最優的保護劑添加比例，從而最大效果的保護菌體，增加凍干菌粉的活菌數，實驗結果如圖9。通過圖9可知，菌泥與保護劑比例為1∶0.3時，由于保護劑的添加量較少，對于菌體的保護作用較差。而菌泥與保護劑的比例為1∶0.6、1∶0.9、1∶1、1∶1.5時，對菌體的保護作用都較好。但菌泥與保護劑的比例為1∶0.6時，保護劑對菌體的保護作用最好，凍干存活率為90.3%，凍干菌粉的活菌數為5.3×1010CFU/g。因此，在后續的菌體凍干過程中，菌泥與凍干保護劑的質量比都為1∶0.6，以最大限度地提高菌粉的凍干存活率。

圖9 保護劑與菌泥混合質量比優化

2.4 菌粉的保存穩定性研究

與冷凍產品和液態雙歧桿菌制劑相比，長雙歧桿菌DD98凍干菌粉的保存條件和保存時間都具有明顯的優勢，但隨著保存時間的延長，活菌數會隨著時間的推移而降低。FAO/WHO建議食品益生菌活菌數應在(1.0×106～1.0×107)CFU/g以上，當雙歧桿菌DD98凍干菌粉的活菌數低于此標準時，就失去了其益生作用，所以有必要考察雙歧桿菌DD98凍干菌粉的保存穩定性。

恒溫加速試驗對于普通食品而言，是一種快捷有效的保質期評價方法[14]，但是對于雙歧桿菌DD98凍干粉這種對溫度、濕度、氧氣等外界因素非常敏感的活性益生菌產品而言[15]，很明顯是不適用的。針對活性益生菌產品評價其保質期，通常選用的方法是活性益生菌產品在哪種條件下貯存和售賣，就在哪種條件下觀察產品的穩定性。根據長雙歧桿菌DD98凍干菌粉的生產和保存條件，選擇在4 ℃和25 ℃條件下，考察其凍干菌粉的保存穩定性，所用的實驗材料為活菌數為5.3×1010CFU/g的菌粉。其研究結果如表1。

表1 儲藏溫度對菌粉中雙歧桿菌DD98存活率的影響

由表1可知，凍干的雙歧桿菌菌粉在4 ℃保存24個月后，活菌數仍在1.0×108CFU/g以上，在25 ℃保存下的穩定性雖不如4℃保存，但可以保存12個月，雙歧桿菌的存活率仍在1.0×106CFU/g以上，符合FAO/WHO建議食品益生菌活菌數應在(1.0×106～1.0×107)CFU/g的標準。可見，該優化后的保護劑配方，非常有利于長雙歧桿菌DD98凍干菌粉的保存。

3 結論

隨著人們對健康程度的重視，益生菌產品越來越受到人類的青睞，然而，益生菌產品的優劣與其制備過程中的各個環節，比如優勢菌種的篩選，發酵過程，凍干過程，保存方法等息息相關，每一環節都要盡量減少活菌數的損失。本文主要針對益生菌活菌制劑的凍干及保存環節，以長雙歧桿菌DD98為研究對象，優化凍干保護劑配方，提高凍干菌粉的活菌數，通過菌粉的保存穩定性考察，證實該保護劑配方不僅大幅度提高了菌體的凍干存活率，還可使凍干菌粉在4 ℃低溫保藏24個月，在室溫25 ℃可保藏12個月，活菌數都能達到美國FDA推薦食品中活性雙歧桿菌的添加量最低限1.0×106CFU/g的標準，為雙歧桿菌DD98菌粉工業化生產提供了參考依據。