竹節(jié)參中皂苷含量測(cè)定方法的建立

徐怡 張曉南 蘇鈦 冉遠(yuǎn)克 游燕

摘要：目的 建立高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定竹節(jié)參中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa含量的方法。方法：色譜柱：Waters Symmetry C18 柱（5 μm，4.6×250 mm）;流動(dòng)相：乙腈-0.2%磷酸溶液;流速：1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm。結(jié)果 人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa的線性范圍分別為0.01753ug-1.7531ug（r=1）、0.01754ug-1.7541ug（r=1）、0.04917ug-4.917ug（r=1）、0.0248751ug-0.99486ug（r=1），平均回收率分別為94.68%（RSD=2.45%）、94.71%（RSD=2.82%）、97.92%（RSD=2.08%）、94.80%（RSD=2.41%）。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便可行，重復(fù)性好，可用于測(cè)定竹節(jié)參中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Ro;竹節(jié)參皂苷Ⅳa的含量，為進(jìn)一步提高竹節(jié)參的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法;竹節(jié)參;竹節(jié)參皂苷;含量測(cè)定。

中圖分類號(hào)：R927.2 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ??文章編號(hào)：1007-2349（2020）01-0067-05

【Abstract】Objective： To establish a method for the determination of ginsenoside Rg1， ginsenoside Re， ginsenoside Ro， and ginsenoside IVa in Panax japonicas by HPLC. Methods： Chromatographic column was Waters Symmetry C18 column （5 μm， 4.6 × 250 mm）， mobile phase was acetonitrile-0.2% phosphoric acid solution， flow rate was 1.0 mL/min and detection wavelength was 203 nm. Results： The linear ranges of ginsenoside Rg1， ginsenoside Re， ginsenoside Ro， and Panax japonicas ginsenoside IVa were 0.01753ug-1.7531ug （r=1）， 0.01754ug-1.7541ug （r=1）， 0.04917ug-4.917. ug （r=1） and 0.0248751ug-0.99486ug （r=1） respectively. The average recovery rates were 94.68% （RSD=2.45%）， 94.71% （RSD=2.82%）， 97.92% （RSD =2.08%） and 94.80% （RSD=2.41%） respectively. Conclusion： The method is simple， feasible and reproducible and can be used to determine the content of ginsenoside Rg1， ginsenoside Re and ginsenoside Ro in Panax japonicas. The content of saponin Iva in Panax japonicas provides a basis for further improvement of the quality control of Panax japonicas.

【Key words】HPLC， Panax japonicas， Panax japonicas saponin， content determination.

竹節(jié)參收載于1975年及以后歷版《中華人民共和國(guó)藥典》，但迄今為止尚未建立含量測(cè)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。竹節(jié)參為五加科植物竹節(jié)參（Panax japonicus C·A.Mey）的干燥根莖，以根狀莖和肉質(zhì)根入藥，秋季采挖，除去主根及外皮，干燥，其根狀莖稱“竹節(jié)參”，塊根稱“明七”或“白三七”，葉稱“七葉子”。主產(chǎn)于云南、貴州、四川、湖北等省，具有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、止血祛痰、消腫鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、抗心肌缺血及降血糖等功效。

筆者參考《中國(guó)藥典》以及相關(guān)文獻(xiàn)中對(duì)竹節(jié)參皂苷成分的研究[1～6]，建立了以人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa的方法學(xué)研究，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)竹節(jié)參中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa的含量進(jìn)行測(cè)定，為評(píng)價(jià)竹節(jié)參質(zhì)量及進(jìn)一步研究提供一定依據(jù)，具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試藥

1.1.1 儀器 美國(guó)Waters e2695高效液相色譜儀;美國(guó)Agilent 1260高效液相色譜儀;SK8200HP型超聲波儀（上海科導(dǎo)）;AG285型電子天平（梅特勒-托利多）。

1.1.2 試藥 三批竹節(jié)參由云南白藥集團(tuán)有限公司提供;對(duì)照品人參皂苷 Rg1（批號(hào)：110703-201832，純度 92.4%）、人參皂苷 Re（批號(hào)：110754-201827，純度93.4%）、人參皂苷 Ro（批號(hào)：111903-201604，純度99.9%）、竹節(jié)參皂苷Ⅳa批號(hào)：111861-201001，純度81.2%）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供;所用流動(dòng)相乙腈，磷酸為色譜純，處理樣品的甲醇為分析純，水為超純水。

1.2 方法與結(jié)果

1.2.2 溶液的制備

1.2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL中分別含人參皂苷Rg1 1.7531 mg，人參皂苷Re 1.7541 mg，人參皂苷Ro 1.639 mg，竹節(jié)參皂苷Ⅳa1.6581 mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。

1.2.2.2 供試品溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下的本品內(nèi)容物，混勻，過(guò)二號(hào)篩，取0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加60%乙醇溶液25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率25 kHz）40 min，放冷，再稱定重量，以60%乙醇溶液補(bǔ)足減失重量，搖勻，0.45 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Waters Symmetry C18 柱（5 μm，4.6×250 mm）;流動(dòng)相：以乙腈-0.2%磷酸溶液進(jìn)行梯度洗脫，如下表;流速：1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：203nm;進(jìn)樣量：10 μL;柱溫在沒(méi)有特殊說(shuō)明的情況下均為25℃，在該色譜條件下，供試品、對(duì)照品分離較好，與其他雜質(zhì)峰均能達(dá)到基線分離。

1.2.2 測(cè)定法 精密吸取上述溶液10 μL，注入液相色譜儀測(cè)定峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算，即得。

1.3 分析方法學(xué)考察

1.3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 按供試品溶液制備方法制備供試品溶液按上述色譜條件分別進(jìn)樣對(duì)照品、供試品各10 μL。結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖譜可以看出供試品溶液色譜中與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)的位置上有相同的色譜峰出現(xiàn)，表明竹節(jié)參中其他成分對(duì)竹節(jié)參中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa含量的的含量測(cè)定無(wú)干擾。

（1-人參皂苷Rg1，2-人參皂苷Re，3-人參皂苷Ro，4-竹節(jié)參皂苷Ⅳa）1.3.2 線性關(guān)系考察 分別精密稱取人參皂苷 Rg1（批號(hào)：110703-201832，純度 92.4%）16.20mg，人參皂苷 Re（批號(hào)：110754-201827，純度93.4%）16.38 mg，人參皂苷 Ro（批號(hào)：111903-201604，純度99.9%）16.37 mg，竹節(jié)參皂苷Ⅳa（批號(hào)：111861-201001，純度81.2%）13.46mg置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得對(duì)照品儲(chǔ)備液（其中人參皂苷Rg11.7531 mg/mL、人參皂苷Re1.7541 mg/mL、人參皂苷Ro1.639 mg/mL、竹節(jié)參皂苷Ⅳa1.6581mg/mL），精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，逐級(jí)稀釋，按2.2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 μL，記錄峰面積，測(cè)得結(jié)果見(jiàn)表2。以含量（X）對(duì)峰面積（Y）進(jìn)行線性回歸，得人參皂苷 Rg1回歸方程：Y=3654124.82X+4367.50，相關(guān)系數(shù)r=1，Re回歸方程：Y=2859651X+4135.96，相關(guān)系數(shù)r=1，Ro回歸方程：Y=5816517.24X+1091.14，相關(guān)系數(shù)r=1，竹節(jié)參皂苷Ⅳa回歸方程：Y=6867147.66X+4204.46，相關(guān)系數(shù)r=1。

結(jié)果表明，在上述色譜條件下，人參皂苷Rg1在0.01753ug-1.7531ug（r=1）范圍內(nèi)，人參皂苷Re在0.01754ug-1.7541ug（r=1）范圍內(nèi)，人參皂苷Ro在0.0248751ug-0.99486ug（r=1）范圍內(nèi)，竹節(jié)參皂苷Ⅳa在0.04917ug-4.917ug（r=1）范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系。

1.3.3 準(zhǔn)確度試驗(yàn)（加樣回收試驗(yàn)）

1.3.3.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取人參皂苷 Rg1（批號(hào)：110703-201832，純度 92.4%）、人參皂苷 Re（批號(hào)：110754-201827，純度93.4%）、人參皂苷 Ro（批號(hào)：111903-201604，純度99.9%）、竹節(jié)參皂苷Ⅳa批號(hào)：111861-201001，純度81.2%）適量，至10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得濃度為人參皂苷 Rg11.7531 mg/mL，人參皂苷Re1.7541 mg/mL，人參皂苷Ro1.639 mg/mL，竹節(jié)參皂Iva1.6581 mg/mL的對(duì)照品混合溶液，備用。

1.3.3.2 加樣回收方法 精密稱取9份供試品（批號(hào)：云南竹節(jié)參，已測(cè)人參皂苷 Rg1含量為0.295%，人參皂苷 Re含量為0.423%，人參皂苷 Ro含量為3.067%，竹節(jié)參皂苷Ⅳa含量為0.303%。每份約0.05 g，分別以50%、100%、150%加入上述對(duì)照品溶液，然后按供試品溶液處理方法同法處理，將處理好的溶液按含量測(cè)定方法同法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。人參皂苷Rg1回收率為91.94%～98.11%，人參皂苷Re回收率為91.66%～99.23%，竹節(jié)參皂苷Ⅳa回收率為90.29%～98.83%（要求均為90%～108%），人參皂苷Ro回收率為95.11%～101.47%（要求為92%～105%），滿足加樣回收率的要求，說(shuō)明方法準(zhǔn)確度良好。

1.3.4 精密度試驗(yàn)

1.3.4.1 儀器精密度 取配制好的混合對(duì)照品溶液（人參皂苷Rg1 0.01753 mg/mL、人參皂苷Re 0.01754 mg/mL，人參皂苷Ro 0.04917 mg/mL，竹節(jié)參皂苷Ⅳa 0.0258715 mg/mL），按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6針，保留時(shí)間及峰面積的RSD值均小于2%，結(jié)果表明本法具有良好的儀器精密度。

1.3.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)（批號(hào)：云南竹節(jié)參）的樣品6份，按供試品溶液制備方法測(cè)定。計(jì)算得RSD均小于3%，結(jié)果表明本法具有良好的重復(fù)性，見(jiàn)表3。

1.3.5 耐用性試驗(yàn) 在耐用性的考察中對(duì)如下可能變動(dòng)的因素做了考察。

1.3.5.1 柱溫變化 取同一供試品溶液，在不同柱溫下檢測(cè)，可以看到溫度變化在±5℃的情況下，對(duì)檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有影響。

1.3.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取已配制好的供試品溶液按照含量測(cè)定方法依法測(cè)定，分別于0、2、4、8、12h進(jìn)樣，以峰面積計(jì)算，結(jié)果RSD均小于3%，說(shuō)明樣品在12 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

1.3.6 樣品測(cè)定 取3批樣品按上述供試品制備方法制備，分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中鹽酸麻黃堿及鹽酸偽麻黃堿的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

2 試驗(yàn)討論

2.1 樣品前處理方法的選擇 提取溶劑的選擇本試驗(yàn)參照2015版《中國(guó)藥典》三七項(xiàng)、珠子參項(xiàng)及文獻(xiàn)，分別考察了采用甲醇、乙醇、60%乙醇直接提取的方法，精密稱定本品0.1 g，置錐形瓶中，分別精密加甲醇25 mL、乙醇25 mL、60%乙醇25 mL，稱定重量，超聲40 min，放冷后加甲醇、乙醇、60%乙醇補(bǔ)重，搖勻，用0.45μm濾膜濾過(guò)。取上述供試液10 μL進(jìn)樣，計(jì)算含量，結(jié)果表明60%乙醇提取較為完全，所以確定提取溶劑為60%乙醇。

提取方法的選擇：考察了超聲，回流二種方法，結(jié)果表明超聲，回流都能有效提取完全，但考慮操作的簡(jiǎn)便以及試驗(yàn)誤差，故確定超聲提取法為提取方法。

提取時(shí)間的選擇：精密稱定本品0.1 g，置錐形瓶中，精密加60%乙醇25 mL，稱定重量，分別超聲提取20 min，40 min，60 min，放冷后加60%乙醇補(bǔ)重，搖勻，用0.45μm濾膜濾過(guò)。取上述供試液10 μL進(jìn)樣，計(jì)算含量，結(jié)果表明超聲40 min已提取較為完全，所以確定提取時(shí)間為40 min。

2.2 試驗(yàn)小結(jié) 本試驗(yàn)建立了高效液相色譜同時(shí)測(cè)定竹節(jié)參中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa的方法。從含量測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果可以看出該方法的專屬性、重復(fù)性、中間精密度、儀器精密度、線性、加樣回收率、范圍試驗(yàn)等均符合高效液相色譜法對(duì)含量測(cè)定方法的要求，可以用于竹節(jié)參皂苷的含量測(cè)定，為今后質(zhì)量控制提供了參考。

試驗(yàn)對(duì)三批不同地區(qū)的竹節(jié)參進(jìn)行了測(cè)定。從試驗(yàn)結(jié)果看，人參皂苷Ro是竹節(jié)參皂苷的主要成分，其余人參皂苷Rg1、Re、竹節(jié)參皂苷Ⅳa等皂苷所占比例均不高。云南、湖北、四川地區(qū)竹節(jié)參中皂苷比例相似，不同地區(qū)間的含量有所差別，但是否與地區(qū)差異相關(guān)，還需要進(jìn)一步對(duì)多批樣品進(jìn)行考察。另外，試驗(yàn)前期也摸索了人參皂苷Rb1的分布情況，但含量較低，故未列入考察。經(jīng)過(guò)文獻(xiàn)查閱，人參皂苷Ro與竹節(jié)參皂苷Ⅳa之間的未知峰可能為竹節(jié)參皂苷Ⅳ，但因未找到對(duì)照品，故本次也未列入考察，可以考慮在下一步試驗(yàn)中進(jìn)行研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]中國(guó)藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000.附錄?VID，38.

[2]陳曦，張知貴.竹節(jié)參研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)信息，2015，5（17）：350.

[3]頓耀艷，袁丁.竹節(jié)參化學(xué)成分的研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，17（10）：1909-1912.

[4]李春艷，張杰，李勁平，等.竹節(jié)參化學(xué)成分與藥理活性研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥導(dǎo)報(bào)，2012，18（4）：68-71.

[5]陳永波，饒文斌，沈艷芬，等.竹節(jié)參中氨基酸和皂苷特征組分的分析鑒別[J].色譜，2003，21（5）：248-250.

[6]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典?I 部[S].北京.中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015.

[7]劉海華，林先明，艾倫強(qiáng)，等.竹節(jié)參種質(zhì)資源現(xiàn)狀及匱乏原因分析[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2014（17）：118-119，121.

[8]左袁，袁丁.竹節(jié)參化學(xué)成分和藥理活性研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2015，16（9）：838-839.

[9]林先明，劉海華，郭杰，等，竹節(jié)參生物學(xué)特性研究[J].中國(guó)野生植物資源，2007，26（1）：5-8.

[10]尹文仲，童學(xué)飛，陳科力.不同海拔條件下竹節(jié)參中人參皂苷含量的比較[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2006，26（2）：12-14.

（收稿日期：2019-10-08）