中藥指紋圖譜質控方法研究進展

趙娟 謝世靜 趙興華 郭明 曹長紅 陳俊榮

摘要：中藥的現代化、國際化是中藥發(fā)展的艱巨任務和必然趨勢。與現代分析技術相結合的中藥指紋圖譜，用能體現中藥藥效物質基礎的化學物質群來綜合評價中藥質量，符合中醫(yī)藥理論，是國內外認可的中藥質量控制的有效手段。通過詳細查閱國內外學者在中藥指紋圖譜方面的研究工作，依據分析技術和研究內容的不同，筆者對研究頻率較高的中藥化學和生物指紋圖譜質控方法的概念、特點、研究進展及其數據分析方法進行了概述，以期為中藥指紋圖譜質控方法的進一步研究提供參考。

關鍵詞：中藥化學指紋圖譜;中藥生物指紋圖譜;質量控制;數據分析

中圖分類號：R927.1 ??文獻標志碼：A ??文章編號：1007-2349（2020）01-0082-05

1 中藥指紋圖譜質控方法的提出

中藥大多源于自然界的生物有機體，傳統中藥外觀性狀鑒別法具有較大的主觀性，而中藥內在化學組成才是決定其質量與藥效的根本。鑒于中藥組成的多樣性和辨證施治的治療方案，檢測任何一種活性成分均不能代表其整體藥效，中藥指紋圖譜能全面、定量地反映中藥所包含的化學信息，是中藥質量控制的有效手段。2000年國家藥監(jiān)局選擇研究難度相對較低的中藥注射劑試推中藥指紋圖譜質控方法，將中藥指紋圖譜定義為：中藥材經適當處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標示該中藥材特性的共有峰的圖譜[1]。并在樣品制備、測定方法、及指紋圖譜技術參數等方面提出了建立指紋圖譜的一些基本原則，規(guī)范了中藥指紋圖譜的研究，開啟了中藥指紋圖譜質量控制的新時代。

目前，中藥指紋圖譜已成為國內外公認的中藥質量控制的重要方法，并被2010年版和2015年版中國藥典一部收錄。本研究通過查閱國內外文獻，對研究工作較集中的中藥化學和生物指紋圖譜質控方法的概念、特點、研究進展及其數據處理進行總結。

2 中藥化學指紋圖譜質控方法研究進展

中藥化學指紋圖譜主要研究中藥及其成方制劑化學成分的種類與數量，依據常用分析手段的不同可分為光譜指紋圖譜法和色譜指紋圖譜法。

2.1 光譜指紋圖譜法

2.1.1 紫外光譜指紋圖譜 紫外光譜反映的是含有不飽和鍵的分子吸收紫外光，價電子從低能級躍遷到高能級所產生的吸收光譜，主要反映分子中不飽和基團的性質。中藥的藥效成分多含有不飽和基團，具有良好的紫外吸收。當中藥含有相同成分時，其紫外光譜指紋圖譜也應相似，可用于中藥質量評價。李和光[2]建立了寒熱屬性確定的51味中藥的紫外光譜指紋圖譜，歸納出判別寒熱屬性中藥紫外光譜吸收峰的規(guī)律，采用多元統計法建立寒性、熱性中藥判別模型，探索了能代表中藥寒熱藥性物質基礎的紫外光譜指紋圖譜數字化表征體系，為寒性、熱性中藥的下一步研究提供參考。

2.1.2 （近）紅外光譜指紋圖譜 （近）紅外光譜是分子選擇性吸收某些波長的紅外線，引起分子振、轉能級躍遷而產生的吸收光譜。（近）紅外光譜可提供物質組成和結構特征方面的豐富信息，尤其適用于有機分子的結構分析。紅外光譜尤其是近紅外光譜具有無損、快速、在線、全面的分析優(yōu)點，近年來被廣泛應用于中藥質量評價。孫國祥等[3]在全面總結現有研究的基礎上，建立了中藥-紅外光譜指紋圖譜-專家系統網格的知識庫系統、試驗方法推薦系統、試驗方法優(yōu)化系統和評價系統，并成功應用于10個產地中藥材射干的判別分析。

2.1.3 熒光光譜指紋圖譜 基態(tài)分子吸收能量后躍遷到激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)分子以輻射躍遷的方式將其能量釋放返回基態(tài)時產生熒光，熒光光譜同樣能反映中藥分子中不飽和基團的性質。熒光光譜法具有檢測限低、專屬性好、簡單快速等優(yōu)點。不同中藥因所含熒光物質的分子結構或含量的差異，其熒光光譜具有指紋特征，可用于中藥質量評價。史訓立[4]掃描了200多種常見標準藥材的三維熒光光譜指紋圖譜，構建了中藥三維熒光指紋圖譜數據庫，成功應用于中藥材的質量評價。

2.2 色譜指紋圖譜法

2.2.1 薄層色譜指紋圖譜法 薄層色譜系將適宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或鋁基片上，成一均勻薄層，利用各組分對同一吸附劑吸附能力不同，通過連續(xù)的吸附、解吸附過程達到分離目的，以比移值為分析指標。薄層色譜具有成本低，對樣品預處理要求低、快速、高效等優(yōu)點，非常適合藥物的基層日常分析與現場檢驗。1990年版中國藥典引入了對照藥材的薄層色譜鑒別，獲得的薄層圖譜增加了測定結果分析的客觀性，具有早期的指紋圖譜鑒別意味。謝培山課題組完成了三種人參類藥材[5]、黃連[6]、高良姜[7]中黃酮類成分，柴胡屬藥材皂苷類成分[8]的薄層色譜指紋圖譜研究，可很好地控制中藥材的質量。目前，薄層色譜技術仍是中國藥典里中藥材鑒別的有力工具，并應用于輔助建立多種中藥及其制劑的質量標準研究[9]。

2.2.2 氣相色譜指紋圖譜法 氣相色譜是采用氣體作為流動相的色譜法。利用待分離組分在氣相和固定相間的分配差異達到分離目的，以保留時間為定性指標，峰高或峰面積為定量指標。氣相色譜法主要適用于含揮發(fā)性成分較多且對熱穩(wěn)定的中藥和其成方制劑的質控研究。戴靜波等[10]采用氣相色譜-質譜聯用技術分別建立了10批荊芥油的指紋圖譜，采用聚類分析法進行相似度比較，結果表明氣相色譜指紋圖譜特征明顯，方法準確可靠，可用于中藥質量控制。

2.2.3 高效液相色譜指紋圖譜法 高效液相色譜是20世紀六十年代后期借鑒氣相色譜理論，在經典液相色譜法的構造中引入高壓輸液系統，采用小顆粒填充材料發(fā)展起來的，同樣以保留時間和峰高/峰面積作為定性和定量依據。高效液相色譜可與多種檢測器聯用，例如紫外檢測器、熒光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、二極管陣列檢測器等，分析范圍廣，適用于中藥復雜組分的分析。此外，由于高效液相色譜檢測器保留了被分離物質的完整性，可作為前期分離、提純的手段，進一步與質譜儀串聯，為中藥質量分析提供更加準確、可靠的信息。分離效能高、分析范圍廣、分析儀器自動化、靈敏度高、重現性好等優(yōu)點，使高效液相色譜成為構建中藥指紋圖譜的首選方法。孫露露等[11]建立了12批泰山蟲草藥材高效液相色譜指紋圖譜，并比較不同批次抗腫瘤生理活性差異，發(fā)現了各共有指紋峰與藥效的關聯度，并確定核苷類成分是泰山蟲草發(fā)揮抗腫瘤活性的主要成分，可用于泰山蟲草品質的綜合研究。

2.2.4 超高效液相色譜指紋圖譜 超高效液相色譜是借助于高效液相色譜的理論及原理，進一步縮小了固定相填料粒度且提高了輸液壓力，是近年來發(fā)展起來的新技術，具有高分析通量、高靈敏度、高自動化等特點，尤其適合于中藥復雜組分的研究。2010年版中國藥典已經收載了復方丹參滴丸超高效液相色譜指紋圖譜鑒別法。范旭航等[12]構建了快速分析牡丹皮藥材的超高效液相色譜特征指紋圖譜共有模式，15批次藥材的指紋譜圖重合度較好，表明批次間牡丹皮藥材質量較為穩(wěn)定，可用于快速評價牡丹皮藥材質量。

2.2.5 毛細管電泳指紋圖譜法 毛細管電泳法是在高壓直流電場驅動下，根據待分離組分淌度和分配行為上的差異，在毛細管分離通道上實現分離的電泳分離技術。具有分析速度快、分析成本低等優(yōu)點，適用于中藥中無機離子到帶電生物大分子的分析研究。許麗瑩等[13]應用區(qū)帶毛細管電泳法建立了冠心寧注射液對照指紋圖譜，在最佳電泳條件下，應用毛細管電泳一測多評技術在35min內實現了8批冠心寧注射液中7種主要有效成分的含量測定，此方法可用于全面評價冠心寧注射液的質量，可為其他中藥注射劑的質量評價提供參考。

3 中藥生物指紋圖譜質控方法研究進展

中藥化學指紋圖譜能提供中藥化學組成方面的豐富信息，但存在指紋圖譜與藥效信息脫節(jié)問題，中藥生物指紋圖譜有望解決這一難題。中藥生物指紋圖譜致力于中藥生物遺傳特性和藥理學研究，旨在闡明中藥的藥效作用機制及毒理作用機制，主要包括中藥基因組學、中藥蛋白質組學和中藥代謝組學。

3.1 中藥基因組學 陳士林研究員提出的“本草基因組學”是中藥基因組學的前沿研究，它從基因組水平探索中藥和其藥理作用，采用組學技術研究中藥基原物種的遺傳信息及其調控網絡，尋找中藥防治人類疾病的分子機制。陳士林課題組首創(chuàng)基于ITS2的中草藥DNA條形碼鑒定技術：在全部正品藥材樣品中尋找相同的一段DNA片段進行測序，建立該藥材的對照品數據庫，可用于未知樣品或摻雜品的鑒別，具有基因指紋圖譜鑒別意義[14]。該DNA條形碼鑒定技術已被2010年版和2015年版中國藥典DNA條形碼分子鑒定法指導原則收錄，并編寫專著《中國藥典中藥材DNA條形碼標準序列》，力求從基因水平上破解中草藥品種真?zhèn)舞b別的難題[14～15]。

3.2 中藥蛋白質組學 中藥蛋白質組學是在分子水平上研究中藥藥效物質基礎和藥理作用的相關性，可用于中藥質量控制及中藥新藥研究。主要包括兩個方面的研究：一是通過中藥干預前后蛋白質表達差異譜的研究，尋找中藥的可能靶點相關蛋白質，另一方面是通過不同中草藥及其不同組分蛋白質表達差異的研究，尋找中藥藥用功能的機制。曹彬[16]構建了慢性心力衰竭的大鼠模型，造模成功后隨機分成4組給予不同治療，研究不同治療方案下各組織的病理改變，利用蛋白組學技術篩選藥物干預前后慢性心衰大鼠肝臟組織的表達差異蛋白。實驗結果表明四君子湯能明顯延緩不良條件下肝臟組織的病理變化，提高肝臟線粒體相關蛋白質的合成，驗證并深化了中醫(yī)理論，為進一步研究提供了方向。

3.3 中藥代謝組學 代謝組學研究的是生物體系受到內在和/或外在因素刺激后引發(fā)的內源性代謝物質改變的學科，是繼基因組學和蛋白質組學之后發(fā)展起來的系統生物學的重要研究領域。中藥代謝組學指紋圖譜研究不僅可以反映中藥材化學組成方面的差異，更重要的是可以通過對內源性代謝物的分析，客觀反映藥效學或生物效應的差異。秦雪梅課題組在中藥的代謝組學技術質量評價方面進行了很多前瞻性的研究[17]：分析基原對柴胡、黃芪藥材質量的影響，不同產地、采收期款冬花藥材質量的差異比較，遠志藥材良種定向選育，炮制手段對柴胡、白芍、醋細辛質量的影響，研究結果證實代謝組學技術可作為現有藥材質量評價手段的有力補充。

4 中藥指紋圖譜數據分析方法研究進展

中藥指紋圖譜數據量大，人工辨別耗時且不客觀。為實現復雜指紋圖譜數據的科學解析，專家們提出了多種中藥指紋圖譜數據處理方法。

4.1 化學模式識別 化學計量學借助多學科的理論和方法優(yōu)化化學量測過程，通過分析實驗獲得的包含大量信息的數據，最大限度的提取有效化學信息[18]。化學模式識別是化學計量學的重要組成部分，在中藥指紋圖譜數據分析中應用較多的化學模式識別方法包括聚類分析法、主成分分析法和偏最小二乘法。

4.1.1 聚類分析法 利用統計學方法根據未知樣本的變量特征，以相似度進行歸類，主要的聚類指標是相關系數和距離[18]。由于中藥本身所具有的規(guī)范性較差的特點，其質量易受道地性、季節(jié)氣候、采收期、加工方式等多種因素的影響，聚類分析法較早應用于中醫(yī)藥研究。冀艷花等[19]建立了15批次白鮮皮藥材的高效液相色譜指紋圖譜，采用聚類分析法可將指紋圖譜分為3類，明確了不同種類間差異較大的化學成分，可用于白鮮皮藥材質量評價。

4.1.2 主成分分析法 利用方差最大原則和降維的思想，將多個變量轉化為少數幾個互不相關的綜合變量，即主成分，每個主成分都能夠反映原始變量的大部分信息，且所含信息互不重疊[18]。主成分分析法將復雜因素歸結為幾個主成分，可以實現數據降維，簡化問題，在中醫(yī)藥研究中廣泛應用。靳怡然等[20]建立了不同產地18批冬凌草藥材的高效液相色譜指紋圖譜，采用主成分分析法和相似度分析法進行指紋圖譜數據分析，兩種分析方法結果準確一致，可用于冬凌草藥材質量評價。

4.1.3 偏最小二乘法 以中藥指紋圖譜檢測為例，偏最小二乘法分解數據時不僅考慮中藥提取物含量矩陣和響應矩陣，而且在分解含量矩陣的同時考慮響應矩陣以及在分解響應矩陣的同時考慮含量矩陣，從而克服了非線性因素的影響，尤其適用于小樣本多變量的中藥指紋圖數據分析。偏最小二乘法被稱為第二代回歸方法，與傳統相似度計算方法相比，偏最小二乘法得到的結果更加準確，計算速度更快。張昱[21]通過實驗條件和方法學優(yōu)化，建立了牛黃上清片高效液相色譜圖譜，結合偏最小二乘法判別分析和相似度評價，實現了不同廠家、不同批號牛黃上清片樣品的質量研究。同時利用正交偏最小二乘法研究牛黃上清片指紋圖譜歸一化峰面積與其相對體外抗內毒素活性的譜效關系，確定了可能的抗內毒素活性物質。

4.2 中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件 色譜技術是目前建立中藥指紋圖譜的首選方法，為實現對獲得中藥色譜指紋圖譜數據的快速匹配和識別，專家們分別開發(fā)了多種相似度評價軟件[22]。為統一中藥色譜指紋圖譜相似度評價指標，2004年3月由國家藥典委員會牽頭，聯合指紋圖譜主要科研單位組成開發(fā)小組，綜合各版本軟件優(yōu)勢，開發(fā)了《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》研究版（2004A）和檢驗版（2004B）。其中，2004A版本具有生成對照譜圖的功能多應用于科學研究，2004B版本沒有生成對照譜圖的功能多應用于檢驗工作。此相似度評價系統的推廣促進了指紋圖譜標準化研究的進程。

4.3 中藥指紋圖譜數據庫 中藥指紋圖譜的研究工作需要長期大量資料和經驗的積累，為更好的實現對已有研究資料的存儲和共享，專家們采用多種分析技術對中藥指紋圖譜數據庫進行了研究。何淑華等[23]構建了由150余幅對照中藥材紅外光譜圖組成的紅外光譜數據庫，可用于中藥材真?zhèn)蔚目焖勹b別。黃新宇[24]使用計算機算法研發(fā)了紫外光譜數據庫-UVDB2，利用常見化合物的真實紫外吸收數據構建了紫外光譜數據庫-UV1，實現了在UVDB2中尋找計算光譜，在UV1中匹配、預測化合物不飽和結構信息等功能。劉訓紅等[25]歸納整理了已發(fā)表藥學期刊或相關專著中3000余幅多種研究方法獲得的中藥指紋圖譜，建立了數據廣泛、檢索方便、維護與更新簡單的中藥指紋圖譜數據庫，更利于數據資源共享和日常中藥質量評價。孫國祥等[26]采用多種開發(fā)環(huán)境和工具，構建了中藥指紋圖譜在線專家系統數據庫，涵蓋了中藥材及其制劑常見分析技術指紋圖譜及其他與中藥藥效、實驗條件、管理等等相關的大量信息，具有強大的查詢功能，是目前比較先進的國內中藥指紋圖譜數據庫。

5 展望

中藥質量的安全、穩(wěn)定、可控是中藥可持續(xù)發(fā)展和國際化的關鍵。經過廣大學者近20年的研究，中藥指紋圖譜質控方法從研究思路、分析技術、數據處理等方面都取得了非常大的進展。以后的研究中，應更加注重中藥指紋圖譜化學信息與生物活性的結合，加強中藥實際藥效成分指紋圖譜的生物等效性研究，以便更好地控制中藥質量，闡明中藥藥理機制。

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（收稿日期：2019-10-28）