運脾柔肝方對便秘型腸易激綜合征大鼠胃動素、生長抑素影響的實驗研究

劉夢茹 邱仁靜 田耀洲

[摘要] 目的 探討運脾柔肝方對便秘型腸易激綜合征（IBS-C）大鼠血清及結腸組織中胃動素（MOT）、生長抑素（SS）表達的影響。 方法 選取12只Wistar大鼠為正常組，其余60只大鼠采用冰水灌胃法建立IBS-C模型。建模成功后，將大鼠按照隨機數字表法分為IBS-C模型組，莫沙必利組和中藥低、中、高劑量組，每組12只。正常組和IBS-C模型組給予等容積的蒸餾水，莫沙必利組給予1.35 mg/（kg·d）混懸液灌胃，中藥低、中、高劑量組分別給予12.2、24.4、48.8 g/（kg·d）藥劑灌胃。采用墨汁推進實驗測定腸道推進率，酶聯免疫吸附測定（ELISA）法和免疫組化法測定大鼠血清和結腸組織中MOT、SS的表達水平。 結果 造模后，與正常組比較，IBS-C模型組糞便顆粒數減少（P < 0.05）。給藥后，與正常組比較，IBS-C模型組糞便顆粒數減少（P < 0.05）;與IBS-C模型組比較，莫沙必利組及中藥低、中、高劑量組糞便顆粒數增多（P < 0.05或P < 0.01）。造模后，與正常組比較，IBS-C模型組糞便含水量減少（P < 0.01）。給藥后，與正常組比較，IBS-C模型組糞便含水量減少（P < 0.05）;與IBS-C模型組比較，中藥低、中、高劑量組糞便含水量增多（P < 0.01）。與正常組比較，IBS-C模型組腸道推進率明顯降低（P < 0.05）;與IBS-C模型組比較，莫沙必利組及中藥低、中、高劑量組腸道推進率顯著升高（P < 0.05或P < 0.01）。與正常組比較，IBS-C模型組血清MOT含量降低，血清SS含量升高（P < 0.05）;與IBS-C模型組比較，莫沙必利組和中藥中、高劑量組血清MOT含量升高，血清SS含量降低（P < 0.05）。與正常組比較，IBS-C模型組結腸組織MOT的MOD值明顯降低（P < 0.05），SS的MOD值明顯升高（P < 0.05）;與IBS-C模型組比較，莫沙必利組和中藥中、高劑量組MOT的MOD值明顯升高（P < 0.05），SS的MOD值明顯降低（P < 0.05）。 結論 運脾柔肝方可能是通過調控大鼠血清和結腸組織中MOT、SS的表達，從而調節胃腸道激素，并改善腸道推進率和排便。

[關鍵詞] 運脾柔肝方;便秘型腸易激綜合征;胃動素;生長抑素

[中圖分類號] R-332? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）03（b）-0004-06

[Abstract] Objective To explore the effect of Yunpi Rougan Recipe on the expression of motilin （MOT） and somatostatin （SS） in serum and colon tissues of rats with constipation type irritable bowel syndrome （IBS-C）. Methods Twelve Wistar rats were selected as normal group， IBS-C model was established by ice water gavage in the other 60 rats. After the successful modeling， the rats were divided into IBS-C model group， Mosapride group and low， medium and high dose of traditional Chinese medicine group according to the random number table method， with 12 rats in each group. Normal group and IBS-C model group were given equal volume distilled water， Mosapride group was given 1.35 mg/（kg·d） suspension， low， medium and high dose of traditional Chinese medicine groups was given 12.2， 24.4， 48.8 g/（kg·d） respectively. The expression of MOT and SS in serum and colon tissue of rats were measured by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） and immunohistochemistry. Results After molding， compared with normal group， the number of fecal particles in IBS-C model group decreased （P < 0.05）. After administration， compared with normal group， the number of fecal particles in IBS-C model group decreased （P < 0.05）; compared with the IBS-C model group， the number of fecal particles in Mosapride group and low， medium and high dose of traditional Chinese medicine groups increased （P < 0.05 or P < 0.01）. After modeling， compared with normal group， the fecal water content of IBS-C model group decreased （P < 0.01）. After administration， compared with normal group， the fecal water content of IBS-C model group decreased （P < 0.05）; compared with IBS-C model group， the fecal water content of low， medium and high dose of traditional Chinese medicine groups increased （P < 0.01）. Compared with normal group， the intestinal propulsion rate of IBS-C model group was significantly decreased （P < 0.05）; compared with IBS-C model group， the intestinal propulsion rate of Mosapride group and low， medium and high dose of traditional Chinese medicine groups was significantly increased （P < 0.05 or P < 0.01）. Compared with normal group， the content of serum MOT in IBS-C model group decreased， and SS increased （P < 0.05）; compared with IBS-C model group， the content of serum MOT in Mosapride group， middle and high dose of traditional Chinese medicine groups increased， and SS decreased （P < 0.05）. Compared with normal group， the MOD value of the colon tissue of IBS-C model group was significantly decreased （P < 0.05）， and the MOD value of SS was significantly increased （P < 0.05）; compared with the IBS-C model group， the MOD value of mot was significantly decreased （P < 0.05）， and the MOD value of SS was significantly decreased （P < 0.05）. Conclusion Yunpi Rougan Recipe may regulate gastrointestinal hormones to improve intestinal propulsion rate and defecation by regulating the expression of MOT and SS in rat serum and colon tissues.

[Key words] Yunpi Rougan Recipe; Constipation type irritable bowel syndrome; Motilin; Somatostatin

便秘型腸易激綜合征（IBS-C）是一種功能紊亂性腸病，主要臨床癥狀表現為排便頻率減少、大便干結硬塊、排便習慣改變等，常伴有反復發作的腹痛、腹脹，往往與排便相關[1]。調查顯示，IBS-C女性患者多于男性，且在女性患者和20～49歲人群中IBS-C的部分癥狀較為顯著，伴隨的焦慮程度與一些胃腸道癥狀有關[2-3]。對比西藥治療，中藥治療更能緩解患者不適癥狀，且復發率較低，所以我國很多醫生選用中藥治療IBS-C[4]。田耀洲教授通過多年的臨床實踐經驗總結出以柔肝運脾為主要大法的方藥——運脾柔肝方，在治療IBS-C中收到較好的臨床療效[5-6]。本實驗采用運脾柔肝方干預IBS-C大鼠模型，觀察其對IBS-C模型大鼠腸道動力與胃動素（MOT）、生長抑素（SS）的影響，并報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年健康清潔級Wistar大鼠80只，雌雄各半，體重（180±20）g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[生產許可證SCXK（滬）2018-0006，實驗動物合格證號：20180006002931]，于空調下架式分籠飼養，環境度（23±3）℃，濕度（55±5）%，標準顆粒飼料喂養。本實驗已通過動物倫理審核，并嚴格按照國家實驗動物福利倫理的相關規定執行。動物倫理受理編號：AEWC-20181023-57。

1.2 實驗藥物

運脾柔肝方由生白術30 g，決明子、萊菔子各15 g，黨參、白蒺藜、當歸、白芍、黃芪、枳實、厚樸各10 g，生甘草6 g組成，藥物由江蘇省中西醫結合醫院中藥房提供。枸櫞酸莫沙必利片（江蘇豪森藥業集團有限公司，批號：181010，5 mg/片）。

1.3 實驗試劑

MOT酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（E-EL-R0639c）、SS ELISA試劑盒（E-EL-R0914c），武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;MOT抗體（ab209790）、SS抗體（ab111912），Abcam公司;蘇木精染液（719054）、伊紅染液（719062），珠海貝索生物技術有限公司;一次性使用真空采血管（1706009），浙江拱東醫療科技有限公司;組織固定液（1809330），江蘇世泰實驗器材有限公司。

1.4 造模與分組方法

將80只大鼠適應性喂養并觀察大鼠精神狀態及糞便質量，1周后選取72只正常者用于實驗。隨機選取12只作為正常組，正常飼養，不灌胃;其余60只采用冰水灌胃造模方法造模[7]，每天上午8：30予0～4℃生理鹽水灌胃，2 mL/只，1次/d，共14 d。造模成功后，將60只IBS-C模型大鼠，采用隨機數字表法分為IBS-C模型組，莫沙必利組，中藥低、中、高劑量組，每組12只。

1.5 干預方法

根據人與動物間等效劑量換算法[8]，運脾柔肝方的給藥劑量分別為：低劑量組給予12.2 g/（kg·d），中劑量組給予24.4 g/（kg·d），高劑量組給予48.8 g/（kg·d）灌胃。莫沙必利組以莫沙必利混懸液1.35 mg/（kg·d）灌胃，正常組和IBS-C模型組給予等容積的蒸餾水灌胃，每天上午8：30灌胃1次，連續灌胃2周。

1.6 觀察指標與檢測方法

1.6.1 一般情況? 觀察大鼠的一般情況，如精神狀態、鼠毛、活動情況、食欲等。

1.6.2 糞便顆粒及糞便含水量測定? 分別記錄大鼠造模后糞便顆粒數、濕糞重量、烘干后糞便重量，給藥結束后糞便顆粒數、濕糞重量、烘干后糞便重量。糞便含水量=（濕糞重量-干糞重量）/干糞重量×100%。

1.6.3 碳墨推進實驗腸道推進率的測定? 大鼠禁食24 h，不禁水，用灌胃針灌活性炭末混懸液灌胃，3 mL/只，30 min后，以10%水合氯醛經腹腔注射進行麻醉。打開腹腔，取出完整腸道，在無牽拉狀態下將腸平鋪在具有對比度的潔凈桌面上，測量所需數據，計算腸道推進率，碳墨推進率（%）=幽門口至碳墨前沿距離/幽門口至直腸末端距離×100%。

1.6.4 蘇木精-伊紅染色（HE染色）觀察大鼠結腸組織病理學? 取大鼠距直腸末端約6 cm處的結腸組織一塊，大小0.5 cm×0.5 cm，生理鹽水沖洗干凈后，放入組織固定液中。將結腸組織從組織固定液內取出，進行脫水、石蠟包埋，石蠟標本連續切片，切片厚度約2 μm，采用HE染色后，應用光學顯微鏡，每張片子隨機取5個視野進行觀察并拍攝，觀察大鼠結腸組織的結構和形態特征。

1.6.5 血清MOT、SS的測定? 給藥結束，禁食24 h后，用10%水合氯醛（3 mL/kg）注射大鼠腹腔，麻醉后，暴露腹腔，取腹主動脈血3 mL于抗凝管中，3500 r/min（離心半徑10 cm）離心15 min，取上清液分別裝入注有標記的離心管內，-80℃凍存備用。將儲存在-80℃的大鼠血清取出，室溫解凍，按照MOT、SS ELISA試劑盒步驟說明書進行操作，繪制標準曲線，計算各組大鼠血清中MOT、SS的表達水平。

1.6.6 結腸組織MOT、SS的測定? 將結腸組織從組織固定液中取出后，進行脫水，石蠟包埋，切片。用免疫組化法進行結腸組織MOT、SS含量的測定，具體操作嚴格按照免疫組化說明書步驟進行。應用Image-Pro Plus 6.0專業圖像分析系統，計算陽性表達的平均吸光度（MOD，MOD=IOD/Area）。

1.7 統計學方法

采用統計軟件SPSS 22.0進行統計分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況比較

正常組和給藥組大鼠的精神狀態良好，行為較為活躍，毛發整齊色澤佳，進食量多，糞便較多，質軟;IBS-C模型組大鼠毛色偏黃且欠光澤，倦怠喜臥，進食量較少，糞便顆粒數較少，質地堅硬，便秘癥狀顯著。

2.2 各組大鼠糞便顆粒數及糞便含水量比較

造模后，與正常組比較，IBS-C模型組糞便顆粒數減少（P < 0.05）。給藥后，與正常組比較，IBS-C模型組糞便顆粒數減少（P < 0.05）;與IBS-C模型組比較，莫沙必利組及中藥低、中、高劑量組糞便顆粒數增多（P < 0.05或P < 0.01）。見表1。造模后，與正常組比較，IBS-C模型組糞便含水量減少（P < 0.01）。給藥后，與正常組比較，IBS-C模型組糞便含水量減少（P < 0.05）;與IBS-C模型組比較，中藥低、中、高劑量組糞便含水量增多（P < 0.01）。見表2。

2.3 各組大鼠腸道推進率比較

與正常組比較，IBS-C模型組腸道推進率明顯降低（P < 0.05）;與IBS-C模型組比較，莫沙必利組及中藥低、中、高劑量組腸道推進率顯著升高（P < 0.05或P < 0.01）。見表3。

2.4 各組大鼠結腸組織病理學結果

IBS-C模型組和中藥低劑量組黏膜病理顯示肌層斷裂明顯，莫沙必利組和中藥中、高劑量組結腸組織結構完整，黏膜層腺體規則排列，無明顯病理性改變，未見明顯炎癥細胞浸潤，與正常組接近。見圖1。

2.5 各組大鼠血清MOT和SS含量比較

與正常組比較，IBS-C模型組血清MOT含量降低，血清SS含量升高（P < 0.05）;與IBS-C模型組比較，莫沙必利組和中藥中、高劑量組血清MOT含量升高，血清SS含量降低（P < 0.05）。見表4。

2.6 各組大鼠結腸組織MOT和SS免疫組化結果

顯微鏡下，結腸MOT蛋白表達主要分布在黏膜層，呈現褐色顆粒為陽性表達。與正常組比較，IBS-C模型組結腸組織MOT陽性顆粒數明顯減少，密度較低;與IBS-C模型組比較，給藥組MOT陽性表達顆粒增多，其中莫沙必利組和中藥中、高劑量組MOT表達顆粒數明顯增多，密度較高，著色較深，中藥低劑量組陽性顆粒表達較少，密度較低，與IBS-C模型組較為接近。見圖2（封四）。結腸SS蛋白表達主要分布于黏膜層，陽性表達為褐色顆粒。與正常組比較，IBS-C模型組SS陽性顆粒數明顯增多，密度較高，著色較深;與IBS-C模型組比較，給藥組SS陽性表達顆粒均減少，密度降低，其中莫沙必利組最為顯著，中藥高劑量組次之。見圖3（封四）。與正常組比較，IBS-C模型組結腸組織MOT的MOD值明顯降低（P < 0.05），SS的MOD值明顯升高（P < 0.05）;與IBS-C模型組比較，莫沙必利組和中藥中、高劑量組MOT的MOD值明顯升高（P < 0.05），SS的MOD值明顯降低（P < 0.05）。見表5。

3 討論

《腸易激綜合征中醫診療專家共識意見2017》[9]指出IBS-C主要病機為脾胃虛弱和/或肝失疏泄，肝郁脾虛是導致IBS發生的重要病機。田耀洲教授多年來在臨床實踐中總結出IBS-C的主要病機為肝脾不和，對IBS-C的治療與《腸易激綜合征中醫診療專家共識意見2017》[9]不謀而合。田教授認為本病以脾虛為本，肝郁為標，肝與脾胃同居中焦，共同影響中焦氣機的升降出入;肝郁不暢，乘侮脾土，則脾胃升降失司，大腸傳化功能失常，留滯腸道，以致便秘。若肝木得之疏泄，脾胃得以補養，則氣機方可升降暢達，故以健脾柔肝、理氣通便為治療大法創建運脾柔肝方。方中以生白術、白蒺藜為君藥，潤腸通便，疏肝解郁;黨參、黃芪、白芍、當歸共為臣藥，益氣健脾，緩急止痛，潤腸通便;枳實、厚樸、萊菔子、決明子為佐藥，破氣消積導滯，下氣消食，潤腸通便;甘草為使藥，緩急止痛，調和諸藥。現代藥理及實驗研究表明，大量生白術可以修復Cajal間質細胞，促進腸道收縮和蠕動[10];大量生白術與枳實配伍能上調5-HT3R、5-HT4R的表達而促進腸道動力[11];當歸可改善結腸黏膜萎縮，增加結腸黏液分泌，具有軟化糞便、促進糞便排出的作用[12];決明子能夠刺激腸黏膜改善結腸運動功能，減少結腸內水分的吸收[13];黃芪多糖具有腸保護的作用[14];黨參和萊菔子提取物具有增加排便次數、縮短排便時間、促進腸道推進的作用[15-16]。

IBS-C的病因繁多，發病機制尚未完全闡明。目前普遍認為其發病可能與胃腸運動功能紊亂、微生物群的改變、內臟高敏感性、炎癥等有關[17-19]。而在調節胃腸道運動功能中胃腸激素也發揮著重要作用。本實驗發現，造模后，正常組與其他各組糞便顆粒數、糞便含水量比較均有顯著性差異，IBS-C模型組腸道推進率與正常組也具有顯著性差異，提示本實驗成功復制了IBS-C大鼠模型。運脾柔肝方干預后，大鼠排便質量得到改善，糞便顆粒數和糞便含水量顯著升高，腸道推進率明顯改善，提示運脾柔肝方可改善大鼠的腸道動力。MOT在胃腸黏膜中的主要生理功能是增加消化道的收縮和蠕動，促進胃蛋白酶的分泌。研究發現，MOT的含量高低影響患者的癥狀表現，MOT含量升高，表現為腹瀉;含量降低，則表現為便秘[20]。MOT表達水平升高可刺激胃腸道進行機械運動，還可影響SS的釋放[21]。人體內的大部分SS存在于消化道，位于腸道和胰腺，約占75%[22-23]。SS具有抑制腸道蠕動、減少腸液和一些多肽類激素分泌、降低腸道血流量的作用。本實驗結果中顯示，相比IBS-C模型組，莫沙必利組和中藥組MOT表達升高，SS表達降低，其中莫沙必利組與中藥高劑量組MOT、SS表達水平相當。然而在癥狀的改善上，中藥高劑量組優于莫沙必利組，其機制還需進一步探究。

綜上所述，MOT、SS與IBS-C的發生和發展有著重要聯系，運脾柔肝方對于改善IBS-C癥狀療效確切。其作用機制之一可能是增強MOT表達并抑制SS表達，調節機體內胃腸激素水平，從而改善排便和促進腸道蠕動，改善IBS-C癥狀，對于其他作用機制仍需進一步研究。

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（收稿日期：2019-10-23? 本文編輯：李亞聰）